Патент на изобретение №2360251

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕРОЯТНОСТИ ИНФИЦИРОВАНИЯ HELICOBACTER PYLORI

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии, и касается способа определения вероятности инфицирования Helicobacter pylori. Способ заключается в выявлении антигена-маркера Helicobacter pylori в биологических субстратах, таких как копрофильтрат, слюна, сыворотка крови, реакцией коагглютинации (РКА), в определении индекса вероятности инфицирования (ИВИ Нр) по формуле, и при значениях ИВИ Нр от 1 до 9% вероятность инфицирования определяют как сомнительную, от 10 до 19% – низкую, от 20 до 39% – среднюю, от 40 до 100% высокую. Использование способа позволяет прогнозировать заболевания верхних отделов желудочно-кишечного тракта, а также в научных исследованиях в области хронобиологии, хрономедицины и гелиобиологии. 3 табл., 1 ил.

Назначение: медицина. Может быть использован в области гастроэнтерологии для оптимизации диагностики и прогноза заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с Helicobacter pylori, а также в научных исследованиях в области хронобиологии, хрономедицины и гелиобиологии.

Сущность изобретения: определяют наличие специфических антигенов (O-антигена, высокомолекулярных белков (ВМБ) и вакуолизирующего цитотоксина (VacA) Helicobacter pylori (Hp) в биологических пробах (копрофильтрат, слюна, циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) сыворотки крови) исследуемого пациента реакцией коагтлютинации (РКА). Вероятность инфицирования и жизнедеятельность Hp в организме (способность к размножению и токсигенность) оценивается с учетом следующих дополнительных признаков и групп признаков: сезонные изменения циркуляции Hp в организме, возраст пациента, вид исследуемого материала, солнечная активность в течение 11-летнего солнечного цикла, наличие клинических симптомов заболевания, с использованием предлагаемой Таблицы и Формулы. Вероятность Hp-инфицирования (ВИ) оценивается по Индексу вероятности инфицирования (ИВИ) выраженному в %. При индексе, равном 1%-9%, Hp-инфицирование считается сомнительным, 10-19%- низким, 20-39% – средним, 40-100% – высоким.

Недавно открытый Hp, как установлено к настоящему времени, является широко распространенным микроорганизмом. Он обнаруживается в 60-100% случаев населения различных регионов Земли. В России инфицированность населения составляет 70-80%. Hp обнаруживается в организме человека с раннего детского возраста и персистирует в течение всей жизни. В ряде случаев Hp оказывается основным патогеническим фактором заболеваний верхних отделов ЖКТ – хронического гастрита, неязвенной диспепсии, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, рака желудка. Решением ВОЗ Нр отнесен к 1 классу (безусловных) факторов риска развития рака желудка. Ведущие инфекционисты относят хеликобактериоз к так называемым «медленным инфекциям» (6.7).

Поскольку большинство исследователей приходит к заключению, что Нр является важнейшим фактором этиологии и патогенеза вышеназванных заболеваний их диагностика представляет собой прежде всего выявление Нр, и именно обнаружение этого микроорганизма у больного с диспептическими жалобами фактически предопределяет дальнейшие лечебные мероприятия и оценку их эффективности.

Известны инвазивные (культуральный, гистологический, бактериоскопический, быстрый уреазный тест) и неинвазивные (серологический, уреазный дыхательный, латекс-агглютинация и др.) методы выявления Нр в организме пациентов. Однако большинство из них трудоемки, требуют дорогостоящего специального оборудования, в силу чего не могут быть использованы для многократных исследований и тем более длительного мониторинга Нр-инфекций.

Разработанные нами неинвазивные иммунологические методы определения антигенов – маркеров Нр (O-антигена, ВМБ и VacA) в биологических субстратах (копрофильтрат, слюна, ЦИК сыворотки крови) реакцией коагглютинации (РКА) (1, 2, 4, 5) отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, простотой постановки, безвредностью для пациента, высокой экономичностью и вместе с тем позволяют проводить длительное мониторирование, в том числе у детей и тяжелых больных.

В результате многолетних, начиная с 1999 года, проспективных исследований циркуляции антигенов Нр нами впервые была установлена сезонная изменчивость Нр в организме, его способности к размножению и продукции токсина (3). До последнего времени сезонные изменения жизнедеятельности Нр в организме не исследовались вследствие сложностей методического характера и не учитывались при диагностике Нр-инфекций, прогнозе обострений, оценке эффективности антихеликобактерной терапии.

Разработанные нами методы с учетом полученных данных о сезонных изменениях частоты встречаемости О-антигена, ВМБ и VacA в организме наиболее близки по своей сущности и выбраны нами в качестве аналогов настоящего изобретения.

Известна также зависимость частоты встречаемости Нр от возраста пациента. Считается, что инфицирование Нр происходит в детстве и в последующие годы нарастает. В ходе многолетних исследований на большом фактическом материале от 1700 больных желудочно-кишечными заболеваниями (ЖКЗ) и 14 практически здоровых добровольцев (использовано в общей сложности более 4000 проб) были получены и проанализированы данные по использованию РКА для выявления антигенов-маркеров Нр в организме. Анализ накопленного массива данных позволил определить доминантные и дополнительные признаки, влияющие на Нр-инфицирование: сезонные колебания, возраст пациента, наличие клинических симптомов, солнечная активность в течение 11-летнего солнечного цикла, вид биоматериала. Эти данные и легли в основу настоящего изобретения.

Предложена Таблица – алгоритм диагностики и прогноза Нр-инфицирования и Формула вычисления вероятности Нр-инфицирования с учетом этих признаков.

Целью настоящей работы являлась разработка способа (алгоритма) определения вероятности Нр-инфицирования исследуемого пациента и одновременное определение биологической активности Нр (способности к размножению и токсигенности) с учетом наиболее значимых признаков, влияющих на нее.

Техническим результатом, достигаемым при использовании разработанного способа, являются Таблица – алгоритм и Формула определения Нр-инфицирования с учетом основных доминантных признаков, значительно упрощающие и делающие более эффективным определение вероятности Нр-инфицирования при диагностике, оценке результатов антихеликобактерной терапии, прогнозе обострений Нр-заболеваний и ретроспективных исследованиях. Способ может быть использован также при выборе и назначении профилактических мероприятий, а также при исследованиях в области хронобиологии, хрономедицины и гелиобиологии.

Способ определения O-антигена, ВМБ и VacA Нр реакцией коагглютинации, использование для этих целей Таблицы и Формулы и его апробация представлена в примерах.

ПРИМЕР 1. Частота встречаемости О-антигена, ВМБ и VacA Helicobacter pylori у практически здоровых добровольцев в ходе проспективных исследований.

С 1999 г. проводятся проспективные исследования по выявлению О-антигенов, ВМБ и VacA Нр в пробах биоматериала (более 3000 проб) у 14 практически здоровых добровольцев (не предъявляющих жалоб со стороны ЖКТ) в возрасте от 2-х до 92-х лет. В результате этих исследований впервые была установлена сезонная изменчивость частоты встречаемости антигенов в зависимости от месяца года. Кривые среднемесячных показателей по О-антигену представлены на чертеже.

Как видно из чертежа, отражающего частоту встречаемости О-антигена Helicobacter pylori в пробах слюны и кала у здоровых добровольцев в различные месяцы года наиболее высокие показатели выявления О-антигена Нр отмечаются весной в феврале-марте месяцах и осенью в октябре и ноябре. Высокие показатели обнаруживаются также зимой в декабре и январе. В летние месяцы (июнь, июль, август), иногда в сентябре, частота выявления О-антигена существенно снижается. Интенсивность выявления (титры) О-антигена также наиболее высокая в весенний и осенний периоды года.

Аналогичная кривая сезонных колебаний наблюдается также в отношение VacA Нр, хотя амплитуда этих колебаний выражена меньше, чем у О-антигена. Частота встречаемости ВМБ не претерпевала существенных изменений в течение всего года.

Полученные данные свидетельствуют о высокой биологической активности Нр в организме в весенний и осенний периоды года, когда наблюдается нарастание уровня и частоты встречаемости специфического О-антигена и VacA токсина, отражающих способность Нр к размножению и экспрессии токсинов. Существенное снижение О-антигена в летние месяцы, вероятно, связано с переходом бациллярной формы микроба в кокковую, которая, как известно, утрачивает свои поверхностные структуры. Жизнеспособность микроба, однако, при этом сохранялась, о чем свидетельствует неизменный уровень ВМБ.

Важно подчеркнуть, что уникальный весеннне-осенний подъем жизнедеятельности Нр четко отличался от известного летнего сезонного подъема заболеваемости, а также уровня О-антигенов других возбудителей ЖКЗ, в том числе близкородственного Campylobacter.

ПРИМЕР 2. Возраст.

Анализ частоты встречаемости О-антигена Нр в зависимости от возраста исследованных здоровых добровольцев, а также амбулаторных больных с симптомами ЖКИ (в общей сложности 1700 человек) показал, что значительно более низкий показатель частоты выявления антигена Нр наблюдался лишь у детей до 1 года (12%). У детей до 4-х лет он составлял 22%. У более старших детей и взрослых этот показатель несущественно колебался от 30% до 46%, в среднем 37%.

ПРИМЕР 3. Солнечная активность.

Обнаружение сезонных колебаний уровня антигенов и токсина Нр в организме свидетельствовало о влиянии солнечной активности в течение года. Полученные данные явились основанием для анализа показателей частоты встречаемости антигенов в различные годы 11-летнего ритма солнечной активности. Были сопоставлены среднегодовые показатели частоты встречаемости О-антигена Нр и среднегодовые значения чисел Вольфа, являющихся интегральным показателем солнечной активности. Оказалось, что частота встречаемости О-антигена была наиболее высокой в годы наиболее высоких показателей солнечной активности – 1999 г., 2000 г., 2001 г., и снижалась в годы спада кривой СА в 2002-2006 гг. Эти данные показали, что при диагностике и прогнозировании Нр-инфицирования необходимо учитывать также годы солнечного цикла.

ПРИМЕР 4. Клинические симптомы заболеваний ЖКТ.

Из обширной литературы известно, что частота встречаемости Нр по результатам микроскопических и гистологических исследований биоптатов желудка, быстрого уреазного теста, ИФА, уреазного дыхательного теста зависит от характера заболевания и тяжести клинических симптомов, а также морфологических повреждений при заболеваниях верхних отделов ЖКТ.

Наши исследования показали, что частота встречаемости антигенов Нр также коррелирует с выраженностью клинических, гистологических, бактериоскопический показателей. В таблице 1 представлены показатели частоты выявления О-антигена Нр у практически здоровых и больных различными ЖКЗ.

Эти данные также необходимо учитывать при определении вероятности выявления Нр.

ПРИМЕР 6. Вид биоматериала. Условия проведения реакции коагглютинации с биоматериалом от конкретного пациента и оценка результатов.

Наши исследования показали, что относительная чувствительность РКА при определении О-Нр инфицирования при использовании разных видов биоматериала нарастает в следующей последовательности: копрофильтрат < слюна < ЦИК сыворотки крови. Для установления диагноза Нр-инфицирования достаточно брать для исследования в РКА две пробы биоматериала: кал и слюну или кал и сыворотку крови. В каждой из них определяют О-антиген Нр, в слюне и ЦИК также ВМБ и VacA.

Выбор биоматериала определяется своеобразной кривой циркуляции этих антигенов в различные фазы обострения Нр-инфекции. Так, с первых дней инфекционного процесса О-антиген выявляется сначала в кале, несколькими днями позже также в слюне. (Появление О-антигена в слюне, по-видимому, объясняется поступлением его через поврежденную слизистую оболочку ЖКТ в кровь и затем через слюнные железы в ротовую полость). В составе ЦИК крови О-антиген, ВМБ и VacA обнаруживаются вскоре после появления в сыворотке антител. В период реконвалесценции, а также после эффективной эрадикационной терапии О-антиген сначала прекращает выявляться в кале, затем в слюне; в ЦИК крови он может обнаруживаться до 1-2 месяцев. Примерно те же сроки характерны для ВМБ и VacA.

При анализе и оценке результатов РКА у исследуемого больного обнаружение выявление О-антигена в кале и/или слюне свидетельствует о текущей Нр-инфекции. При этом высокие титры О-антигена (2+ и более) также о размножении возбудителя в организме. Обнаружение О-антигена Нр в составе ЦИК означает появление специфической ответной иммунной реакции организма на чужеродные для него антигены микроба, образование специфических иммунных комплексов и персистенцию их в организме. Положительная реакция на VacA свидетельствует о высокой вирулентности штамма Нр и продукции в организме.

Использование каждого из этих видов биоматериала имеет свои достоинства и ограничения: исследование кала целесообразно проводить с целью ранней диагностики, слюны, кроме того, для верификации обнаружения О-антигена более чувствительной, хотя и более поздней реакцией. Кроме того, слюна может быть использована для выявления ВМБ и VacA, наличие последнего определяет токсигенность (более высокую вирулентность) штамма. Выявление ВМБ и/или VacA верифицирует наличие Нр в организме даже при отрицательной реакции на О-антиген в кале и/или слюне.

Обнаружение О-антигена и/или ВМБ и/или VacA хотя бы в одной из исследованных проб свидетельствует о Нр-инфицировании. Отсутствие этих антигенов во всех биопробах означает, что Нр-инфицирование маловероятно или отрицательно. Для уточнения диагноза необходимо проведение повторного анализа, лучше в ближайший весенний или осенний периоды года.

При окончательной оценке данных РКА у пациента необходимо учитывать не только конкретные данные настоящего исследования, но также закономерные показатели вероятности Нр-инфицирования с учетом основных признаков, влияющих на нее, проведенных в примерах 1-5.

ПРИМЕР 7. Использование Таблицы – алгоритма диагностики вероятности Нр-инфицирования и Формулы ее вычисления.

Для определения вероятности Нр-инфицирования разработана Таблица-алгоритм диагностики вероятности Нр-инфицирования. В Таблице 2 содержатся среднеарифметические значения частоты встречаемости О-антигена Нр в разные месяцы года (в %) у практически здоровых добровольцев, обозначенные признаком «СЕЗОННОСТЬ» (С) и 4 поправочных КОЭФИЦИЕНТА для следующих признаков и групп признаков:

К₁ – возраст; К₂ – солнечная активность в течение 11-летнего солнечного цикла; К₃ – клинические симптомы заболевания; К₄ – вид биоматериала.

Обозначения:

С – сезонность, %;

K₁ – возраст;

K₂ – солнечная активность в годы 11-летнего цикла;

К₃ – клинические симптомы заболеваний;

К₄ – вид биоматериала;

Н – практически здоровые, без симптомов ЖКЗ;

КИ – больные кишечными инфекциями;

НЯД – больные неязвенной диспепсией;

Хр. г-т – больные хроническим гастритом;

ЯБ – больные язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки;

Атр. г-т – больные атрофическим гастритом.

Формула

Вычисление Индекса вероятности Нр-инфицирования (ИВИ Нр) проводится по Формуле

При ИВИ = 1-9% вероятность Нр-инфицирования оценивается как – сомнительная;

= 10%-19% ВИНр – низкая;

= 20%-39% ВИНр – средняя;

= 40%-100% ВИНр – высокая;

= 0% ВИНр – отрицательная.

Например, необходимо определить вероятность Нр-инфицирования больного А, 24 лет, поступившего 10.10.2006 г., с симптомами неязвенной диспепсии, в качестве биоматериала использована слюна. С помощью Таблицы и Формулы определяем ИВИ – Нр:

ИВИ-Нр=45×1,0×0,6×1,3×0,9=32%

Данные РКА слюны = О⁺ВМБ⁺Vac⁺.

Заключение: Вероятность Нр-инфицирования – 32%, средней степени; штамм Нр продуцирует в организме VacA.

Таким образом, при окончательной диагностике Нр-инфицирования необходимо учитывать не только фактические результаты определения О, ВМБ антигенов и VacA в биопробах конкретного пациента (пример 6), но также вероятность Нр-инфицирования с учетом основных внешних и внутренних факторов, влияющих на Нр-инфицирование, перечисленных в Примерах 1-5. В случае несоответствия конкретных фактических данных РКА с показателями вычисления вероятности содержания антигенов Нр по прилагаемой Таблице и Формуле при повторном анализе, возникает подозрение о возможном воздействии на жизнедеятельность Нр других факторов (признаков), влияющих на его персистенцию в организме. Например, имеется наблюдение, что кривая персистенции Нр в организме изменяется при холестатическом варианте вирусных гепатитов.

Определение вероятности Нр-инфицирования может быть использовано не только для оптимизации диагностики Нр инфекций, но также при ретроспективных аналитических исследованиях, а также для прогнозирования обострений Нр-ассоциированных заболеваний.

ПРИМЕР 8. Апробация способа определения вероятности Нр-инфицирования.

Апробация Способа была проведена на группе практически здоровых и больных пациентов с симптомами заболеваний желудочно-кишечного тракта. Исследовано 38 пациентов, взятых от 26 мужчин 12 женщин, из которых 9 человек не имели каких-либо симптомов ЖКЗ; 8 – имели симптомы кишечных инфекций; 10 – хронического гастрита; 7 – язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, подтвержденной эндоскопическими и гистологическими исследованиями; 4 – атрофическим гастритом, подтвержденным эндоскопией, из которых 6 человек исследовались до и после антихеликобактерной терапии. Определяли вероятность Нр-инфицирования с помощью предложенной Таблицы – алгоритма и Формулы в сопоставлении с результатами РКА при определении О-антигена, ВМБ и VacA в кале, слюне и ЦИК крови. Результаты апробации Способа и Формулы представлены в таблице 3.

Из данных, предоставленных в Таблице 3, следует, что вероятность Нр-инфицирования, рассчитанная по предлагаемой Таблице 2 и Формуле и равная 10% и выше (низкая, средняя и высокая), была определена в 32 из 38 исследованных проб (84%±6%), вероятность инфицирования остальных 6 проб (16%) была сомнительной.

Выявление О-антигена Нр в РКА наблюдалось в 37 из 38 проб (97%±6%), ВМБ обнаружены в 29 из 37 проб ЦИК крови (78%), VacA – 26 из 37 проб (70%). В общей сложности Нр-инфицирование на основании обнаружения в РКА О-антигена и/или ВМБ и/или VacA обнаружено в 37 из 38 (97±3%) проб.

Совпадение результатов определения вероятности Нр-инфицирования с помощью предлагаемой Таблицы и Формулы с результатами определения антигенов Нр в РКА составляет также 97±3%. Не совпадали значения Нр-инфицирования при том и другом методах определения лишь в 1 случае (2,7%).

Полученные данные, таким образом, показали высокую эффективность предлагаемого Способа определения вероятности Нр-инфицирования с помощью разработанных Таблицы и Формулы, который наряду с высокой чувствительностью, не уступающей другим методам диагностики Нр-инфицирования. Может быть использован для верификации диагностики, а также для прогноза и ретроспективных исследований хеликобактериоза.

Литература

1. Белая Ю.А., Вахрамеева М.С., Белый Ю.Ф., Белая О.Ф., Петрухин В.Г.

Способ получения тест-систем для определения антигенов цитотоксинассоциированных белков Helicobacter pylori в биологическом материале инфицированных лиц реакцией коагглютинации. Патент 2232989 от 15 октября 2002 г. БИ 20.

2. Белая Ю.А., Белая О.Ф., Петрухин В.Г.

Способ получения диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori в реакции коагглютинации. Патент 2186394 от 31 января 2001 г.

3. Белая Ю.А.

Сезонная изменчивость жизнедеятельности Helicobacter pylori в организме. Ж-л «Ремедиум Поволжья». «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней». 2006 г., с 72, Н.Новгород.

4. Белый Ю.Ф., Шеклакова Л.Л., Вахрамеева М.С., Жуховицкий В.Г., Петрухин В.Г., Белая Ю.А. Получение рекомбинантного фрагмента белка VacA Helicobacter pylori и разработка на его основе неинвазивного метода диагностики хеликобактериоза. Молекулярная генетика, микробиологии, вирусологии, 2005 г., 1, с 32-35.

5. Евдокимов В.В., Белая Ю.А.

Неинвазивный способ выявления Helicobacter pylori при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. Патент 2193203 от 17 февраля 2000 г., БИ 32.

6. Исаков В.А, Домарадский И.В.

Хеликобактериоз. Мед. практика. – М, Москва, 2003 г., 411 с.

7. Harry L.T. Mobley, George L. Mendz and Stuart L. Hazel. Helicobacter pylori. Washington (DC); 2001 г.

Формула изобретения

Способ определения вероятности инфицирования Helicobacter pylori, включающий выявление антигена-маркера Helicobacter pylori в биологических субстратах, таких, как копрофильтрат, слюна, сыворотка крови, реакцией коагглютинации (РКА), определение индекса вероятности инфицирования (ИВИ Нр) по формуле
ИВИ Нр=С×К₁×К₂×К₃×К₄,
где С – сезонность, %, К₁ – возраст пациента, К₂ – частота встречаемости антигенов в различные годы 11-летнего цикла солнечной активности, К₃ – клинические симптомы,
К₄ – вид биоматериала,
и при значениях ИВИ Нр от 1 до 9% вероятность инфицирования определяют как сомнительную, от 10 до 19% – низкую, от 20 до 39% – среднюю, от 40 до 100% высокую.

РИСУНКИ