Патент на изобретение №2359454

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИ НЕВЫРАЖЕННЫХ ФОРМ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Способ заключается в том, что быстрорастущие и медленнорастущие формы определяют по суммарному содержанию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбриона. Причем этот показатель у медленнорастущих превосходит таковой у быстрорастущих в 10 и более раз. Способ позволяет прогнозировать мясную продуктивность фенотипически невыраженных особей и осуществлять подбор пар в селекционной работе. 5 табл.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции сельскохозяйственной птицы.

Известно, что основным критерием, по которому можно прогнозировать продуктивные качества птицы, является порода-линия-кросс (формы). В последнее время некоторые виды птиц, считавшихся ранее дикими, приобрели сельскохозяйственное значение. Но не везде ведется строгий контроль их происхождения. В связи с этим затруднено не только прогнозирование продуктивных качеств, но и селекционная работа. Внешние (фенотипические) признаки не всегда четко проявляются. Классическим методом выяснения происхождения животных является генетическая экспертиза как непосредственная, основанная на анализе ДНК (заявка 2004126246/13), так и опосредованная – по иммунологическим реакциям (заявка 97121627/13). Но она может быть использована только в том случае, если известны маркеры. В этом ее основной недостаток. Определение по другим показателям (по продолжительности периода эмбрионального развития – заявка 96101232/13), возможно лишь у тех видов животных, у которых выявлена их жесткая взаимосвязь с теми или иными формами, а величина различия достаточно велика.

В предлагаемом изобретении разработан способ определения фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственных птиц, простой для использования и дающий однозначный ответ. В основе изобретения лежит обнаруженный нами факт, что суммарное содержание нитро- и нитрозосоединений (RNO+RNO₂) в амниотической жидкости эмбрионов сельскохозяйственной птицы тесно связано со скоростью роста птенцов после вылупления. У быстрорастущих (мясных) форм этот показатель многократно ниже, чем у исходных, а также яичных. Это позволяет использовать его для прогнозирования мясной продуктивности фенотипически невыраженных особей, а также для подбора пар в селекционной работе.

Пример конкретного выполнения

Эксперименты проводились на амниотической жидкости эмбрионов птиц, полученных в ООО “Генофонд” (г.Сергиев Посад) – куры, перепела и цесарки, в парке птиц “Воробьи” (Калужская область) – страусы. Отборы амниотической жидкости брались на 7 и 11 сутки инкубации у куриных эмбрионов, на 10 – у перепелиных, на 9 и 15 – у цесариных и на 15 и 18 – у страусиных. В каждом случае было исследовано от 10 до 30 эмбрионов.

В амниотической жидкости определялось суммарное содержание нитрата, нитрита, высокомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (то есть высоко- и низкомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (RNO+RNO₂)). Этот показатель был относительно (±10%) стабилен в течение всего периода развития эмбриона.

Определение содержания RNO+RNO₂ осуществлялось при помощи метода, основанного на способности нитрозосоединений ингибировать фермент каталазу. Он подробно описан в следующих работах: [Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2003) Биохимия, 68, 769-776; Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2005) Биохимия, 70, 575-587; Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. Вестник Гродненского Государственного Университета им. Янки Купалы, 2007, серия 2, 2(52), с.93-100].

Порядок определения RNO+RNO₂ и необходимые реактивы

40 мМ р-р КН₂РО₄ (или NaH₂PO₄);

1,5 М маточный раствор NaCl;

25 мкМ маточный водный раствор нитрита (натрия либо калия) – для калибровки;

30 мМ маточный водный раствор хлорида ванадия (VCl₃) – восстановитель нитросоединений в нитрозо-.

Гемолизированные эритроциты коровы, полученные путем разбавления крови дистиллированной водой в 10 раз;

Перекись водорода (3% р-р).

Порядок проведения анализа

1. Определяется активность каталазы в реакционной среде, содержащей 40 мМ фосфатный буфер, рН 6,0, 150 мМ NaCl, 9 нМ фирменного препарата каталазы, либо гемолизированные эритроциты коровы (можно крысы, человека), содержащие эндогенную каталазу. Это – контрольный образец.

2. Проводится калибровка. Определяется активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 125, 250 и 500 нМ нитрита.

3. Образец амниотической жидкости (200 мкл) инкубируется в течение 15 минут с равным объемом 30 мМ р-ра VCl₃. Затем переносится в основную среду (см п.1). Суммарное содержание RNO+RNO₂ определяется по степени снижения активности каталазы в соответствии с калибровкой (см. п.2).

Активность каталазы определяется любым известным методом, не требующим использования перекиси водорода в концентрации более 9 мМ.

Установлено, что линии и кроссы птиц, отличающиеся высокой скоростью прироста живой массы, содержат в амниотической жидкости многократно меньше нитро- и нитрозосоединений, чем исходные и яичные формы.

Анализ амниотической жидкости указанных в таблице пород, линий и кроссов показал, что все формы кур, перепелов и цесарок, считающиеся мясными, содержат многократно меньшую концентрацию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости, чем исходные и яичные – десятки и сотни микромоль против тысяч (таблицы 1-3).

Эта закономерность наблюдается и на страусах. В страусоводческих хозяйствах разводят две разновидности страусов: черношеяя и голубошеяя. Потомство, полученное в результате скрещивания этих разновидностей, отличается более высокой, чем родительские формы, скоростью прироста живой массы. Анализ содержания нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбрионов страусов показал ту же закономерность, которая наблюдалась у кур, перепелов и цесарок: эмбрионы гибридов содержали более чем на порядок меньше нитрозо- и нитросоединений, чем родительские формы (таблица 4).

В таблице 5 представлены факты идентификации фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание нитро- и нитрозосоединений в амнионе. Тест во всех случаях давал однозначные ответы.

Таблица 5
Определение фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание метаболитов NO в амнионе
Самец	Самка	Содержание RNO+RNO2 в амнионе, мМ	Вывод
	Формы		Формы
1	Черношеий	1	невыражена	80	Самка черношеяя
2	Голубошеий	2	невыражена	5	Самка черношеяя
Самец 2 или 3? неизвестно	Голубошеий или черношеий – необходимо определить	3	черная	90	Черношеий самец 3
3	Черношеий	4	невыражена	4-5	Самка голубошеяя
3	Черношеий	5	невыражена	6	Самка голубошеяя
3	Черношеий	6	невыражена	85	Самка черношеяя

Формула изобретения

Способ идентификации фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственной птицы, отличающийся тем, что быстрорастущие и медленнорастущие формы определяют по суммарному содержанию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбриона, причем этот показатель у медленнорастущих превосходит таковой у быстрорастущих в 10 и более раз.