Патент на изобретение №2358013
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ МИКРООБРАЗЦОВ ТКАНЕЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
(57) Реферат:
Изобретение относится к молекулярной генетике. Предложен способ определения концентрации (мкг/мкл) геномной ДНК из микрообразцов тканей млекопитающих. Благодаря высокой чувствительности и специфичности изобретение может быть использовано в лабораторных исследованиях, а также в медицине и сельском хозяйстве. 2 ил., 1 табл.
Изобретение относится к молекулярной генетике и может найти применение в медицине и сельском хозяйстве, например, при расчетах удельной копийности генов у трансгенных организмов. Существует способ определения концентрации ДНК, основанный на измерении оптической плотности растворов ДНК (Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984, с.410), но он требует достаточно большого количества материала и высокой степени его очистки. Недостатком прототипа является его недостаточно высокая чувствительность. Способ позволяет определять количество ДНК в образце, содержащем не менее 0,5 мкг ДНК. Для анализа микрообразцов (особенно эмбрионального происхождения) требуется способ, обладающий более высокой чувствительностью. Кроме того, прототип недостаточно специфичен. Наличие в образце примесей РНК или чужеродной (например, микробной или растительной) ДНК приводит к искажению результатов, т.к. бромистый этидий образует флуоресцирующий комплекс с любой нуклеиновой кислотой. Задачей изобретения является создание способа количественного определения геномной ДНК из микрообразцов тканей млекопитающих, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью. Поставленная задача достигается тем, что проводят опытную и калибровочную ПЦР с разведениями стандартного образца геномной ДНК, продукты амплификации разделяют электрофорезом в агарозном геле, фотографируют окрашенную электрофореграмму в УФ-свете и сравнивают экстинкции ампликонов опытного и стандартного образцов. Способ осуществляют следующим образом. Из тканей мыши выделяли ДНК и на спектрофотометре определяли ее концентрацию. Это – стандартный образец ДНК. Из него делали разведения в диапазоне от 0,002 до 0,05 мкг/мкл. Проводили амплификацию фрагмента гена бета-глобина мыши с образцами из серии разведения стандартной ДНК и параллельно с исследуемым образцом, который выделяли так же, как и стандартный образец. Для ПЦР использовали праймеры к гену бета-глобина, являющемуся однокопийным в геноме мыши. Поскольку выбран однокопийный ген, не существует опасности искажения результатов, обусловленной индивидуальными внутривидовыми колебаниями копийности гена-мишени. Кроме того, ген бета-глобина отсутствует в геноме микроорганизмов и растений. Проводили электрофорез ампликонов в агарозном геле, окрашивали раствором бромистого этидия и получали цифровое изображение электрофореграммы. С помощью программы анализа графических объектов измеряли экстинкцию окрашенных полос ампликона и строили калибровочный график зависимости оптической плотности ампликона от концентрации ДНК в разведенных образцах стандартной ДНК. По калибровочному графику (см. фиг.1) определяли концентрацию ДНК в исследуемом образце. Пример конкретного выполнения. Стандартная ДНК была выделена из печени мыши. Определение концентрации ДНК проводили на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Она составила 0,4 мкг/мкл. Сделали разведения стандартной ДНК. Концентрация составляла: 0; 0,005; 0,01; 0,02 и 0,04 мкг/мкл. Исследуемый образец – ДНК, выделенная из амниотической оболочки 10,5-суточного эмбриона мыши. Праймеры к гену бета-глобина мыши: 5′-CCACAGATCCTATTGCCATGCCC-3′ – прямой, 5′-CATAAGACCCCAGTAATGAGCC-3′ – обратный. Длина ампликона составляет 501 пару оснований. Состав реакционной пробы. Реакционная проба в объеме 20 мкл имела следующий состав.
Режим амплификации: 95° – 5 мин (95° – 30 сек, 57,5° – 1 мин, 72° – 30 сек) – 30 циклов, 72° – 10 мин. Проводили амплификацию стандартных и исследуемых образцов на амплификаторе «Терцик». По окончании реакции по 10 мкл реакционной смеси вносили в лунки 1,5% агарозного геля и проводили электрофорез. Гель окрашивали раствором бромистого этидия и фотографировали аппаратом Olimpus флуоресценцию электрофореграммы в УФ-свете. С помощью программы PhotoM 1.31 измерили оптическую плотность полос ампликонов в стандартных и исследуемых образцах. Результаты представлены на фиг.2, графике и в таблице.
Формула изобретения
Способ определения концентрации (мкг/мкл) геномной ДНК из микрообразцов тканей млекопитающих, включающий измерение флуоресценции бромистого этидия, интеркалированного в молекулу ДНК, отличающийся тем, что проводят параллельно амплификацию фрагмента гена бета-глобина в исследуемом образце ДНК, а также амплификацию фрагмента гена бета-глобина в ряде образцов стандартной ДНК известной концентрации в диапазоне концентраций от 0,005 до 0,04 мкг/мкл, число циклов амплификации составляет 30, продукты амплификации разделяют электрофорезом в агарозном геле, фотографируют окрашенную бромистым этидием электрофореграмму в УФ-свете, измеряют экстинкции полос ампликонов на электрофореграмме опытного и стандартного образцов программой PhotoM 1.31, строят калибровочный график зависимости экстинкции полос ампликонов от исходной концентрации ДНК в стандартных образцах и по калибровочному графику определяют концентрацию ДНК в исследуемой пробе.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
пробы
