Патент на изобретение №2358012
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЖИВОТНЫХ, ПЕРСИСТЕНТНО ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ – БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
(57) Реферат:
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложен способ выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающий отбор проб сыворотки крови от 20-ти животных стада в возрасте от новорожденных до 12 месяцев, выделение РНК вируса из объединенных проб, синтез олигонуклеотидных праймеров, амплификацию РНК вируса в ПЦР, идентификацию продуктов ПЦР с помощью электрофореза. В случае положительной реакции выявляется фрагмент 731 н.п. Изобретение может быть использовано в ветеринарии для выявления инфицированных животных. 2 з.п. ф-лы, 5 табл.
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии для выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) путем исследования проб сывороток крови в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Персистентную форму инфекции у крупного рогатого скота вызывает только нецитопатогенный биотип вируса ВД-БС КРС. Животные инфицируются внутриутробно в период с 90-го по 125-й дни своего развития, когда иммунная система плода еще окончательно не сформирована. У них после рождения регистрируется постоянная виремия, они практически пожизненно выделяют вирус во внешнюю среду и служат скрытыми источниками вируса. Вируснейтрализующие антитела у таких животных не выявляются. Потомство персистентно инфицированных коров также персистентно инфицировано, в результате чего могут возникать персистентно инфицированные «семьи» животных. Превалентность персистентно инфицированных животных в общей популяции крупного рогатого скота колеблется от 1 до 3%. Инцидентность инфекции в первом триместре стельности рассматривается как 3,3% на всю популяцию. Истинное количество персистентно инфицированных телят установить удается редко и принято считать, что в среднем их количество составляет 100 на 1000 отелов. Введение в стадо животного, переносящего инфекцию в персистентной форме, может привести к ее распространению среди восприимчивого поголовья в течение короткого периода времени. К недостаткам иммунопероксидазного метода (ИПМ) относится необходимость поддержания и использования для выделения вируса культур клеток, а также окраски монослоя клеток после проведения нескольких пассажей для его выявления, что является длительной и трудоемкой процедурой. К недостаткам иммуноферментного метода (ИФМ) относятся длительная и не всегда доступная диагностическим лабораториям процедура получения моноклональных антител к белкам вируса, конъюгирования их с ферментами, а также необходимость приобретения специального дорогостоящего оборудования для его постановки и автоматизированного учета. Наружные праймеры для первого раунда амплификации: 5′ AAGATCCACCCTTATGA(A/G)GC 3′ 5′ AAGAAGCCATCATC(A/C)CCACA 3′. Множественные внутренние праймеры для второго раунда ПЦР: 5′ TGGAGATCTTTCACACAATAGC 3′, 5′ GGGAACCTAAGAACTAAATC 3′, 5′ GCTGTTTCACCCAGTT(A/G)TACAT 3′ К недостаткам данного способа можно отнести то, что он проводится методом гнездовой ПЦР, требующей синтез двух пар праймеров (внутренних и наружных) и, соответственно, проведения реакции в два раунда, а также низкую чувствительность 30-50 ТЦД50/мл. Данный способ не предполагает исследовать объединенные пробы сыворотки крови от телят, а только раздельно. Задачей изобретения является выявление животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС), сокращение сроков исследования и увеличение количества обследуемых животных. Поставленная задача решается тем, что в заявляемом способе выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающем отбор проб сыворотки крови от животных, выделение РНК вируса, синтез олигонуклеотидных праймеров, амплификацию РНК вируса в полимеразной цепной реакции, идентификацию продуктов ПЦР с помощью электрофореза, согласно изобретению, отличающийся тем, что праймеры имеют следующий олигонуклеотидный состав: 5′ AGATCCACCCTTATGAGGCA 3′, 5′ TGTTTCACCCAGTTATACATGC 3′, реакция проводится в один раунд, в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 731 н.п. 2. Сущность способа заключается также в том, что выявление вируса осуществляют в объединенных пробах сыворотки крови, полученных от 20-ти животных стада крупного рогатого скота в возрасте от новорожденных до 12 месяцев. 3. Сущность способа заключается также в том, что в случае выявления персистентно инфицированных телят обследуют их коров-матерей. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Отбор проб от животных и получение сыворотки проводят методом ее отстоя по общепринятой методике (А.А.Кудрявцева, Л.А.Кудрявцева. Клиническая гематология животных. Москва, Колос. – 1974). Пример 2. Выявление РНК вируса вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота в пробах сыворотки крови телят с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способ осуществляется в несколько этапов. Этап 1. Выделение РНК вируса ВД-БС КРС из проб сывороток крови осуществляют с использованием набора для выделения РНК/ДНК сорбцией на силикагеле «Рибо-сорб» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Этап 2. Проведение реакции обратной транскрипции для получения кДНК. Для проведения реакции обратной транскрипции РНК применяют комплект «Реверта-L» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Этап 3. Амплификация участка к-ДНК вируса ВД-БС КРС, кодирующего ген NS5B. Полимеразная цепная реакция. Состав реакционной смеси: ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgCl2, 25 mM KCl, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, по 0,1 мкг каждого праймера, 1.25 U Taq-ДНК-полимераза, 5 мкл продукта обратной транскрипции. Температурный режим проведения ПЦР: Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: 95°С – 2 мин – 1 цикл; 95°С – 30 с, 60°С – 45 с, 72°С – 45 с – 35 циклов; 72°С – 1 мин. Этап 4. Определение размера продуктов диагностической ПЦР. Продукты ПЦР анализируют методом горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-ацетатном буфере (рН 8,0). Для определения размера продукта ПЦР используют маркер молекулярного веса 100 bp. Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 731 нуклеотидные пары. Таким образом, указанный способ позволяет выявлять РНК вируса ВД-БС КРС в сыворотках крови персистентно инфицированных телят. Пример 3. Определение чувствительности и специфичности ПЦР. Контрольный штамм вируса ВД-БС КРС Oregon С24 с инфекционным титром 105ТЦД50/мл подвергают титрованию путем десятикратных разведений до конечного разведения 10-7 и амплифицируют в ПЦР. Чувствительность данного способа выявления РНК вируса составляет 1 ТЦД50/мл. Результаты опытов по определению специфичности реакции представлены в таблице 1.
Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью при выявлении РНК штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС. Пример 4. Определение чувствительности ПЦР при исследовании проб сыворотки крови от животных, искусственно контаминированной вирусом ВД-БС КРС. Контрольный штамм вируса ВД-БС КРС Oregon С24 с инфекционным титром 105ТЦД50/мл в объеме 0,001 мл смешивают с пробами сыворотки крови крупного рогатого скота, не содержащей вирус ВД-БС КРС и антител к нему. Для этого предварительно пробы сыворотки крови смешивают по 0,1 мл в пулы, насчитывающие 10, 20, 30 и 40 объединенных проб в конечном объеме 1 мл. Пробирки, содержащие пробы сыворотки крови и вирус, тщательно перемешивают и подвергают исследованию в ПЦР согласно примеру 2.
Чувствительность данного способа выявления РНК вируса ВД-БС КРС в объединенных пробах сыворотки крови крупного рогатого скота, искусственно контаминированной вирусом, составляет 1 ТЦД50/мл. Таким образом, наиболее эффективное выявление вируса осуществляется при условии объединения проб сыворотки крови по 10 и 20 в один пул. Пример 5. Отбор и исследование проб сыворотки крови для выявления персистентно инфицированных вирусом ВД-БС КРС телят. Для исследования на ВД-БС КРС отбирают пробы сыворотки крови у всех телят обследуемого хозяйства в возрасте от новорожденных до 12 месяцев. Из каждой пробы сыворотки крови, полученной по стандартной методике методом отстоя, отбирают по 100 мкл и объединяют по 20 проб, далее исследуют как одну пробу. Пробы помещают в отдельные пробирки, нумеруют и доставляют для исследования в лабораторию в замороженном виде. Реакцию проводят согласно примеру 2. В случае положительного результата исследования объединенной пробы каждую пробу сыворотки крови исследуют отдельно. Результаты определения чувствительности разработанной методики при исследовании проб от животных, подозреваемых в персистентном инфицировании, приведены в таблице 3.
Таким образом, чувствительность разработанного метода совпадает при исследовании как проб сыворотки крови, искусственно контаминированной вирусом ВД-БС КРС, так и от животных, подозреваемых в персистентном вирусоносительстве, полученных непосредственно из стада крупного рогатого скота. Количество проб сыворотки, объединенных в одну пробу, составляет 20. Пример 6. Выявление персистентно инфицированных животных в стаде крупного рогатого скота. При обнаружении вируса в объединенных пробах сыворотки крови исследуют каждую пробу из партии раздельно с целью выявления индивидуальных животных, персистентно инфицированных вирусом. Результаты исследований приведены в таблице 4.
Пример 7. Выявление РНК вируса вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота в пробах сыворотки крови коров-матерей персистентно инфицированных телят с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР). После выявления телят, персистентно инфицированных вирусом ВД-БС КРС, обследуют их матерей на определение их статуса в отношении персистентной формы инфекции ВД-БС КРС. Для этого у них отбирают пробы сыворотки крови и исследуют методом ПЦР согласно примеру 2. Результаты приведены в таблице 5.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно выявлять животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, за счет выявления РНК вируса в полимеразной цепной реакции. Использование данного способа выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, позволит оптимизировать систему противоэпизоотических мероприятий при этой болезни за счет поголовного обследования телят, выявление персистентных вирусоносителей и удаление их из стада. Выявление коров-матерей, также персистентно инфицированных вирусом, предотвратит рождение персистентно инфицированных телят в будущем, что может значительно снизить риск распространения возбудителя инфекции в стаде и риск возникновения массовых респираторных и гинекологических болезней в нем.
Формула изобретения
1. Способ выявления животных, персистентно инфицированных вирусом вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающий отбор проб сыворотки крови от животных, выделение РНК вируса, синтез олигонуклеотидных праймеров, амплификацию РНК вируса в полимеразной цепной реакции, идентификацию продуктов ПЦР с помощью электрофореза, отличающийся тем, что праймеры имеют следующий олигонуклеотидный состав: 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявление вируса осуществляют в объединенных пробах сыворотки крови, полученных от 20-ти животных стада крупного рогатого скота в возрасте от новорожденных до 12 мес. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в случае выявления персистентно инфицированных телят обследуют их коров-матерей.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
п/п