Патент на изобретение №2358009
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано при конструировании питательных сред для выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды. Способ предусматривает следующее. Определяют соленость морской воды в районе выделения биолюминесцентных бактерий. Готовят питательную среду на дистиллированной воде, в которую добавляют хлористый натрий в количестве, соответствующем определенному значению солености, а также сухой питательный агар в количестве 34,0-36,0 г/л дистиллированной воды. Из морской воды выделяют биолюминесцентные бактерии методом мембранных фильтров. Засевают этими бактериями питательную среду и выращивают их при комнатной температуре в течение 22-24 часов. Присутствие биолюминесцентных бактерий определяли по наличию биолюминесценции у бактерий. Изобретение позволяет повысить выход биолюминесцентых бактерий, удешевление питательной среды. 1 табл.
Предлагаемое изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при конструировании питательных сред для выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды. Известен способ выращивания штамма люминесцентных бактерий Photobacterium leiognathi, который используется при определении токсичности сред [1]. Для выращивания штамма люминесцентных бактерий Photobacterium leiognathi используют: среду Егоровой: NaCl 30,0 г; КН2PO4 1,0 г; MgSO4 0,5 г; пептон 10,0 г; рыбная вытяжка 0,5 л; агар-агар 18,0 г; водопроводная вода 0,5 л; рН 7,4 (устанавливают 40%-ным NaOH); полусинтетическую среду (г на 1 л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН2PO4 1,0; Na2HPO4·12Н2O 10,0; MgSO4·7Н2O 0,2; (NH4)2HPO4 0,5; пептон Chemapol 5,0 (пептон Difco 10,0); глицерин 3 мл; агар-агар 20,0; рН 7,0; минимальную среду (г на 1 л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН2PO4 1,0; Na2HPO4·12Н2O 10,0; MgSO4·7Н2O 0,2; (NH4)2 HPO4 0,5; глицерин 3 мл или глюкоза 4 г; рН 7,0. Недостатком известного способа является сложность изготовления питательных сред и относительно высокая стоимость составляющих ее компонентов. Наиболее близким к предложенному способу является выбранный в качестве прототипа способ выделения и культивирования светящихся бактерий [2], включающий приготовление питательной среды, посев на нее светящихся бактерий и выращивание при комнатной температуре в течение 23-25 часов. Питательная среда содержит дистиллированную воду 1,0 л; гомогенат судака 500 г; NaCl 30,0 г; пептон 10,0 г; аспарагин 5,0 г; КН2PO4 1,0 г; MgSO4·7Н2О 0,5 г; агар-агар 20,0 г; рН 7,2-7,4. Недостатком известного способа является низкий выход светящихся бактерий, а также сложность изготовления питательной среды и относительно высокая стоимость составляющих ее компонентов. Задачей предлагаемого изобретения является повышение выхода биолюминесцентных бактерий при удешевлении питательной среды. Указанная задача достигается тем, что в способе выделения биолюминесцентных бактерий, предусматривающем приготовление питательной среды, включающей дистиллированную воду, хлористый натрий, питательную основу, посев на нее культур бактерий, сконцентрированных из морской воды на мембранном фильтре, и выращивание при комнатной температуре в течение 22-24 часов, с последующим выделением чистых культур биолюминесцентных бактерий, согласно изобретению предварительно определяют концентрацию хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий, и для приготовления питательной среды хлористый натрий в дистиллированную воду добавляют в концентрации, соответствующей значению концентрации его в морской воде, а в качестве питательной основы используют сухой питательный агар в количестве 34,0-36,0 г на 1 л дистиллированной воды. В предложенном способе благодаря предварительному определению концентрации хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий и добавлению хлористого натрия в дистиллированную воду в концентрации, соответствующей концентрации его в морской воде, создается соленость питательной среды, которая оптимальна для максимального роста выделенных в этом районе моря биолюминесцентных бактерий. При этом использование в питательной среде в качестве питательной основы сухого питательного агара и уменьшение количества компонентов значительно упрощает и удешевляет способ выделения биолюминесцентных бактерий по сравнению с прототипом. Совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение поставленной задачи. Сравнение прототипа с заявляемым решением показало, что указанные выше признаки являются отличительными, в связи с чем заявляемый способ соответствует критерию “новизны”. Способ осуществляется следующим образом. Определяют концентрацию хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий. Готовят питательную среду на дистиллированной воде. В нее добавляют хлористый натрий в количестве, соответствующем определенному значению солености, а также сухой питательный агар в количестве 34-36 г на 1 л дистиллированной воды. На среду производят посев бактерий, сконцентрированных из морской воды на мембранном фильтре, и выращивают при комнатной температуре в течение 22-24 часов, с последующим выделением чистых культур биолюминесцентных бактерий. Пример 1. Контрольную питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили следующим образом: в 1 л дистиллированной воды добавляли измельченного судака – 500 г; NaCl – 30,0 г; пептона – 10,0 г; аспарагина – 5,0 г; КН2PO4 – 1,0 г; MgSO4·7Н2O – 0,5 г; агар-агара – 20,0 г; рН среды 7,4. Питательную среду стерилизовали при 111°С в течение 20 мин. Охлажденную до 45°С среду разливали в стерильные чашки Петри, рН среды 7,4±0,1. Проводили концентрирование бактерий из морской воды (Черного и Азовского морей) методом мембранных фильтров и выращивали их на контрольной питательной среде при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1. Пример 2. Для приготовления питательной среды использовали питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой, который готовят из сухого препарата промышленного производства. В предлагаемом способе использовался сухой питательный агар производства ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ следующего состава (в г)
Приготовили его следующим образом: 32 г сухого питательного агара размешали в 1 л дистиллированной воды, прокипятили 1-2 мин до полного расплавления агара. Профильтровали через ватно-марлевый фильтр, разлили в стерильные емкости. Затем добавили NaCl – 30,0 г, т.е. концентрация хлористого натрия или соленость воды составила 30 Готовая среда в чашках Петри прозрачная, желтого цвета. Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Дополнительно измеряли соленость, т.е. концентрацию хлористого натрия в этой воде, которая для данных районов Азовского моря составила 10 Пример 3. Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примеру 2. Сухой питательный агар добавляли в количестве 33,0 г на 1 л дистиллированной воды, NaCl добавляли в количестве 22,0 г на 1 л дистиллированной воды, т.е. концентрация хлористого натрия или соленость воды составила 22 Пример 4. Методом мембранных фильтров проводили концентрирование бактерий из воды, отобранной в Азовском и Черном морей. Дополнительно измеряли соленость этой воды, которая для этих районов Азовского моря составила 10 Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примеру 2, 3, сухой питательный агар – 34,0 г на 1 л дистиллированной воды, NaCl добавляли в количестве 17,0 г на 1 л дистиллированной воды, т.е. соленость воды составляла 17 Фильтры с бактериями помещали на питательную среду и выращивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1. Пример 5. Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Дополнительно измеряли соленость этих вод, которая для этих районов морей составила 17 Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примерам 2-4, но NaCl добавляли в количестве 10,0 г на 1 л дистиллированной воды, т.е. соленость воды устанавливали 10 Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1. Пример 6. Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примерам 2-5, но NaCl добавляли в количестве 5 г, т.е. соленость воды устанавливали 5 Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 23 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1. Количество колоний биолюминесцентных бактерий, выросших на фильтрах, помещенных на питательные среды с различной концентрацией хлористого натрия, представлено в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, наибольшее количество колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из Черного моря, выросло на питательной среде, где концентрация хлористого натрия составляет 17 Таким образом, предложенный способ, используя более простую и дешевую питательную среду, в 2,5-4,0 раза повышает выход колоний биолюминесцентных бактерий по сравнению со средой-прототипом. Источники информации 1. Авт. свид. 2. Родина А.Г. Методы водной микробиологии» Ленинград: Наука 1965 г., стр.297-298 (прототип).
Формула изобретения
Способ выделения биолюминесцентных бактерий, предусматривающий приготовление питательной среды, включающей дистиллированную воду, хлористый натрий, питательную основу, посев на нее культур бактерий, сконцентрированных из морской воды на мембранном фильтре, и выращивание при комнатной температуре в течение 22-24 ч, с последующим выделением чистых культур биолюминесцентных бактерий, отличающийся тем, что предварительно определяют концентрацию хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий, и для приготовления питательной среды хлористый натрий в дистиллированную воду добавляют в концентрации соответствующей значению концентрации его в морской воде, а в качестве питательной основы используют сухой питательный агар в количестве 34,0-36,0 г на 1 л дистиллированной воды.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1, 2006, с.143-148. НАЙДАНОВА О.Г., ЕФРЕМОВ А.И. Нефтеокисляющие бактерии как часть сообщества бактериопланктона севастопольской бухты, Экология моря, 2000, вып.52, с.72-74. ИВАНИЦИНА В.А., БУХТИЯРОВ А.Е. Таксономический состав гетеротрофных бактерий Одесского побережья, устойчивых к тяжелым металлам, Морской экологичный журнал, т.3, 
. Простерилизовали автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. Охлажденную до 45°С среду разливали в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм, рН среды 7,4±0,1.