Патент на изобретение №2357975

(54) ПЕПТИД-ИММУНОМИМЕТИК ХИМИЧЕСКИХ КАНЦЕРОГЕНОВ, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИ ВЗАИМОДЕЙСТВОВАТЬ С АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ БЕНЗО[]ПИРЕНА И БЕНЗ[]АНТРАЦЕНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биохимии, генной и белковой инженерии. Пептид получен из фаговой пептидной библиотеки, содержащей набор статистических пептидов длиной 12 а.о., путем аффинной селекции тех клонов фага, которые содержат пептид, способный специфически связываться с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена. Пептид обладает способностью специфически взаимодействовать с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена. Имеет молекулярную массу около 1,3 кДа и установленную аминокислотную последовательность LHLPHHDGVGWG, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1. Предложенный пептид может найти применение в медицине как основа для разработки лекарственной формы пептидного препарата, используемого для иммунопрофилактики злокачественных новообразований у человека. 4 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии, конкретно – к пептиду, обладающему способностью специфически взаимодействовать с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена.

Химические канцерогены, будучи низкомолекулярными веществами, не способны индуцировать иммунный ответ. В то же время иммунизация животных конъюгатами белка с канцерогеном в качестве гаптена приводит к появлению специфических антител и значительному торможению канцерогенеза [1, 2]. Однако наличие канцерогена в составе таких конъюгатов исключает их использование в качестве вакцин, т.к. канцероген сохраняет способность индуцировать опухоли.

Наиболее ближайшим к заявляемому пептиду-иммунометику по выполняемым функциям – прототипом – является моноклональное антиидиотипическое антитело с “внутренним иммунологическим образом” бензо[]пирена, обладающее способностью специфически взаимодействовать с антителами против бензо[]пирена [3]. Известное антитело получали следующим образом. Конъюгатом бензо[]пирена иммунизировали кролика и получали антитела 1, специфичные к бензо[]пирену. Антителами 1 иммунизировали мышей и получали гибридому, продуцирующую моноклональные антиидиотипические антитела 2, специфичные к антителам 1. Моноклональными антиидиотипическими антителами 2 иммунизировали крыс, после чего им вводили бензо[]пирен. В результате у крыс наблюдалось угнетение возникновения опухолей, индуцированных бензо[]пиреном, эти опухоли росли медленнее, а продолжительность жизни крыс увеличивалась по сравнению с контролем (без предварительной иммунизации моноклональными антиидиотипическими антителами 2). Таким образом, была показана принципиальная возможность торможения канцерогенеза путем иммунизации животных белковыми молекулами, имитирующими иммуногенные свойства конъюгатов канцероген-белок и при этом не содержащими канцерогена в качестве гаптена.

Однако антиидиотипические антитела имеют недостатки, препятствующие их использованию в качестве антиканцерогенных вакцин, а гибридомная технология имеет ограничения для ее использования с целью получения таковых вакцин. При иммунизации чужеродными иммуноглобулинами могут образовываться побочные антивидовые и антиизотипические антитела, что может приводить к аллергическим и аутоиммунным осложнениям, а гибридомная технология характеризуется высокой трудоемкостью и затратностью.

Один из путей преодоления этих проблем состоит в использовании пептидов, имитирующих иммуногенные свойства конъюгатов канцероген-белок. Принципиально новый подход к созданию антиканцерогенных вакцин состоит в использовании фаговых пептидных библиотек. При этом можно получить пептиды-иммуномиметики химических канцерогенов, которые не содержат ни канцерогена, способного индуцировать возникновение опухоли, ни сопутствующих антигенных детерминант, способных вызвать побочные патологические осложнения.

Технической задачей изобретения является получение пептида-иммуномиметика химических канцерогенов, специфически взаимодействующих с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена, и установление его аминокислотной последовательности.

Заявляемый пептид получен из фаговой пептидной библиотеки, содержащей набор статистических пептидов длиной 12 аминокислотных остатков (а.о.), путем аффинной селекции тех клонов фага, которые содержат пептид, способный специфически связываться с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена. Пептид в библиотеке экспонирован на поверхности фагов в составе минорного белка оболочки pIII [4].

Аминокислотный состав полученного пептида-иммуномиметика, расположенного на поверхности фаговых частиц, определили секвенированием фаговых ДНК по модифицированному методу Сэнгера [5] в кодирующей пептид области. Заявляемый пептид имеет молекулярную массу около 1,3 кДа и аминокислотную последовательность LHLPHHDGVGWG, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, представленную на фиг.1.

Селектированный из фаговой пептидной библиотеки пептид с аминокислотной последовательностью LHLPHHDGVGWG обладает свойством специфически взаимодействовать с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена in vitro, а также индуцировать образование антител против бензо[]пирена in vivo.

Таким образом, впервые получен пептид, специфически взаимодействующий с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена in vitro и способный индуцировать образование антител против бензо[]пирена in vivo.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами его конкретного осуществления.

Пример 1. Способ проведения аффинной селекции пептидов, специфически взаимодействующих с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена.

Конъюгаты бензо[]пирена и бенз[]антрацена с БСА и дрожжевой гексокиназой синтезируют методом ковалентного связывания альдегидной группы гаптена с аминогруппами белка-носителя [6].

Для получения моноклональных антител против бензо[]пирена мышей линии BALB/c иммунизируют конъюгатом бензо[]пирен-БСА. Гибридомы получают посредством слияния клеток мышиной миеломы Sp2/0 и спленоцитов иммунной мыши, по протоколу, описанному Kohler и Milstein [7]. Полученные моноклональные антитела перекрестно реагируют с конъюгатами бензо[]пирен-БСА и бенз[]антрацен-БСА.

Для получения поликлональных антител кроликов иммунизируют конъюгатом бензо[]пирен-БСА. Из антисывороток выделяют моноспецифические антитела против бензо[]пирена и бенз[]антрацена при помощи аффинной хроматографии на колонках бензо[]пирен-гексокиназа-Сефароза 4В и бенз[]антрацен-гексокиназа-Сефароза 4В.

Полученные моноклональные антитела против бензо[]пирена и бенз[]антрацена растворяют в фосфатно-солевом буфере, содержащем 137 мМ NaCl; 2,68 мМ KCl; 8,1 мМ Na₂HPO₄·12H₂O; 1,47 мМ КН₂PO₄, до конечной концентрации 10 мкг/мл. Полученным раствором антител сенсибилизируют стерильные полистироловые чашки Петри. Участки неспецифического связывания блокируют 0,5%-ным раствором БСА в фосфатно-солевом буфере. Исходную фаговую пептидную библиотеку, разведенную в фосфатно-солевом буфере до конечной концентрации 2·10¹¹ кое/мл (колонеобразующие единицы/мл), инкубируют с иммобилизованными антителами в течение часа при комнатной температуре. После этого чашки Петри промывают фосфатно-солевым буфером, содержащим Tween 20. Элюцию связавшихся с антителами бактериофагов проводят раствором глицинового буфера (0,2 М Glycine-HCl рН 2.2, 0.1% БСА) в течение 10 мин с мягким покачиванием. Элюированную фракцию нейтрализуют 150 мкл 1 М Tris-HCl рН 9.1 и определяют титр фагов. Полученную популяцию бактериофагов, содержащую связавшиеся с моноклональными антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена пептиды, амплифицируют инфицированием клеток E. coli JM103 [10]. Выделяют фаги и проводят второй и третий раунды аффинной селекции как описано выше.

После третьего раунда селекции получают индивидуальные фаговые колонии, которые используют для наработки одноцепочечной ДНК и фагов для ИФА. Определение последовательности ДНК вставки проводят по модифицированному методу Сэнгера [5].

Пример 2. Исследование пептида-иммуномиметика на специфическое связывание с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена in vitro.

Для характеристики способности пептида-иммуномиметика специфически связываться с моноклональными антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена проводят ИФА с серийным разведением фага, экспонирующим на своей поверхности пептид-иммуномиметик от 10¹¹ до 10⁶ кое/лунка. В лунки полистирольных 96-луночных планшетов сорбируют моноклональные антитела против бензо[]пирена и бенз[]антрацена, разведенные до конечной концентрации 5 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере. Участки неспецифического связывания блокируют 0,5%-ным раствором БСА в фосфатно-солевом буфере. После этого лунки инкубируют с анализируемыми клонами фагов, разбавленными в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05% Tween 20 с 0,5% БСА. Связавшиеся бактериофаги, экспонирующие на своей поверхности пептид-иммуномиметик, выявляют пероксидазным конъюгатом антител кролика против суммарных белков M13mp8. Поглощение раствора в лунках измеряют при длине волны 350 нм. Для контроля неспецифического связывания используют нативный фаг M13mp8. Результаты специфического связывания пептида-иммуномиметика в составе pIII белка фага с моноклональными антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена представлены на фиг.2, где по оси абсцисс указано разведение фага, а по оси ординат – оптическая плотность (OD 350); кривая 1 – связывание M13mp8 с моноклональными антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена; кривая 2 – связывание пептида-иммуномиметика в составе pIII белка фага с моноклональными антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена.

С помощью вестерн-блот-анализа исследуют связывание пептида-иммуномиметика в составе pIII белка отселектированного клона с моноклональными и моноспецифическими поликлональными антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена и моноспецифическими поликлональными антителами против бенз[]антрацена. После электрофоретического разделения рекомбинантного и дикого фагов на составляющие белки в 15%-ном ПААГ с додецилсульфатом натрия проводят их перенос на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем инкубируют с моноклональными антителами и моноспецифическими поликлональными антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена (5 мкг/мл). Связавшиеся с искомым пептидом антитела выявляют с помощью пероксидазных конъюгатов антител против суммарных IgG мыши или кролика с последующим их окрашиванием. Иммуноблоттинг специфического связывания пептида-иммуномиметика представлен на фиг.3, где I – связывание с моноклональными антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена, II – связывание с моноспецифическими поликлональными антителами против бензо[]пирена, III – связывание с моноспецифическими поликлональными антителами против бенз[]антрацена; 0 – связывание pIII белка нативного фага M13mp8 с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена; 1 – связывание пептида-иммуномиметика в составе pIII белка с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена.

Пример 3. Исследование полученного пептида-иммуномиметика на способность индуцировать образование антител против бензо[]пирена in vivo.

Три группы мышей линии ICR иммунизируют внутрибрюшинно тремя разными антигенами (конъюгатом бензо[]пирен-БСА, нативным фагом M13mp8 и пептидом-иммуномиметиком в составе pIII белка фага) трижды через каждые 2 недели. Первую иммунизацию проводят антигеном в смеси с полным адъювантом Фрейнда, последующие – антигеном с неполным адъювантом Фрейнда. Сыворотку крови мышей тестируют в ИФА на наличие специфических антител через 3 дня после заключительной иммунизации. Для этого лунки полистирольных планшетов сенсибилизируют конъюгатом бензо[]пирен-БСА (5 мкг/мл), разведенным в подщелаченной воде. Блокируют и инкубируют с образцами сывороток крови иммунизированных мышей. Связавшиеся антитела выявляют пероксидазным конъюгатом антител кролика против суммарных Ig мыши. Результаты ИФА сыворотки крови на наличие антител к бензо[]пирену представлены на фиг.4, где по оси абсцисс – разведение сыворотки, а по оси ординат – оптическая плотность (OD 350); кривая 1 – иммунизация нативным фагом M13mp8 (отрицательный контроль); кривая 2 – иммунизация пептидом-иммуномиметиком в составе pIII белка фага; кривая 3 – иммунизация бензо[]пирен-БСА (положительный контроль).

Таким образом, получен специфический пептид-иммуномиметик химических канцерогенов, специфически взаимодействующий с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена и способный индуцировать образование антител против бензо[]пирена после иммунизации in vivo. Такой пептид-иммуномиметик может быть успешно использован в качестве гаптен-специфического компонента в методах иммуноанализа антител, специфичных к химическим канцерогенам. Замена конъюгата канцероген-белок на пептид-иммуномиметик исключает потенциальную канцерогенную угрозу при производстве и использовании аналитических тест-систем. На основе пептидов-иммуномиметиков возможно также создание комплексов с известными иммуномодуляторами (адъювантами), которые разрешены для клинического применения с целью усиления иммунного ответа на химические канцерогены (образования антител против химических канцерогенов), т.е. для иммунопрофилактики злокачественных новообразований у человека.

Источники информации

1. Curtis G.L., Ryan W.Z., Stenback F. Antibody stimulation of benzo[]pyrene carcinogenesis. Cancer Lett. 1978, v.4: p.223-228.

2. Moolten F.L., Schreiber В., Rizzone A. Protection of mice against 7.12-dimethylbenz()antracene-induced skin tumors by immunization with a fluorinated asnalog of carcinogen. Cancer Res. 1981, v.41: p.452-459.

3. Chagnaud J.L., Faiderbe S., Geffard M. Effects of a monoclonal anti-idiotypie antybody, internal image of benzo()pyrene, on rat sarcomas. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie. 1993, v.316: p.1266-1269.

4. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science. 1990, v.249: p.386-390.

5. Kretz K., Callen W., Hedden V. Cycle sequencing. Methods of Enzimology. V.154: p.527-536.

6. Патент РФ 2141114 «Способ получения конъюгата гаптен-белок», кл. G01N 33/50, авторы: Костянко М.В., Глушков А.Н, опубл. 10.11.1999.

7. Kohler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. 1975. Nature. 256: p.495-497.

8. Glushkov A.N., Kostyanko M.V., Anosova T.P., Polenok E.G., Mun S.A., Anosov M.P., Cherno S.V. Immunological images of polycyclic aromatic hydrocarbons. Experimental neology. 2006. V.28: p.93-176.

9. Brian K.Kay, Jeremy Kasanov, Montarop Yamabhai. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 2001. V.24: p.240-246.

Формула изобретения

Пептид-иммуномиметик химических канцерогенов, полученный из фаговой пептидной библиотеки, имеющий молекулярную массу около 1,3 кДа, обладающий способностью специфически взаимодействовать с антителами против бензо[]пирена и бенз[]антрацена, имеющий аминокислотную последовательность LHLPHHDGVGWG, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.

РИСУНКИ