Патент на изобретение №2356909

(54) БЕЛКОВЫЙ КОМПЛЕКС, ПОЛУЧЕННЫЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФРАГМЕНТА ИММУНОГЛОБУЛИНА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКОГО КОМПЛЕКСА

(57) Реферат:

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описан физиологически активный белковый конъюгат. Белковый конъюгат включает физиологически активный полипептид, ковалентно связанный с Fc-фрагментом иммуноглобулина посредством полиэтиленгликоля. Раскрыт способ получения белкового конъюгата. Использование изобретения обеспечивает повышенную физиологическую активность in vivo конструкции по сравнению с нативным физиологически активным полипептидом и увеличение времени полужизни в сыворотке физиологически активного полипептида с минимальным риском индуцирования нежелательных иммунных ответов. Это может быть найти применение при изготовлении различных полипептидных лекарственных препаратов пролонгированного действия. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 19 ил.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к белковому конъюгату, содержащему физиологически активный полипептид, не-пептидный полимер и Fc-фрагмент иммуноглобулина, которые являются ковалентно связанными и обладают более продолжительным физиологическим действием по сравнению с нативной формой.

Предшествующий уровень техники

Поскольку полипептиды легко денатурируют, что обусловлено их низкой стабильностью, расщепляются протеолитическими ферментами крови и свободно проходят через почки или печень, то лекарственные препараты на основе белка, содержащие такие полипептиды в качестве фармацевтически эффективных компонентов, должны часто вводиться пациентам для поддержания желаемого уровня концентраций и титров в крови. Однако такое частое введение белковых лекарственных препаратов, особенно путем инъекции, вызывает боли у пациентов. Для решения этих трудностей было предпринято множество попыток повысить стабильность белковых лекарственных средств в сыворотке и добиться поддержания высоких уровней лекарственных средств в крови в течение длительного периода времени и таким образом максимально повысить фармацевтическую эффективность этих лекарственных средств. Поэтому возникла необходимость в получении фармацевтических композиций с пролонгированной активностью, которые обеспечивали бы высокую стабильность белковых лекарственных средств и поддержание их титров на достаточно высоких уровнях, не вызывая, при этом, нежелательных иммунных ответов у пациентов.

Для стабилизации белков и предотвращения их ферментативного разложения и выведения почками обычно, в целях химической модификации поверхности белкового лекарственного средства, используют полимер, обладающий высокой растворимостью, такой как полиэтиленгликоль (далее называемый просто PEG). PEG, благодаря своему связыванию со специфическими или различными областями белка-мишени, стабилизирует белок и предотвращает его гидролиз, не вызывая, при этом серьезных побочных эффектов (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139, 1991). Однако это присоединение PEG, несмотря на его способность повышать стабильность белка, связано с такими проблемами, как значительное снижение титров физиологически активных белков. Кроме того, с увеличением молекулярной массы PEG уменьшается выход белка, что обусловлено снижением реакционной способности белков.

Недавно в качестве лекарственного препарата были предложены полимербелковые конъюгаты. Так, например, в патенте США 5738846 описано, что для повышения активности белкового лекарственного средства, конъюгат может быть получен путем присоединения идентичных белковых лекарственных средств к обоим концам PEG. Кроме того, как описано в публикации Международной патентной заявки WO 92/16221, к обоим концам PEG могут быть присоединены два различных белковых лекарственных средства с получением конъюгата, обладающего двумя различными активностями. Однако вышеуказанные методы оказались не очень эффективными для сохранения уровня активности белковых лекарственных средств.

С другой стороны, в работе Kinstler et al. сообщалось, что гибридный белок, полученный путем связывания гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) с человеческим альбумином, обладает более высокой стабильностью (Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12):1883-1888, 1995). Однако в этой публикации указывалось, что поскольку модифицированное лекарственное средство, имеющее структуру G-CSF-PEG-альбумин, обнаруживает примерно только четырехкратное увеличение времени его пребывания в организме и лишь небольшое увеличение времени полужизни в сыворотке, по сравнению с нативным G-CSF, то промышленное производство такого лекарственного средства в качестве эффективного белкового препарата пролонгированного действия не является целесообразным.

Альтернативный метод повышения in vivo стабильности физиологически активных белков предусматривает присоединение гена физиологически активного белка к гену, кодирующему белок, обладающий высокой стабильностью в сыворотке, посредством методов генетической рекомбинации, и культивирование клеток, трансфецированных таким рекомбинантным геном, с получением гибридного белка. Так, например, гибридный белок может быть получен путем конъюгирования альбумина, белка, который, как известно, является наиболее эффективным для повышения стабильности белка, или его фрагмента, с интересующим физиологически активным белком посредством генетической рекомбинации (публикация Международной патентной заявки WO 93/15199 и WO 93/15200, публикация Европейской патентной заявки 413622). Время полужизни гибридного белка интерферона-альфа и альбумина, полученного компанией Human Genome Science Company и поставляемого под торговым знаком Albuferon^TM, было увеличено с 5 часов до 93 часов у обезьян, однако проблема заключается в том, что такое увеличение времени полужизни приводило к снижению активности in vivo до менее чем 5% по сравнению с немодифицированным интерфероном-альфа (Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2):540-548, 2002).

С другой стороны, иммуноглобулин (Ig) состоит, в основном, из двух областей: Fab-фрагмента с антигенсвязывающим сайтом, и Fc-фрагмента с комплементсвязывающим сайтом. Были предприняты и другие попытки присоединения белкового лекарственного средства к Fc-фрагменту иммуноглобулина посредством генетической рекомбинации. Так, например, интерферон (публикация выложенной корейской патентной заявки 2003-9464) и рецептор интерлейкина-4, рецептор интерлейкина-7 или рецептор эритропоэтина (ЕРО) (Корейский патент, регистрационный номер 249572) были предварительно экспрессированы у млекопитающих в форме гибрида с Fc-фрагментом иммуноглобулина. В публикации Международной патентной заявки WO 01/03737 описан гибридный белок, содержащий цитокин или фактор роста, связанные с Fc-фрагментом иммуноглобулина посредством олигопептидного линкера.

Кроме того, в патенте США 5116964 описан LHR (лимфоцитарный гликопротеин клеточной поверхности) или белок CD4, присоединенный к амино-концу или к карбокси-концу Fc-фрагмента иммуноглобулина посредством генетической рекомбинации, а в патенте США 5349053 описан гибридный белок IL-2 и Fc-фрагмента иммуноглобулина. Другими примерами Fc-гибридных белков, полученных посредством генетической рекомбинации, являются гибридный белок интерферона-бета или его производного и Fc-фрагмента иммуноглобулина (публикация Международной патентной заявки WO 00/23472), гибридный белок рецептора IL-5 и Fc-фрагмента иммуноглобулина (патент США 5712121), гибридный белок интерферона-альфа и Fc-фрагмента иммуноглобулина G4 (патент США 5723125), и гибрид белка CD4 и Fc-фрагмента иммуноглобулина G2 (патент США 6451313). Кроме того, как описано в патенте США 5605690, Fc-вариант, имеющий аминокислотные альтерации, а в частности, в комплементсвязывающем сайте или в сайте связывания с рецептором, может быть присоединен к рецептору TNF с помощью техники рекомбинантных ДНК с получением гибридного белка TNFR-Fc-фрагмент IgG1. Так, например, способы получения Fc-гибридного белка с использованием Fc-фрагмента иммуноглобулина, модифицированного посредством генетической рекомбинации, описаны в патентах США 6277375, 6410008 и 6444792.

В патенте США 6660843 описан способ получения конъюгата, содержащего нужный белок, присоединенный к Fc-фрагмента иммуноглобулина посредством линкера, в E.coli путем генетической рекомбинации. Этот метод позволяет получить конъюгат с меньшими экономическими затратами, чем это может быть осуществлено с использованием экспрессионных систем млекопитающих, и дает возможность получить конъюгат в агликозилированной форме. Однако, если нужный белок и Fc-фрагмент иммуноглобулина продуцируются вместе в E.coli, и если этот белок является, по своей природе, гликозилированным, то использование такого целевого белка в указанном методе является проблематичным. Применение этого метода связано и с другой проблемой, которая заключается в том, что экспрессия конъюгата в виде телец включения приводит к образованию в высокой степени неправильной укладки.

Однако такие Fc-гибридные белки, продуцированные посредством генетической рекомбинации, имеют следующие недостатки: такой гибридный белок присутствует только в специфической области Fc-фрагмента иммуноглобулина, которая расположена у амино- или у карбокси-конца; продуцируются лишь гомодимерные, а не мономерные формы этого белка; и такой гибрид может находиться только между гликозилированными белками или между агликозилированными белками, и невозможно получить такой гибридный белок, который состоял бы из гликозилированного белка и агликозилированного белка. Кроме того, новая аминокислотная последовательность, созданная путем слияния, может индуцировать иммунные ответы, а линкерная область может оказаться восприимчивой к протеолитическому расщеплению.

С другой стороны, что касается получения гибридных белков с использованием Fc-фрагмента иммуноглобулина, то каких-либо сообщений о получении конъюгата, содержащего целевой белок, связанный с человеческим нативным Fc-фрагментом посредством сшивающего агента, пока еще не было. Получение конъюгата с использованием линкера имеет то преимущество, что оно облегчает выбор и регуляцию линкерных сайтов, а также позволяет обеспечивать соответствующую ориентацию двух связанных друг с другом белков и осуществлять экспрессию с образованием мономера, димера или мультимера, а также получать гомологичные или гетерогенные конструкции. Fc-фрагмент иммуноглобулина может быть продуцирован методом рекомбинантных ДНК с использованием клеток млекопитающих или E.coli. Однако до настоящего времени не появлялось каких-либо сообщений о нативном Fc-фрагменте иммуноглобулина, который был бы отдельно продуцирован в массовом масштабе и с высокими выходами в E.coli и который можно было бы использовать для получения препаратов пролонгированного действия. Кроме того, до настоящего времени также не предпринималось каких-либо попыток получения конъюгата, содержащего нужный белок, присоединенный к такому происходящему от E.coli Fc-фрагменту иммуноглобулина, продуцированному методами рекомбинантных ДНК, с использованием сшивающего агента.

С другой стороны, иммуноглобулины обладают функциями антитела, такими как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимая цитотоксичность (CDC), а сахарные группы, присутствующие в Fc-фрагменте иммуноглобулинов, играют важную роль в ADCC- и CDC-эффектах (Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206, 1985). Иммуноглобулины, у которых отсутствуют сахарные группы, имеют время полужизни в сыворотке, аналогичное времени полужизни гликозилированных иммуноглобулинов, но обладают в 10-1000 раз меньшей аффинностью связывания с комплементом и рецептором (Waldmann H., Eur. J. Immunol. 23, 403-411, 1993; Morrison S., J. Immunol. 143, 2595-2601, 1989).

Как описано выше, для связывания полимера с физиологически активным белком могут быть использованы различные методы. Стандартные методы позволяют повысить стабильность полипептидов, но приводят к значительному снижению их активности, либо они позволяют повысить активность полипептидов в ущерб его стабильности. Поэтому необходимо разработать такой способ, который, при минимальном снижении активности белкового лекарственного средства, обеспечивал бы повышение его стабильности.

Поэтому, что привело к настоящему изобретению, были предприняты интенсивные и глубокие исследования, направленные на получение такого белкового лекарственного препарата с пролонгированным действием, которое было бы способно, при минимальном снижении активности, обеспечить повышение стабильности, трудно достижимой стандартными методами, и в результате этих исследований было обнаружено, что белковый конъюгат, полученный путем ковалентного связывания Fc-фрагмента иммуноглобулина, не-пептидного полимера и физиологически активного полипептида, обеспечивает значительное увеличение времени полужизни физиологически активного белка в сыворотке и поддержание более высоких титров, чем известные белковые лекарственные средства.

Описание настоящего изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к белковому конъюгату, который, при минимальном снижении физиологической активности полипептида, обеспечивает увеличение времени полужизни полипептида в сыворотке, что уменьшает риск индуцирования иммунных ответов; и к способу получения такого конъюгата.

Еще одним объектом настоящего изобретения является лекарственный препарат пролонгированного действия, содержащий в качестве эффективного компонента белковый конъюгат с более длительным временем полужизни.

Другим объектом настоящего изобретения является способ увеличения стабильности и продолжительности действия активного полипептида, при минимальном снижении его физиологической активности, путем увеличения времени полужизни данного полипептида в сыворотке.

Краткое описание чертежей

Вышеуказанные и другие объекты, а также отличительные признаки и другие преимущества настоящего изобретения будут более понятны из нижеследующего подробного описания, сопровождаемого чертежами, где:

На фиг.1 представлены результаты хроматографии Fc-фрагмента иммуноглобулина, полученного путем расщепления иммуноглобулина папаином;

На фиг.2 представлены результаты электрофореза в SDS-PAGE очищенного Fc-фрагмента иммуноглобулина (М: маркер молекулярной массы, дорожка 1: IgG; дорожка 2: Fc);

На фиг.3 представлены результаты электрофореза в SDS-PAGE для конъюгатов: (А) IFN-PEG-Fc, (В) ¹⁷Ser-G-CSF-PEG-Fc и (С) ЕРО-PEG-Fc, которые были продуцированы путем реакции связывания (М: маркер молекулярной массы, дорожка 1: Fc, дорожка 2: физиологически активный белок, дорожка 3: конъюгат физиологически активный белок-PEG-Fc);

На фиг.4 представлены результаты вытеснительной хроматографии конъюгата IFN-PEG-Fc, очищенного после реакции связывания;

На фиг.5 представлены результаты масс-спектрометрии MALDI-TOF конъюгата ЕРО-PEG-Fc;

На фиг.6а и 6b представлены результаты масс-спектрометрии MALDI-TOF и SDS-PAGE-анализа, соответственно, нативного Fc-фрагмента иммуноглобулина и дегликозилизованного Fc-фрагмента иммуноглобулина (DG Fc);

На фиг.7 представлены результаты масс-спектрометрии MALDI-TOF конъюгата IFN-PEG-Fc и конъюгата IFN-PEG-DG-Fc;

На фиг.8а-8с представлены результаты обращенно-фазовой ВЭЖХ конъюгатов IFN-PEG-Fc, IFN-PEG-DG-Fc и IFN-PEG-производное Fc-фрагмента рекомбинантного AG;

На фиг.9 представлен график, иллюстрирующий результаты фармакокинетического анализа нативного IFN, комплекса IFN-40К PEG, конъюгата IFN-PEG-альбумина и конъюгата IFN-PEG-Fc;

На фиг.10 представлен график, иллюстрирующий результаты фармакокинетического анализа нативного ЕРО, в высокой степени гликозилированного ЕРО, конъюгата ЕРО-PEG-Fc и конъюгата ЕРО-PEG-AG-Fc;

На фиг.11 представлен график, иллюстрирующий результаты фармакокинетического анализа конъюгатов IFN-PEG-Fc, IFN-PEG-DG-Fc и IFN--PEG-производное рекомбинантного AG-Fc;

На фиг.12 представлен график, иллюстрирующий результаты фармакокинетического анализа Fab’, комплекса Fab’-S-40K-PEG, конъюгата Fab’-N-PEG-N-Fc и конъюгата Fab’-S-PEG-N-Fc;

На фиг.13 представлен график, иллюстрирующий in vivo-активности Fab’, комплекса Fab’-S-40K-PEG, конъюгата Fab’-N-PEG-N-Fc и конъюгата Fab’-S-PEG-N-Fc;

На фиг.14 представлен график, иллюстрирующий результаты сравнения аффинности связывания человеческих иммуноглобулинов подкласса IgG с комплементом C1q;

На фиг.15 представлен график, иллюстрирующий результаты сравнения аффинности связывания гликозилированного Fc, ферментативно дегликозилированного (DG) Fc и конъюгата интерферон-PEG-носитель, где носителем является неглигозилированный (AG) Fc, продуцируемый E.coli, с комплементом C1q.

Наилучшие варианты осуществления изобретения

В одном из аспектов достижения вышеуказанных целей, настоящее изобретение относится к белковому конъюгату, содержащему физиологически активный полипептид, не-пептидный полимер, имеющий реакционно-способные группы по обоим концам, и Fc-фрагмент иммуноглобулина, ковалентно связанные друг с другом.

Используемый здесь термин белковый конъюгат или конъюгат означает один или несколько физиологически активных полипептидов, один или несколько не-пептидных полимеров, имеющих реакционно-способные группы по обоим концам, и один или несколько Fc-фрагментов иммуноглобулина, где указанные три компонента ковалентно связаны друг с другом. Кроме того, в отличие от конъюгата, конструкция, содержащая только две различные молекулы, выбранные из физиологически активного полипептида, не-пептидного полимера и Fc-фрагмента иммуноглобулина, где указанные две молекулы ковалентно связаны друг с другом, называется комплексом.

Белковый конъюгат по настоящему изобретению представляет собой вариант белкового лекарственного средства, который получают так, чтобы он, при минимальном снижении физиологической активности, увеличивал продолжительность действия белкового лекарственного средства in vivo, и который получают путем присоединения Fc-фрагмента иммуноглобулина к указанному белковому лекарственному средству.

Fc-фрагмент иммуноглобулина является безопасным для использования в качестве носителя лекарственного средства, поскольку он представляет собой биологически разлагаемый полипептид, который подвергается метаболизму в организме. Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина имеет относительно низкую молекулярную массу по сравнению с целыми молекулами иммуноглобулина, что делает его предпочтительным с точки зрения получения, очистки и выхода конъюгата. Поскольку Fc-фрагмент иммуноглобулина не содержит Fab-фрагмента, аминокислотная последовательность которого отличается от аминокислотных последовательностей антител других подклассов, и который поэтому является в высокой степени негомогенным, то этот Fc-фрагмент может значительно повышать степень гомогенности веществ и является менее антигенным.

Используемый здесь термин Fc-фрагмент иммуноглобулина означает белок, который содержит константную область 2 тяжелой цепи (С_Н2) и константную область 3 тяжелой цепи (С_Н3) иммуноглобулина, и не содержит вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, константной области 1 тяжелой цепи (С_Н1) и константной области 1 легкой цепи (С_L1) иммуноглобулина. Кроме того, он может содержать шарнирную область в константной области тяжелой цепи. Fc-фрагмент иммуноглобулина настоящего изобретения может также содержать часть константной области 1 тяжелой цепи (С_Н1) или всю эту область, и/или часть константной области 1 легкой цепи (С_L1) или всю эту область, за исключением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Кроме того, в том случае, если Fc-фрагмент иммуноглобулина обладает физиологической функцией, в основном, аналогичной физиологической функции нативного белка, или лучшей физиологической функцией, чем нативный белок, то таким Fc-фрагментом IgG может быть фрагмент, имеющий делецию в относительно длинной части аминокислотной последовательности С_Н2 и/или С_Н3. То есть, Fc-фрагмент иммуноглобулина настоящего изобретения может содержать (1) домен С_Н1, домен С_Н2, домен С_Н3 и домен С_Н4, (2) домен С_Н1 и домен С_Н2, (3) домен С_Н1 и домен С_Н3, (4) домен С_Н2 и домен С_Н3, (5) комбинацию одного или нескольких доменов и шарнирной области иммуноглобулина (или части такой шарнирной области), и (6) димер каждого из этих доменов константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи.

Fc-фрагмент иммуноглобулина настоящего изобретения включает нативную аминокислотную последовательность и производные этой последовательности (мутанты). Производной аминокислотной последовательностью является последовательность, отличающаяся от нативной аминокислотной последовательности тем, что она включает делецию, инсерцию, не-консервативную или консервативную замену одного или нескольких аминокислотных остатков или их комбинации. Так, например, в Fc IgG, аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, которые, как известно, играют важную роль в связывании, могут быть использованы в качестве подходящей мишени для модификации. Кроме того, могут быть использованы и другие различные производные, включая производные, в которых либо делетирована область, способная образовывать дисульфидную связь, либо элиминированы некоторые аминокислотные остатки, которые обычно присутствуют у N-конца нативной Fc-формы, либо добавлен метиониновый остаток. Кроме того, для ингибирования эффекторных функций может быть осуществлена делеция в комплементсвязывающем сайте, таком как C1q-связывающий сайт и ADCC-сайт. Методы получения таких производных последовательностей Fc-фрагмента иммуноглобулина описаны в публикациях Международных патентных заявок WO 97/34631 и WO 96/32478.

Аминокислотные замены в белках и пептидах, которые, в основном, не влияют на активность таких белков или пептидов, известны специалистам (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly, и наоборот.

Кроме того, Fc-фрагмент, если это необходимо, может быть модифицирован путем фосфорилирования, сульфирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и тому подобное.

Вышеупомянутыми производными Fc являются производные, которые обладают биологической активностью, идентичной активности Fc-фрагмента настоящего изобретения, или обладают повышенной структурной устойчивостью, например, к нагреванию, к изменению рН, или т.п.

Кроме того, эти Fc-фрагменты могут быть получены из нативных форм, выделенных у человека и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомячков, крыс и морских свинок, либо они могут быть их рекомбинантами или производными, полученными из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. В соответствии с настоящим изобретением, они могут быть получены из нативного иммуноглобулина путем выделения целых иммуноглобулинов из организма человека или животного, и их обработки протеолитическим ферментом. Папаин гидролизует нативный иммуноглобулин на Fab- и Fc-фрагменты, а обработка пепсином приводит к продуцированию pF’c- и F(ab’)₂-фрагментов. Эти фрагменты могут быть подвергнуты, например, вытеснительной хроматографии для выделения Fc или pF’c.

Человеческим Fc-фрагментом, предпочтительно, является рекомбинантный Fc-фрагмент иммуноглобулина, полученный из микроорганизма.

Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина настоящего изобретения может присутствовать в форме, имеющей обычно присущее ей число сахарных цепей, или в форме, имеющей повышенное число сахарных цепей по сравнению с нативной формой или пониженное число сахарных цепей по сравнению с нативной формой, либо он может присутствовать в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление сахарных цепей Fc-фрагмента иммуноглобулина может быть достигнуто методами, известными специалистам, такими как химический метод, ферментативный метод и метод генной инженерии с использованием микроорганизма. Удаление сахарных цепей из Fc-фрагмента приводит к резкому снижению аффинности связывания с C1q-частью первого компонента комплемента С1, а также к снижению или к потере антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), не индуцируя, при этом, нежелательных иммунных ответов in vivo. В этой связи следует отметить, что Fc-фрагмент иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может оказаться более подходящим для использования в настоящем изобретении в качестве носителя лекарственного средства.

Используемый здесь термин дегликозилирование означает ферментативное удаление сахарных групп из Fc-фрагмента, а термин агликозилирование означает, что Fc-фрагмент был продуцирован в негликозилированной форме прокариотом, предпочтительно, E.coli.

С другой стороны, Fc-фрагмент иммуноглобулина может быть выделен у человека или других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомячков, крыс и морских свинок, и предпочтительно, от человека. Кроме того, Fc-фрагментом иммуноглобулина может быть Fc-фрагмент IgG, IgA, IgD, IgE и IgM их комбинаций или гибридов. Предпочтительно, если этот Fc-фрагмент является Fc-фрагментом иммуноглобулинов IgG или IgM, которые, среди прочих белков, присутствуют в наибольшем количестве в крови человека, и, наиболее предпочтительно, если он является Fc-фрагментом IgG, который, как известно, увеличивает время полужизни связывающихся с лигандом белков.

С другой стороны, используемый здесь термин комбинация означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные Fc-области иммуноглобулина того же самого происхождения, присоединены к одноцепочечному полипептиду другого происхождения и образуют димер или мультимер. То есть, димер или мультимер могут быть образованы из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из Fc-фрагментов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Используемый здесь термин гибрид означает, что последовательности, кодирующие два или более Fc-фрагментов иммуноглобулина различного происхождения, присутствуют в одноцепочечном Fc-фрагменте иммуноглобулина. В настоящем изобретении могут быть использованы различные типы гибридов. То есть, гибриды доменов могут состоять из одного-четырех доменов, выбранных из группы, включающей СН1, СН2, СН3 и СН4 Fc-фрагментов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и могут включать шарнирную область.

С другой стороны, IgG подразделяется на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение включает их комбинации и гибриды. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4, а наиболее предпочтительным является Fc-фрагмент IgG4, который редко обладает эффекторными функциями, такими как CDC (комплементзависимая цитотоксичность)(см, фиг. 14 и 15).

Таким образом, в качестве носителя лекарственного средства настоящего изобретения, наиболее предпочтительным Fc-фрагментом иммуноглобулина является негликозилированный Fc-фрагмент человеческого IgG4. Человеческий Fc-фрагмент является более предпочтительным, чем Fc-фрагмент другого источника, который может действовать в организме человека как антиген и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как вырабатывание нового антитела против антигена.

Настоящее изобретение отличается тем, что в нем Fc-фрагмент иммуноглобулина и белковое лекарственное средство связаны друг с другом в виде не-пептидного полимера.

Используемый здесь термин не-пептидный полимер означает биологически совместимый полимер, включающий два или более повторяющихся звена, связанных друг с другом ковалентной связью, за исключением пептидной связи.

Не-пептидный полимер, подходящий для использования по настоящему изобретению, может быть выбран из группы, включающей полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированные полиолы, поливиниловый спирт, полисахариды, декстран, поливинилэтиловый эфир, биологически разлагаемые полимеры, такие как PLA (поли(молочная кислота)) и PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислоты), липидные полимеры, хитины, гиалуроновую кислоту и их комбинации. Наиболее предпочтительным является полиэтиленгликоль (PEG). Его производные также хорошо известны и могут быть легко получены любым специалистам, и такие производные входят в объем настоящего изобретения. Молекулярная масса не-пептидного полимера, предпочтительно, составляет от 1 до 100 кДа, а более предпочтительно, от 1 до 20 кДа. Кроме того, не-пептидным полимером настоящего изобретения, связанным с Fc-фрагментом иммуноглобулина, может быть один полимер или комбинация полимеров различных типов.

Не-пептидный полимер, используемый в настоящем изобретении, имеет реакционно-способную группу, которая может связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулина и белковым лекарственным средством.

Не-пептидный полимер имеет реакционно-способную группу у обоих концов, которая предпочтительно выбрана из группы, состоящей из реакционно-способной альдегидной группы, пропионилальдегидной группы, бутилальдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного. Таким сукцинимидным производным могут быть сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат. В частности, если такой не-пептидный полимер имеет реакционно-способную альдегидную группу по обоим концам, то он эффективно связывается по обоим концам с физиологически активным полипептидом и с Fc-фрагментом иммуноглобулина, продуцируя, при этом, лишь минимальные неспецифические реакции. Конечный продукт, продуцированный путем восстановительного алкилирования посредством альдегидной связи, является гораздо более стабильным, чем продукт, полученный с использованием амидной связи.

Реакционно-способные группы по обоим концам не-пептидного полимера могут быть одинаковыми или различными. Так, например, не-пептидный полимер на одном своем конце может иметь малеимидную группу, а на другом конце – альдегидную группу, пропионилальдегидную группу или бутилальдегидную группу. Если полиэтиленгликоль (PEG), имеющий реакционно-способную гидроксигруппу по обоим концам, используется в качестве не-пептидного полимера, то такая гидроксигруппа может быть активирована различными реакционно-способными группами путем проведения известных химических реакций, либо для получения белкового конъюгата настоящего изобретения может быть использован коммерчески доступный PEG, имеющий модифицированную реакционно-способную группу.

С другой стороны, в настоящем изобретении, комплекс Fc-фрагмента иммуноглобулина и не-пептидного полимера присоединяют к физиологически активному полипептиду с образованием белкового конъюгата.

Используемые здесь термины физиологически активный полипептид, физиологически активный белок, активный полипептид, полипептидное лекарственное средство или белковое лекарственное средство являются взаимозаменяемыми, и отличаются тем, что присутствуя в физиологически активной форме, они обладают различными физиологическими функциями in vivo.

Недостатком белкового лекарственного средства является отсутствие способности поддерживать физиологическое действие в течение длительного периода времени, что обусловлено присущим ему свойством легко денатурироваться или разлагаться под действием протеолитических ферментов, присутствующих в организме. Однако, если полипептидное лекарственное средство присоединяют к Fc-фрагменту иммуноглобулина по настоящему изобретению с образованием конъюгата, то такое лекарственное средство обладает повышенной структурной стабильностью и увеличенным временем полужизни до разложения. Кроме того, полипептид, конъюгированный с Fc-фрагментом, менее подвержен снижению физиологической активности, чем другие известные полипептидные лекарственные препараты. Поэтому, по сравнению с биологической доступностью in vivo стандартных полипептидных лекарственных средств, конъюгат по настоящему изобретению, состоящий из полипептида и Fc-фрагмента иммуноглобулина, отличается тем, что он обладает значительно лучшей биологической доступностью in vivo. Это также наглядно проиллюстрировано в описании вариантов осуществления изобретения. То есть, при связывании с Fc-фрагментом иммуноглобулина по настоящему изобретению, лекарственные средства на основе IFN, G-CSF, hGH и других белков обнаруживают примерно 2-6-кратное увеличение биологической доступности in vivo по сравнению с их стандартными формами, конъюгированными с одним PEG или с PEG и альбумином (таблицы 8, 9 и 10).

С другой стороны, конъюгат белка и Fc-фрагмента иммуноглобулина по настоящему изобретению отличается тем, что он не является гибридом, полученным стандартным рекомбинантным методом. В рекомбинантном методе, гибридную форму Fc-фрагмента иммуноглобулина и активного полипептида, используемого в качестве лекарственного средства, получают так, чтобы указанный полипептид был присоединен к N-концу или С-концу Fc-фрагмента, в результате чего он экспрессируется и подвергается укладке как один полипептид, продуцируемый из нуклеотидной последовательности, кодирующей его гибридную форму.

Это приводит к резкому снижению активности полученного гибридного белка, поскольку активность белка, как физиологически функционального вещества, определяется конформацией этого белка. Таким образом, при присоединении полипептидного лекарственного средства к Fc-фрагменту рекомбинантным методом, не наблюдается какого-либо влияния на биологическую доступность in vivo, даже если этот гибридный белок имеет повышенную структурную стабильность. Кроме того, поскольку такой гибридный белок часто имеет неправильную укладку, а поэтому экспрессируется в виде телец включения, то такой метод присоединения, применяемый для получения белка и его выделения, является экономически невыгодным. Кроме того, если активная форма полипептида является гликозилированной, то такой полипептид должен экспрессироваться в эукариотических клетках. В этом случае, Fc также является гликозилированным, и такое гликозилирование может индуцировать нежелательные иммунные ответы in vivo.

Таким образом, лишь применение настоящего изобретения позволяет получить конъюгат глигозилированного активного полипептида и агликозилированного Fc-фрагмента иммуноглобулина, и позволяет решить все вышеуказанные проблемы, включая увеличение выхода белка, поскольку два компонента этого комплекса получают отдельно и выделяют с использованием самых эффективных систем.

С другой стороны, физиологически активным полипептидом, используемым в данном белковом конъюгате, являются, например, гормоны, цитокины, интерлейкины, белки, связывающиеся с интерлейкином, ферменты, антитела, факторы роста, факторы регуляции транскрипции, факторы свертывания крови, вакцины, структурные белки, белки или рецепторы лигандов, антигены клеточной поверхности, антагонисты рецепторов и их производные.

Более конкретно, неограничивающими примерами физиологически активного полипептида является человеческий гормон роста, релизинг-фактор гормона роста, пептид, высвобождающий гормон роста, интерфероны и рецепторы интерферона (например, интерферон-, – и –, водорастворимый рецептор интерферона 1 и т.п.), колониестимулирующие факторы, интерлейкины (например, интерлейкин-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 и т.п.) и рецепторы интерлейкина (например, рецептор IL-1, рецептор IL-4 и т.п.), ферменты (например, глюкоцереброзидаза, идуронат-2-сульфатаза, альфа-галактозидаза-А, альфа-L-идуронидаза, бутирилхолинэстераза, хитиназа, глутамат-декарбоксилаза, имиглюцераза, липаза, уриказа, ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов, нейтральная эндопептидаза, миелопероксидаза и т.п.), интерлейкин- и цитокинсвязывающие белки (например, IL-18bp, TNF-связывающий белок и т.п.), фактор активации макрофагов, пептид макрофага, В-клеточный фактор, Т-клеточный фактор, белок А, ингибитор аллергии, гликопротеины некроза клеток, иммунотоксин, лимофтоксин, фактор некроза опухоли, супрессоры опухолей, метастатический фактор роста, антитрипсин альфа-1, альбумин, альфа-лактальбумин, аполипопротеин-Е, эритропоэтин, высокогликозилированный эритропоэтин, ангиопоэтины, гемоглобин, тромбин, пептид, активирующий рецептор тромбина, тромбомодулин, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор IX, фактор XIII, фактор активации плазминогена, фибринсвязывающий пептид, урокиназа, стрептокиназа, гирудин, белок С, С-реактивный белок, ингибитор ренина, ингибитор коллагеназы, супероксиддисмутаза, лептин, тромбоцитарный фактор роста, эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, ангиостатин, ангиотензин, фактор роста костей, белок, стимулирующий рост костей, кальцитонин, инсулин, атриопептин, фактор, индуцирующий образование хряща, элкатонин, фактор активации соединительной ткани, ингибитор пути тканевого фактора, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, фактор высвобождения лютеинизирующего гормона, факторы роста нервной ткани (например, фактор роста нервной ткани, цилиарный нейротропный фактор, фактор-1 аксогенеза, глюкагонподобные пептиды (например, GLP-1 и т.п.), натрийуретический пептид головного мозга, глиальный нейротропный фактор, нетрин, ингибитор нейтрофилов, нейротропный фактор, нейтурин и т.п.), паратиреоидный гормон, релаксин, секретин, соматомедин, инсулинподобный фактор роста, адренокортикоидный гормон, глюкагон, холецистокинин, панкреатический полипептид, пептид высвобождения гастрина, релизинг-фактор кортикотропина, тиреоидстимулирующий гормон, аутотаксин, лактоферрин, миостатин, рецепторы (например, TNFR(Р75), TNFR(Р55), рецептор IL-1, рецептор VEGF, рецептор фактора активации В-клеток и т.п.), антагонисты рецепторов (например, IL-1-Ra и т.п.), антигены клеточной поверхности (например, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11а, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 и т.п.), моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)₂ и Fd) и антигены вирусных вакцин).

В частности, предпочтительными физиологически активными полипептидами являются полипептиды, требующие частого введения в организм пациента для лечения или предупреждения заболеваний, и такими полипептидами являются человеческий гормон роста, интерфероны (интерферон-, – и –,), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин (ЕРО) и фрагменты антител. Наиболее предпочтительным полипептидным лекарственным средством является интерферон-альфа. Кроме того, в объем физиологически активных пептидов настоящего изобретения входят некоторые производные, при условии, что, по сравнению с нативными формами физиологически активных полипептидов, они имеют, в основном, аналогичные или улучшенные функции, структуры, активность и стабильность.

В соответствии с настоящим изобретением, фрагментами антитела могут быть фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fd или scFv, способные связываться со специфическим антигеном, а предпочтительно, фрагмент Fab’. Fab-фрагменты содержат вариабельный домен (V_L) и константный домен (С_L) легкой цепи и вариабельный домен (V_Н) и первый константный домен (С_Н1) тяжелой цепи. Fab’-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что они содержат несколько дополнительных аминокислотных остатков, включая один или несколько цистеиновых остатков шарнирной области со стороны карбокси-конца С_Н1-домена. Fd-фрагменты содержат только V_Н– и С_Н1-домены, а F(ab’)₂-фрагменты продуцируются в виде пары Fab’-фрагментов, образуемых либо посредством дисульфидной связи, либо посредством химической реакции. оцFv-фрагменты (одноцепочечные Fv-фрагменты) содержат домены V_L и V_Н, которые связаны друг с другом посредством пептидного линкера, а поэтому присутствуют в одной полипептидной цепи.

С другой стороны, если Fc-фрагмент иммуноглобулина и белковое лекарственное средство связаны друг с другом посредством не-пептидного полимера, то сайты связывания Fc-фрагмента иммуноглобулина включают одну или несколько свободных реакционно-способных групп аминокислотных остатков, присутствующих в шарнирной области или в константной области. Предпочтительно, чтобы константная область Fc иммуноглобулина и белковое лекарственное средство были ковалентно связаны у амино-конца, а именно, чтобы аминогруппа лизинового остатка, аминогруппа гистидинового остатка или свободный цистеиновый остаток были присоединены к реакционно-способной группе на соответствующих концах не-пептидного полимера.

Белковый конъюгат настоящего изобретения может включать одну или несколько структурных единиц физиологически активный полипептид – не-пептидный полимер – Fc-фрагмент иммуноглобулина, где все компоненты последовательно связаны ковалентной связью. Поскольку не-пептидный полимер имеет на обоих концах реакционно-способную группу, то он присоединяется к физиологически активному полипептиду и Fc-фрагменту иммуноглобулина посредством ковалентной связи. То есть, к одному Fc-фрагменту иммуноглобулина посредством ковалентной связи могут быть присоединены один или несколько комплексов не-пептидного полимера с физиологически активным полипептидом, и таким образом, благодаря присоединению Fc-фрагмента иммуноглобулина может быть образован мономер, димер или мультимер физиологически активного полипептида, что обеспечивает более эффективное повышение in vivo активности и стабильности.

В белковом конъюгате настоящего изобретения, физиологически активный белок может быть связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина в различных молярных отношениях.

Кроме того, поскольку хорошо известно, что если два различных белка связаны друг с другом посредством олигопептида, то имеется риск, что аминокислотная последовательность, созданная на участке стыка, будет индуцировать иммунные ответы, а сайты связывания белков будут ограничены N-концом и С-концом. В отличие от этого, поскольку конъюгат белка настоящего изобретения получают с использованием биологически совместимого не-пептидного полимера, то его преимущество заключается в том, что он не продуцирует побочных эффектов, таких как токсичность, и не индуцирует иммунного ответа, что позволяет получить различные белковые конъюгаты благодаря разнообразию сайтов связывания.

Кроме того, применение стандартного метода прямого присоединения Fc-фрагмента иммуноглобулина к активному белку посредством генетической рекомбинации является проблематичным, поскольку такое присоединение происходит только в концевой последовательности Fc-фрагмента иммуноглобулина, используемого в качестве партнера по связыванию, и поскольку выход гибридного белка является ограниченным, так как его продуцирование зависит от клеточной культуры животных. Применение стандартного метода сталкивается и с другими проблемами, заключающимися в том, что активность белка может снижаться из-за не-природного гликозилирования, из-за невыполнения требования абсолютно точной укладки белка, и из-за возможности продуцирования данного гибридного белка в гомодимерной форме. В частности, при продуцировании конъюгатов в E.coli, нерастворимые конъюгаты с неправильной укладкой трудно поддаются удалению. В противоположность этому, белковый конъюгат настоящего изобретения может обеспечивать гораздо более длительное действие и гораздо более высокую стабильность, не вызывая, при этом, каких-либо негативных эффектов, и является предпочтительным с точки зрения поддержания активности полипептида, что позволяет получить препарат конъюгата, содержащий гликозилированный терапевтический белок, связанный с негликозилированным Fc.

С другой стороны, использование низкомолекулярных химических связующих агентов, таких как карбодиимид или глутаральдегид, сталкивается со следующими проблемами: они одновременно связываются с несколькими сайтами на белке, индуцируя, при этом, денатурацию белка и его неспецифическое связывание, что затрудняет регуляцию линкерных сайтов или очистку связанного белка. В противоположность этому, белковый конъюгат настоящего изобретения, благодаря использованию в нем не-пептидного полимера, способствует регуляции сайтов связывания, минимизирует неспецифические реакции и облегчает очистку белка.

Настоящее изобретение более подробно описано на нижеследующих вариантах его осуществления. Белковый конъюгат (полипептид – PEG – Fc) настоящего изобретения, содержащий физиологически активный полипептид и Fc-фрагмент иммуноглобулина, каждый из которых связан с концом PEG, обладает гораздо большей стабильностью, чем комплекс полипептид – PEG или конъюгат полипептид -PEG – альбумин. Фармакокинетический анализ выявил, что при связывании с 40 кДа-PEG (комплекс IFN-40 К-PEG) время полужизни IFN в сыворотке примерно в 20 раз выше, чем у нативного IFN, а в конъюгате IFN-PEG-альбумин, это время полужизни примерно в 10 раз выше, чем у нативного IFN. В отличие от этого, конъюгат IFN-PEG-Fc настоящего изобретения дает увеличение времени полужизни примерно в 50 раз (см. таблицу 3). Кроме того, тот же самый результат наблюдался и с использованием других нужных белков, таких как человеческий гормон роста (hGH), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) и его производное (¹⁷S-G-CSF) или эритропоэтин (ЕРО). Белковые конъюгаты настоящего изобретения, каждый из которых включает нужный белок, связанный с PEG-Fc, дает примерно 10-кратное увеличение среднего времени пребывания в сыворотке (MRT) и времени полужизни в сыворотке по сравнению с нативными формами белков или формами, конъюгированными с PEG или с PEG-альбумином (см. таблицы 4-7).

Кроме того, при связывании комплекса PEG-Fc с группой SH возле С-конца Fab’ или N-конца Fab’, полученный конъюгат Fab’-PEG-Fc обнаруживал в 2 или 3 раза бльшее время полужизни в сыворотке, чем комплекс 40К-PEG-Fab’ (см. фиг.12).

Кроме того, если белковые конъюгаты были получены с использованием дегликозилированного Fc иммуноглобулина (DG Fc), из которого были удалены сахарные группы, и производных рекомбинантного негликозилированного Fc иммуноглобулина (AG Fc), то их время полужизни в плазме и in vitro активность были такими же, как и у белковых конъюгатов, полученных с использованием нативного Fc (см. таблицу 3 и фиг. 8 и 11).

Поэтому, поскольку белковые конъюгаты настоящего изобретения, полученные путем конъюгирования различных физиологически активных полипептидов, включая человеческий гормон роста, интерферон, эритропоэтин, колониестимулирующий фактор или его производные и производные антител, имеют более длительное время полужизни в сыворотке и среднее время пребывания в сыворотке (MRT), то они могут быть использованы для изготовления композиций различных физиологически активных полипептидов пролонгированного действия.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения белкового конъюгата с повышенной продолжительностью жизни in vivo и стабильностью, где указанный способ предусматривает: (а) индуцирование реакции между не-пептидным полимером, имеющим реакционно-способную группу по обоим концам, физиологически активным полипептидом и ковалентно связанным Fc-фрагментом иммуноглобулина; и (b) выделение полученного конъюгата, содержащего физиологически активный полипептид и Fc-фрагмент иммуноглобулина, ковалентно связанные друг с другом у каждого конца не-пептидного полимера.

В стадии (а), ковалентная связь между тремя компонентами осуществляется последовательно или одновременно. Так, например, если физиологически активный полипептид и Fc-фрагмент иммуноглобулина присоединяют у каждого конца не-пептидного полимера, то один из физиологически активного полипептида и Fc-фрагмента иммуноглобулина присоединен к одному концу не-пептидного полимера, а другой присоединен к другому концу этого не-пептидного полимера. Такое последовательное присоединение является предпочтительным для минимизации продуцирования побочных продуктов, не являющихся нужным белковым конъюгатом.

Таким образом, стадия (а) может включать (а1) ковалентное связывание Fc-фрагмента иммуноглобулина или физиологически активного полипептида с одним концом не-пептидного полимера; (а2) выделение комплекса, содержащего Fc-фрагмент иммуноглобулина или физиологически активный полипептид, связанный с не-пептидным полимером, из реакционной смеси; и (а3) ковалентное связывание физиологически активного полипептида или Fc-фрагмента иммуноглобулина с другим концом не-пептидного полимера выделенного комплекса с получением белкового конъюгата, содержащего Fc-фрагмент иммуноглобулина и физиологически активный полипептид, связанные с каждым концом не-пептидного полимера.

В стадии (а1), оптимальное молярное соотношение физиологически активного полипептида и не-пептидного полимера в реакционной смеси может составлять в пределах от 1:2,5 до 1:5, а молярное соотношение Fc-фрагмента иммуноглобулина и не-пептидного полимера в реакционной смеси может составлять в пределах от 1:5 до 1:10.

С другой стороны, в стадии (а3), молярное соотношение комплекса, полученного в стадии (а2), к Fc-фрагменту иммуноглобулина или физиологически активному полипептиду в реакционной смеси может составлять в пределах от 1:0,5 до 1:20, а предпочтительно, от 1:1 до 1:3.

Если это необходимо, то стадии (а1) и (а3) могут быть осуществлены в присутствии восстановителя, выбранного в зависимости от типа реакционно-способных групп, находящихся на обоих концах не-пептидного полимера и участвующих в реакциях стадий (а1) и (а3). Предпочтительными восстановителями могут быть цианоборогидрид натрия (NaCNBH₃), борогидрид натрия, борат диметиламина и борат пиридина.

Принимая во внимание чистоту, требующуюся в стадиях (а2) и (b), а также молекулярную массу и загрузку продуктов, подходящий метод выделения белка может быть выбран из методов, обычно применяемых для выделения белков. Так, например, такими известными методами могут быть вытеснительная хроматография и ионообменная хроматография. Если это необходимо, то для достижения высокой степени очистки может быть использована комбинация различных методов.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для получения физиологически активного полипептида, обладающего более продолжительным действием in vivo и повышенной стабильностью, где указанная композиция включает белковый конъюгат настоящего изобретения в качестве эффективного компонента в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Используемый здесь термин введение означает введение предварительно определенного количества вещества пациенту конкретным подходящим способом. Конъюгат настоящего изобретения может быть введен любым известным способом, при условии, что он обеспечивает его доставку в нужную ткань. Примерами таких способов введения являются, но не ограничиваются ими, внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, чрезкожный, пероральный, местный, интраназальный, интрапульмональный и ректальный способы введения. Однако, поскольку при пероральном введении пептиды подвергаются гидролизу, то активные ингредиенты, входящие в состав композиции для перорального введения, должны иметь покрытие, или они должны быть защищены от их разложения в желудке. Композиция настоящего изобретения может быть, предпочтительно, введена в форме инъекции. Кроме того, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть введена с использованием определенных устройств, способных доставлять активные ингредиенты в клетки-мишени.

Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат настоящего изобретения, может включать фармацевтически приемлемый носитель. Для перорального введения, фармацевтически приемлемый носитель может включать связующие вещества, смачивающие агенты, дезинтерграторы, наполнители, солюбилизаторы, диспергирующие агенты, стабилизаторы, суспендирующие агенты, красители и ароматизаторы. Для инъецируемых препаратов, фармацевтически приемлемый носитель может включать буферные агенты, консерванты, аналгетики, солюбилизаторы, изотонические агенты и стабилизаторы. Для препаратов местного применения, фармацевтически приемлемый носитель может включать основания, наполнители, замасливатели и консерванты. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть получены в виде различных лекарственных форм с использованием вышеуказанных фармацевтически приемлемых носителей. Так, например, для перорального введения, фармацевтическая композиция может быть получена в виде таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов или облаток. Для препаратов, вводимых инъекцией, фармацевтическая композиция может быть получена в виде разовой лекарственной формы, такой как флакон, содержащий лекарственные средства для многократного приема, или ампула для введения одной дозы. Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде растворов, суспензий, таблеток, капсул и препаратов пролонгированного действия.

С другой стороны, примерами носителей, наполнителей и разбавителей, подходящих для приготовления фармацевтических препаратов, являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, ксилит, эритритол, мальтит, крахмал, аравийская камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла. Кроме того, фармацевтические препараты могут включать наполнители, антикоагулянты, замасливатели, увлажнители, отдушки, эмульгаторы и антисептики.

В основном, доза лекарственного средства в комбинации с Fc-фрагментом настоящего изобретения, используемым в качестве носителя, может быть определена в зависимости от нескольких факторов, включая, тип заболевания, подвергаемого лечению, способ введения, возраст, пол и вес пациента, тяжесть заболевания пациента, а также тип лекарственного средства, используемого в качестве активного компонента. Поскольку фармацевтическая композиция настоящего изобретения имеет очень длительное время действия in vivo, то его преимущество заключается в том, что оно не требует частого введения фармацевтических лекарственных средств.

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже описаны примеры, которые приводятся лишь в иллюстративных целях, и не рассматриваются как ограничение объема настоящего изобретения.

Пример 1: Получение конъюгата I IFN-PEG-Fc-фрагмент иммуноглобулина

<Стадия 1> Получение Fc-фрагмента иммуноглобулина с использованием иммуноглобулина

Fc-фрагмент иммуноглобулина получали следующим образом. Аккуратно помешав 200 мг 150 кДа-иммуноглобулина G (IgG)(Green Cross, Korea), растворенного в 10 мМ фосфатного буфера, обрабатывали 2 мг протеолитического фермента папаина (Sigma) при 37°С в течение 2 часов. После ферментативной реакции, регенерированный таким образом Fc-фрагмент иммуноглобулина подвергали хроматографии для очистки на колонке с Superdex, на колонке с белком А и на катионообменной колонке. Более конкретно, реакционный раствор загружали на колонку с Superdex 200 (Pharmacia), уравновешенную 10 мМ натрийфосфатным буфером (PBS, рН 7,3), и колонку элюировали тем же самым буфером со скоростью потока 1 мл/мин. Непрореагировавшие молекулы иммуноглобулина (IgG) и F(ab’)₂, которые имели относительно высокую молекулярную массу, сравнимую с молекулярной массой Fc-фрагмента иммуноглобулина, удаляли благодаря их способности элюироваться раньше, чем Fc-фрагмент Ig. Fab-фрагменты, имеющие молекулярную массу, аналогичную молекулярной массе Fc-фрагмента Ig, удаляли колоночной хроматографией на белке А (фиг.1). Полученные фракции, содержащие Fc-фрагмент Ig, элюированный из колонки с Superdex 200, загружали при скорости потока 5 мл/мин на колонку с белком А (Pharmacia), уравновешенную 20 мМ фосфатным буфером (рН 7,0), и эту колонку промывали тем же самым буфером для удаления белков, не связанных с колонкой. Затем колонку с белком А элюировали 100 мМ натрийцитратного буфера (рН 3,0) и получали Fc-фрагмент иммуноглобулина с высокой степенью чистоты. И наконец, Fc-фракции, собранные из колонки с белком А, очищали на катионообменной колонке (polyCAT, PolyLC, Company), где указанную колонку, загруженную Fc-фракциями, элюировали линейным градиентом 0,15-0,4М NaCl в 10 мМ ацетатного буфера (рН 4,5), в результате чего получали Fc-фракции с высокой степенью чистоты. Fc-фракции с высокой степенью чистоты анализировали с помощью электрофореза в 12% ПААГ с ДСН (дорожка 2 на фиг.2).

<Стадия 2> Получение комплекса IFN-PEG

3,4 кДа-полиэтиленгликоль, имеющий альдегидную реакционно-способную группу по обоим концам, ALD-PEG-ALD (Shearwater), смешивали с человеческим интерфероном альфа-2b (hIFN-2b, молекулярная масса (MW): 20 кДа), растворенным в 100 мМ фосфатного буфера в количестве 5 мг/мл в молярном отношении IFN:PEG, равном 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 и 1:20. К этой смеси добавляли восстановитель, а именно цианоборогидрид натрия (NaCNBH₃, Sigma), в конечной концентрации 20 мМ, и проводили реакцию при 4°С в течение 3 часов при мягком помешивании, в результате чего происходило присоединение PEG к амино-концу интерферона-альфа. Для получения комплекса PEG и интерферона-альфа (1:1), реакционную смесь подвергали вытеснительной хроматографии на колонке с Superdex® (Pharmacia). Комплекс IFN-PEG элюировали с колонки с использованием 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,0) в качестве элюирующего буфера и интерферон-альфа, не связанный с PEG, непрореагировавший PEG и димерные побочные продукты, в которых PEG был связан с двумя молекулами интерферона-альфа, удаляли. Очищенный комплекс IFN-PEG концентрировали до 5 мг/мл. В процессе проведения этого эксперимента было обнаружено, что оптимальное молярное соотношение IFN к PEG в указанной реакции, при котором обеспечивается самая высокая реактивность и продуцируется наименьшее количество побочных продуктов, таких как димеры, составляло 1:2,5-1:5.

<Стадия 3> Получение конъюгата IFN-PEG-Fc

Для присоединения комплекса IFN-PEG, очищенного в стадии 2, к N-концу Fc-фрагмента иммуноглобулина, Fc-фрагмент иммуноглобулина (примерно 53 кДа), полученный в стадии 1, растворяли в 10 мМ фосфатного буфера и смешивали с комплексом IFN-PEG в молярном отношении комплекс IFN-PEG:Fc-фрагмент, равном 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. После доведения концентрации фосфатного буфера в реакционном растворе до 100 мМ, к реакционному раствору добавляли восстановитель, NaCNBH₃, в конечной концентрации 20 мМ, и смесь оставляли на 20 часов для реакции при 4°С и при мягком помешивании. Во время проведения этого эксперимента было обнаружено, что в данной реакции, оптимальное молярное отношение комплекс IFN-PEG:Fc-фрагмент, при котором обеспечивается самая высокая реактивность и продуцируется наименьшее количество побочных продуктов, таких как димеры, составляло 1:2.

<Стадия 4> Выделение и очистка конъюгата IFN-PEG-Fc

После проведения реакции в стадии 3, реакционную смесь подвергали вытеснительной хроматографии на Superdex для удаления непрореагировавших веществ и побочных продуктов, и для очистки продуцируемого белкового конъюгата IFN-PEG-Fc. После концентрирования реакционной смеси и ее загрузки на колонку с Superdex, через эту колонку пропускали 10 мМ фосфатный буфер (рН 7,3) при скорости потока 2,5 мл/мин для удаления несвязанного Fc и непрореагировавших веществ, а затем колонку элюировали и собирали фракции белкового конъюгата IFN-PEG-Fc. Поскольку собранные фракции белкового конъюгата IFN-PEG-Fc содержали небольшое количество примесей, непрореагировавших Fc и димеров интерферона-альфа, то такие примеси удаляли с помощью катионообменной хроматографии. Фракции белкового конъюгата IFN-PEG-Fc загружали на колонку PolyCAT LP (PolyLC), уравновешенную 10 мМ ацетата натрия (рН 4,5), и эту колонку элюировали линейным градиентом 0-0,5М NaCl в 10 мМ натрийацетатного буфера (рН 4,5) с использованием 1М NaCl. И наконец, белковый конъюгат IFN-PEG-Fc очищали на анионообменной колонке. Фракции белкового конъюгата IFN-PEG-Fc загружали на колонку PolyWAX LP (PolyLC), уравновешенную 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), а затем колонку элюировали линейным градиентом 0-0,3М NaCl в 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5) с использованием 1М NaCl, в результате чего выделяли белковый конъюгат IFN-PEG-Fc с высокой степенью чистоты.

Пример 2: Получение II белкового конъюгата IFN-PEG-Fc

<Стадия 1> Получение комплекса Fc-PEG

3,4 кДа-полиэтиленгликоль, имеющий альдегидную реакционно-способную группу на обоих концах, ALD-PEG-ALD (Shearwater), смешивали с Fc-фрагментом иммуноглобулина, полученным в стадии 1 примера 1, в молярных отношениях Fc:PEG, равных 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 и 1:20, где Fc-фрагмент Ig растворен в 100 мМ фосфатного буфера в количестве 15 мг/мл. К этой смеси добавляли восстановитель, NaCNBH₃ (Sigma), в конечной концентрации 20 мМ, и проводили реакцию при 4°С в течение 3 часов при мягком помешивании. Для получения комплекса PEG и Fc (1:1), реакционную смесь подвергали вытеснительной хроматографии на колонке с Superdex® (Pharmacia). Комплекс Fc-PEG элюировали с колонки с использованием 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,0) в качестве элюирующего буфера, и Fc-фрагмент иммуноглобулина, не связанный с PEG, а также непрореагировавший PEG и димерные побочные продукты, в которых PEG был связан с двумя молекулами интерферона-альфа, удаляли. Очищенный комплекс Fc-PEG концентрировали примерно до 15 мг/мл. Во время проведения этого эксперимента было обнаружено, что оптимальное молярное соотношение Fc к PEG в данной реакции, при котором обеспечивается самая высокая реактивность и продуцируется наименьшее количество побочных продуктов, таких как димеры, составляло 1:3 – 1:10.

<Стадия 2> Получение и очистка конъюгата комплекс Fc-PEG-интерферон-альфа

Для присоединения комплекса Fc-PEG, очищенного в стадии 1, к N-концу IFN, этот комплекс Fc-PEG смешивали с IFN, растворенным в 10 мМ фосфатного буфера в молярном отношении комплекс Fc-PEG:IFN, равном 1:1, 1:1,5, 1:3 и 1:6. После доведения концентрации фосфатного буфера в реакционном растворе до 100 мМ, к реакционному раствору добавляли восстановитель, NaCNBH₃, в конечной концентрации 20 мМ, и смесь оставляли на 20 часов при 4°С и при мягком помешивании для прохождения реакции. После завершения реакции, непрореагировавшие вещества и побочные продукты удаляли методом очистки, описанным в стадии 4 примера 1, в результате чего выделяли белковый конъюгат Fc-PEG-IFN с высокой степенью очистки.

Пример 3: Получение конъюгата hGH-PEG-Fc

Получали конъюгат hGH-PEG-Fc, который очищали методом, описанным в примере 1, за исключением того, что в качестве лекарственного средства, вместо интерферона-альфа использовали человеческий гормон роста (hGH, мол.масса: 22 кДа), а молярное соотношение hGH:PEG составляло 1:5.

Пример 4: Получение конъюгата G-CSF-PEG-Fc

Получали конъюгат G-CSF-PEG-Fc, который очищали методом, описанным в примере 1, за исключением того, что в качестве лекарственного средства, вместо интерферона-альфа использовали человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (hG-CSF), а молярное соотношение hG-CSF:PEG составляло 1:5.

Кроме того, белковый конъюгат ¹⁷S-G-CSF-PEG-Fc получали и очищали методом, описанным выше, с использованием производного G-CSF, ¹⁷S-G-CSF, в котором семнадцатый аминокислотный остаток нативного hG-CSF был заменен серином.

Пример 5: Получение конъюгата EPO-PEG-Fc

Конъюгат ЕРО-PEG-Fc получали и очищали методом, описанным в примере 1, за исключением того, что в качестве лекарственного средства, вместо интерферона-альфа использовали человеческий эритропоэтин (ЕРО), а молярное соотношение ЕРО:PEG составляло 1:5.

Пример 6: Получение белкового конъюгата с использованием PEG, имеющего другую реакционно-способную группу

Белковый конъюгат IFN-PEG-Fc получали с использованием PEG, имеющего сукцинимидилпропионатную (SPA) реакционно-способную группу по обоим концам, в соответствии с нижеследующей процедурой. 3,4 кДа-полиэтиленгликоль, SPA-PEG-SPA (Shearwater), смешивали с 10 мг интерферона-альфа, растворенного в 100 мМ фосфатного буфера в молярных отношениях IFN:PEG, равных 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 и 1:20. Затем смесь подвергали реакции при комнатной температуре при мягком помешивании в течение 2 ч. Для получения комплекса PEG и интерферона-альфа (1:1)(комплекса IFN-PEG), где PEG был селективно присоединен к аминогруппе лизинового остатка интерферона-альфа, реакционную смесь подвергали вытеснительной хроматографии на Superdex. Комплекс IFN-PEG элюировали с колонки с использованием 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,0) в качестве элюирующего буфера, а затем интерферон-альфа, не связанный с PEG, непрореагировавший PEG и димерные побочные продукты, в которых две молекулы интерферона-альфа были присоединены по обоим концам PEG, удаляли. Для связывания комплекса IFN-PEG с аминогруппой лизинового остатка Fc-фрагмента иммуноглобулина, очищенный комплекс IFN-PEG концентрировали примерно до 5 мг/мл, после чего получали конъюгат IFN-PEG-Fc, который очищали методами, описанными в стадиях 3 и 4 примера 1. В результате проведения этого эксперимента было обнаружено, что оптимальное молярное соотношение IFN:PEG в данной реакции, при котором обеспечивается самая высокая реакционная способность и продуцируется наименьшее количество побочных продуктов, таких как димеры, составляло 1:2,5-1:5.

Кроме того, получали другой конъюгат IFN-PEG-Fc методами, описанными выше, с использованием PEG, имеющего N-гидроксисукцинимидильную (NHS) реакционно-способную группу на обоих концах, NHS-PEG-NHS (Shearwater), или PEG, имеющего бутилальдегидную реакционно-способную группу на обоих концах, BUA-PEG-BUA (Shearwater).

Пример 7: Получение белкового конъюгата с использованием PEG, имеющего другую молекулярную массу

Комплекс IFN-10К PEG получали с использованием 10 кДа-полиэтиленгликоля, имеющего альдегидную реакционно-способную группу по обоим концам, ALD-PEG-ALD (Shearwater). Этот комплекс получали и очищали методом, используемым в стадии 2 примера 1. В результате проведения этого эксперимента было обнаружено, что оптимальное молярное соотношение IFN:10К-PEG в данной реакции, при котором обеспечивается самая высокая реактивность и продуцируется наименьшее количество побочных продуктов, таких как димеры, составляло 1:2,5-1:5. Очищенный комплекс IFN-10 К-PEG концентрировали примерно до 5 мг/мл, и с использованием этого концентрата получали конъюгат IFN-10К PEG-Fc, который очищали методами, описанными в стадиях 3 и 4 примера 1.

Пример 8: Получение конъюгата Fab’-S-PEG-N-Fc (с группой SH)

<Стадия 1> Экспрессия и очистка Fab’

Трансформант E.coli, BL21/poDHLF (регистрационный номер: КССМ-10511), экспрессирующий Fab’-фрагмент против фактора некроза опухоли-альфа, культивировали, перемешивая, в 100 мл среды LB в течение ночи, а затем инокулировали в 5-литровый биореактор (Marubishi) и культивировали при 30°С и при 500 об/мин при скорости воздушного потока 20 об.% в минуту. В целях компенсации недостатка питательных элементов для роста бактерий в процессе ферментации, в культуры добавляли глюкозу и дрожжевые экстракты в зависимости от состояния сбраживания бактерий. После того как культуры достигали величины OD₆₀₀, равной 80-100, в эти культуры добавляли индуктор, IPTG, для индуцирования экспрессии белка. Затем культуры выращивали в течение 40-45 часов до тех пор, пока значение OD при 600 нм не увеличивалось до 120-140. Полученную таким образом сбраживаемую жидкость центрифугировали при 20000g в течение 30 минут. Затем супернатант собирали и осадок отбрасывали.

Супернатант подвергали описанной ниже трехстадийной колоночной хроматографии для очистки Fab’-фрагмента против фактора некроза опухоли-альфа. Этот супернатант загружали на колонку HiTrap с белком G (5 мл, Pharmacia), уравновешенную 20 мМ фосфатным буфером (рН 7,0), и колонку элюировали 100 мМ глицином (рН 3,0). Затем собранные Fab’-фракции загружали на колонку с Superdex 200 (Pharmacia), уравновешенную 10 мМ натрийфосфатным буфером (PBS, рН 7,3), и эту колонку элюировали тем же самым буфером. И наконец, вторые Fab’-фракции загружали на колонку polyCAT 21 х 250 (PolyLC), и эту колонку элюировали линейным градиентом NaCl 0,15-0,4М в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4,5) с получением фракций Fab’-фрагмента против фактора некроза опухоли-альфа с высокой степенью чистоты.

<Стадия 2> Получение и очистка комплекса Fc-PEG

Для присоединения линкера PEG к N-концу Fc-фрагмента иммуноглобулина, Fc-фрагмент иммуноглобулина, полученный методом, описанным в стадии 1 примера 1, растворяли в 100 мМ фосфатного буфера (рН 6,0) при концентрации 5 мг/мл, и смешивали с NHS-PEG-MAL (3,4 кДа, Shearwater) в молярном отношении Fc:PEG, равном 1:10, а затем инкубировали при 4°С в течение 12 часов при мягком помешивании.

После завершения реакции, реакционный буфер заменяли 20 мМ натрийфосфатным буфером (рН 6,0) для удаления несвязанного NHS-PEG-MAL. Затем реакционную смесь загружали на колонку polyCAT (PolyLC). Эту колонку элюировали линейным градиентом 0,15-0,5М NaCl в 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 6,0). В процессе элюирования, комплекс Fc-фрагмент иммуноглобулина – PEG элюировался раньше, чем непрореагировавший Fc-фрагмент иммуноглобулина, а непрореагировавший Fc Ig элюировался позже, что позволяло удалять непрореагировавшие молекулы Fc Ig.

<Стадия 3> Получение и очистка конъюгата Fab’-S-PEG-N-Fc (с группой -SH)

Для связывания комплекса Fc-фрагмент иммуноглобулина – PEG с цистеиновой группой Fab’, этот Fab’, очищенный в стадии 1, растворяли в 100 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,3) при концентрации 2 мг/мл, и смешивали с комплексом Fc-фрагмент иммуноглобулина-PEG, полученным выше в стадии 2, в молярном отношении Fab’:комплекс, равном 1:5. Реакционную смесь концентрировали до конечной концентрации белка 50 мг/мл и инкубировали при 4°С в течение 24 часов при мягком помешивании.

После завершения реакции, реакционную смесь загружали на колонку с Superdex 200 (Pharmacia), уравновешенную 10 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,3), и колонку элюировали тем же самым буфером при скорости потока 1 мл/мин. Связанный конъюгат Fab’-S-PEG-N-Fc элюировался относительно рано, что обусловлено его высокой молекулярной массой, а непрореагировавший комплекс Fc-фррагмент иммуноглобулина-PEG и Fab’ элюировались позже, что позволяло удалять непрореагировавшие молекулы. Для полного удаления непрореагировавшего комплекса Fc иммуноглобулина-PEG, собранные фракции конъюгата Fab’-S-PEG-N-Fc снова загружали на колонку polyCAT, 21 x 250 (PolyLC) и эту колонку элюировали линейным градиентом NaCl 0,15-0,5М в 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 6,0), в результате чего получали чистый конъюгат Fab’-S-PEG-N-Fc, содержащий комплекс Fc-PEG, связанный с группой -SH возле С-конца Fab’.

Пример 9: Получение конъюгата Fab’-N-PEG-N-Fc (с N-концом)

<Стадия 1> Получение и очистка комплекса Fab’-PEG (с N-концом)

40 мг Fab’, очищенного в стадии 1 примера 8, растворяли в 100 мМ натрийфосфатного буфера (рН 6,0) при концентрации 5 мг/мл, и смешивали с бутил-ALD-PEG-бутил-ALD (3,4 кДа, Nektar) в молярном отношении Fab’:PEG, равном 1:5. К реакционной смеси добавляли восстановитель, NaCNBH₃, при конечной концентрации 20 мМ, а затем смесь подвергали реакции при 4°С в течение 2 часов при мягком помешивании.

После завершения реакции, реакционный буфер заменяли 20 мМ натрийфосфатным буфером (рН 6,0). Затем реакционную смесь загружали на колонку polyCAT (PolyLC). Эту колонку элюировали линейным градиентом NaCl 0,15-0,4М в 20 мМ ацетатном буфере (рН 4,5). В процессе элюирования с колонки, комплекс Fab’-PEG, содержащий линкер PEG, связанный с N-концом Fab’, элюировался раньше, чем непрореагировавший Fab’, а непрореагировавший Fab’ элюировался позже, что позволяло удалять непрореагировавшие молекулы Fab’.

<Стадия 2> Получение и очистка конъюгата Fab’-N-PEG-N-Fc

Для связывания комплекса Fab’-PEG, очищенного в вышеописанной стадии 1, с N-концом Fc иммуноглобулина, комплекс Fab’-PEG растворяли в 100 мМ натрийфосфатного буфера (рН 6,0) при концентрации 10 мг/мл и смешивали с Fc-фрагментом иммуноглобулина, растворенным в том же самом буфере в молярном отношении комплекс Fab’-PEG:Fc, равном 1:5. После концентрирования реакционной смеси до конечной концентрации белка 50 мг/мл, к реакционной смеси добавляли восстановитель, NaCNBH₃, при конечной концентрации 20 мМ, а затем реакционную смесь подвергали реакции при 4°С в течение 24 часов при мягком помешивании.

После завершения реакции, реакционную смесь загружали на колонку с Superdex 200 (Pharmacia), уравновешенную 10 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,3), и колонку элюировали тем же самым буфером при скорости потока 1 мл/мин. Связанный конъюгат Fab’-N-PEG-N-Fc элюировался относительно рано, что обусловлено его высокой молекулярной массой, а непрореагировавший Fc-фррагмент иммуноглобулина и комплекс Fab’-PEG элюировался позже, что позволяло удалять непрореагировавшие молекулы. Для полного удаления непрореагировавших молекул Fc иммуноглобулина, собранные фракции конъюгата Fab’-N-PEG-N-Fc снова загружали на колонку polyCAT 21 x 250 (PolyLC), и эту колонку элюировали линейным градиентом NaCl 0,15-0,5М в 20 мМ натрийфосфатном буфере (рН 6,0), в результате чего получали чистый конъюгат Fab’-N-PEG-N-Fc, содержащий комплекс Fc иммуноглобулина-PEG, связанный с N-концом Fab’.

Пример 10: Получение и очистка дегликозилированного Fc иммуноглобулина

200 мг Fc иммуноглобулина, полученного методом, описанным в примере 1, растворяли в 100 мМ фосфатного буфера (рН 7,5) при концентрации 2 мг/мл и смешивали с 300 ед./мг дегликозилазы, PNGазы F (NEB). Реакционную смесь оставляли на 24 часа при 37°С для прохождения реакции при мягком помешивании. Затем, для очистки дегликозилированного Fc-фрагмента иммуноглобулина, реакционную смесь загружали на колонку с SP сефарозой FF (Pharmacia) и колонку элюировали линейным градиентом NaCl 0,1-0,6 М в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4,5) с использованием 1М NaCl. Нативный Fc иммуноглобулина элюировался раньше, а дегликозилированный Fc иммуноглобулина (DG Fc) элюировался позже.

Пример 11: Получение конъюгата IFN-PEG-DG Fc

Для связывания дегликозилированного Fc иммуноглобулина, полученного как описано в примере 10, с комплексом IFN-PEG, очищенным в стадии 2 примера 1, комплекс IFN-PEG смешивали с DG Fc, растворенным в 10 мМ фосфатного буфера в молярном отношении IFN-PEG:DG Fc, равном 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. После доведения концентрации фосфатного буфера реакционного раствора до 100 мМ, к реакционному раствору добавляли восстановитель, NaCNBH₃, при конечной концентрации 20 мМ, а затем смесь подвергали реакции при 4°С в течение 20 часов при мягком помешивании. При проведении этого эксперимента было обнаружено, что оптимальное молярное соотношение комплекса IFN-PEG к DG Fc в реакционной смеси, при котором обеспечивалась самая высокая реактивность и продуцировалось наименьшее количество побочных продуктов, таких как димеры, составляет 1:2.

После завершения реакции, реакционную смесь подвергали вытеснительной хроматографии на колонке с Superdex (Pharmacia) для удаления непрореагировавших веществ и побочных продуктов и для очистки белкового конъюгата IFN-PEG-DG Fc. После загрузки реакционной смеси на колонку, через эту колонку пропускали фосфатный буфер (рН 7,3) при скорости потока 2,5 мл/мин для удаления несвязанного DG Fc и непрореагировавших веществ, после чего колонку элюировали для сбора фракций белкового конъюгата IFN-PEG-DG Fc. Поскольку собранные фракции белкового конъюгата IFN-PEG-DG Fc содержали небольшое количество примесей, непрореагировавшего DG Fc и комплекса IFN-PEG, то эти примеси удаляли с помощью катионообменной хроматографии. Фракции белкового конъюгата IFN-PEG-DG Fc загружали на колонку polyCAT LP (PolyLC), уравновешенную 10 мМ ацетата натрия (рН 4,5), и эту колонку элюировали линейным градиентом 0-0,6М NaCl в 10 мМ натрийацетатного буфера (рН 4,5) с использованием 1М NaCl. И наконец, белковый конъюгат IFN-PEG-DG Fc очищали на анионообменной колонке. Фракции белкового конъюгата IFN-PEG-Fc загружали на колонку PolyWAX LP (PolyLC), уравновешенную 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), а затем колонку элюировали линейным градиентом 0-0,3М NaCl в 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5) с использованием 1М NaCl, и выделяли белковый конъюгат IFN-PEG-DG Fc с высокой степенью чистоты.

Пример 12: Получение и очистка рекомбинантного производного агликозилированного Fc иммуноглобулина

<Получение экспрессирующего вектора производного 1 Fc IgG4>

Для создания константных областей тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG4, получали первое производное (дельта-Cys IgG4), имеющее делецию в девять аминокислот на амино-конце нативной шарнирной области, и второе производное (мономер IgG4), в котором отсутствовала шарнирная область в результате делеции всех двенадцати аминокислот шарнирной области. В качестве экспрессирующего вектора, содержащего секреторную последовательность E.coli, использовали плазмиду pT14S1SH-4T20V22Q (патент Кореи 38061), полученную авторами настоящего изобретения еще до подачи настоящей заявки.

Для получения константных областей тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG4, в соответствии с нижеследующей процедурой проводили ОТ-ПЦР с использованием РНК, выделенной из клеток крови человека, в качестве матрицы. Сначала всю РНК выделяли примерно из 6 мл крови с использованием набора для выделения РНК крови Qiamp (Qiagen), и гены амплифицировали с использованием полноразмерной РНК в качестве матрицы и с использованием набора для одностадийной ОТ-ПЦР (Qiagen). В этой ПЦР использовали пару синтезированных праймеров, представленных в SEQ ID NO:1 и 2, и другую пару синтезированных праймеров, представленных в SEQ ID NO:2 и 3. SEQ ID NO:1 представляет собой нуклеотидную последовательность из 12 аминокислотных остатков шарнирной области IgG4, начиная с 10-го остатка, серина, и ниже. SEQ ID NO:3 имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую домен С_Н2, содержащий аланин в качестве первого аминокислотного остатка. SEQ ID NO:2 имеет BamHI-сайт распознавания, содержащий стоп-кодон.

Для клонирования каждого фрагмента константной области амплифицированного IgG4 в экспрессирующий вектор, содержащий производное секреторной последовательности E.coli, использовали плазмиду pT14S1SH-4T20V22Q (патент Кореи 38061), полученную авторами настоящего изобретения еще до подачи настоящей заявки. Этот экспрессирующий вектор содержит производное секреторной последовательности термостабильного энтеротоксина, имеющее нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4. Для облегчения клонирования, StuI-сайт распознавания встраивали в конец производного секреторной последовательности плазмиды pT14S1SH-4T20V22Q термостабильного энтеротоксина E.coli посредством сайт-направленного мутагенеза с использованием пары праймеров, представленных в SEQ ID NO:5 и 6, в целях индуцирования мутагенеза для введения StuI-сайта в нуклеотидную последовательность, кодирующую последний аминокислотный остаток секреторной последовательности. При секвенировании ДНК было установлено, что встраивание StuI-сайта было успешным. Полученную плазмиду pT14S1SH-4T20V22Q, содержащую StuI-сайт, обозначали pmSTII. Эту плазмиду pmSTII обрабатывали ферментами StuI и BamHI и подвергали электрофорезу в агарозном геле, в результате чего получали очищенный большой фрагмент (4,7 т.п.н.), который содержал производное секреторной последовательности термостабильного энтеротоксина E.coli. Затем, амплифицированные генные фрагменты гидролизовали ферментом BamHI и лигировали с линеаризованным экспрессирующим вектором, в результате чего получали pSTIIdCG4Fc и pSTIIG4Mo.

Конечные экспрессирующие векторы отдельно трансформировали в BL21(DE3) E.coli, и полученные трансформанты были обозначены BL21/pSTIIdCG4Fc (НМ10932) и BL21/pSTIIdCG4Mo (НМ10933) и депонированы в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ) 15 сентября 2004 под регистрационными номерами КССМ-10597 и КССМ-10598 соответственно. Затем, когда культуры достигали OD₆₀₀=80, в эти культуры добавляли индуктор IPTG для индуцирования экспрессии белка. После этого культуры культивировали в течение 40-45 часов до тех пор, пока значение OD при 600 нм не достигало 100-120. Клетки E.coli, собранные из сбраживаемых жидкостей, разрушали, и полученные клеточные лизаты подвергали двухстадийной колоночной хроматографии для очистки производных константных областей рекомбинантнного иммуноглобулина, присутствующих в цитозоле E.coli.

5 мл-аффинную колонку с белком-А (Pharmacia) уравновешивали PBS, и клеточные лизаты загружали на колонку при скорости потока 5 мл/мин. Несвязанные белки отмывали PBS, а связанные белки элюировали 100 мМ цитратом (рН 3,0). Собранные фракции обессоливали на обессоливающей колонке HiPrep 26/10 (Pharmacia) с использованием 10 мМ трис-буфера (рН 8,0). Затем осуществляли вторую анионообменную колоночную хроматографию на 50 мл-колонке с Q НР 26/10 (Pharmacia). Первичные очищенные Fc-фракции рекомбинантного агликозилированного иммуноглобулина загружали на колонку с Q-сефарозой НР 26/10, и колонку элюировали линейным градиентом 0-0,2 М NaCl в 10 мМ трис-буфере (рН 8,0), в результате чего получали производное Fc рекомбинантного агликозилированного иммуноглобулина (AG Fc) с высокой степенью чистоты, дельта-Cys IgG4 и мономерную фракцию IgG4 с высокой степенью чистоты.

Пример 13: Получение конъюгата комплекса IFN-PEG и производного рекомбинантного AG Fc

В соответствии с методами, описанными в примерах 1 и 11, комплекс IFN-PEG присоединяли к N-концу дельта-Cys IgG4 в качестве производного AG Fc, полученного как описано в примере 12. После реакции присоединения, непрореагировавшие вещества и побочные продукты удаляли из реакционной смеси, и полученный таким образом белковый конъюгат IFN-PEG-AG Fc (I) сначала очищали на 50 мл-колонке с Q НР 26/10 (Pharmacia), а затем очищали с помощью аналитической жидкостной хроматографии высокого давления на колонке polyCAT LP 21,5 х 250 (PolyLC), в результате чего получали конъюгат с высокой степенью очистки. Реакционный раствор для связывания обессоливали на обессоливающей колонке HiPrep 26/10 (Pharmacia) с использованием 10 мМ трис-буфера (8,0). Затем реакционный раствор загружали на 20 мл-колонку с Q НР 26/10 (Pharmacia) при скорости потока 8 мл/мин и эту колонку элюировали линейным градиентом 0-0,2М NaCl с получением нужных фракций. Собранные фракции снова загружали на колонку polyCAT 21,5 х 250, уравновешенную 10 мл ацетатным буфером (рН 5,2) при скорости потока 15 мл/мин, и эту колонку элюировали линейным градиентом 0,1-0,3М NaCl с получением нужных фракций с высокой степенью чистоты. В соответствии с методом, описанным выше, получали другой белковый конъюгат IFN-PEG-AG Fc (II) с использованием другого производного AG Fc, полученного как описано в примере 12, мономера IgG4.

Пример 14: Получение конъюгата ЕРО-PEG-производное рекомбинантного AG Fc

Методом, описанным в примере 13, получали конъюгат ЕРО-PEG-производное рекомбинантного AG Fc путем присоединения производного AG Fc, дельта-Cys IgG4, к комплексу ЕРО-PEG.

Сравнительный пример 1: Получение комплекса IFN-40К PEG

5 мг интерферона-альфа растворяли в 100 мМ фосфатного буфера до конечного объема 5 мл и смешивали с активированным 40 кДа-метокси-PEG-альдегидом (Shearwater) в молярном отношении IFN:40 кДа-PEG, равном 1:4. К этой смеси добавляли восстановитель, NaCNBH₃, при конечной концентрации 20 мМ, и смесь оставляли для реакции на 18 часов при 4°С и при мягком помешивании. Для инактивации PEG, который не реагирует с IFN, к реакционной смеси добавляли этаноламин при конечной концентрации 50 мМ.

Колонку с сефадексом G-25 (Pharmacia) использовали для удаления непрореагировавшего PEG, и этот буфер заменяли другим буфером. Сначала эту колонку уравновешивали двумя колоночными объемами (КО) 10 мМ Трис-HCl-буфера (рН 7,5), а затем в нее загружали реакционную смесь. Скорость потока детектировали путем измерения оптической плотности при 260 нм на УФ-спектрофотометре. При элюировании колонки тем же самым буфером, интерферон-альфа, модифицированный путем присоединения PEG с более высокой молекулярной массой к его N-концу, элюировался раньше, а непрореагировавший PEG элюировался позже, что позволяло выделять только IFN-40К PEG.

Описанную ниже хроматографию проводили для дополнительной очистки комплекса IFN-40К PEG из собранных фракций. 3 мл-колонку PolyWAX LP (PolyLC) уравновешивали 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5). Собранные фракции, содержащие комплекс IFN-40К PEG, загружали на колонку при скорости потока 1 мл/мин, и эту колонку промывали 15 мл уравновешивающего буфера. Затем колонку элюировали линейным градиентом NaCl 0-100% с использованием 30 мл 1М NaCl, в результате чего осуществляли последовательное элюирование интерферона-альфа, конъюгированного с три-, ди- и моно-PEG. Для последующей очистки моно-PEG-конъюгированного интерферона-альфа, собранные фракции, содержащие моно-PEG-конъюгированный интерферон-альфа, подвергали вытеснительной хроматографии. Фракции концентрировали и загружали на колонку с Superdex 200 (Pharmacia), уравновешенную 10 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,0), и эту колонку элюировали тем же самым буфером при скорости потока 1 мл/мин. Молекулы три- и ди-PEG-конъюгированного интерферона-альфа удаляли исходя из их способности элюироваться раньше, чем моно-PEG-конъюгированный интерферон-альфа, в результате чего выделяли моно-PEG-конъюгированный интерферон-альфа с высокой степенью чистоты.

В соответствии с методом, описанным выше, 40 кДа-PEG конъюгировали с N-концом человеческого гормона роста, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) и производного G-CSF, в результате чего получали комплексы hGH-40 К PEG, G-CSF-40К PEG и производное 40К PEG-¹⁷S-G-CSF.

Сравнительный пример 2: Получение конъюгата IFN-PEG-альбумин

Для присоединения комплекса IFN-PEG, очищенного в стадии 2 примера 1, к N-концу альбумина, комплекс IFN-PEG смешивали с альбумином человеческой сыворотки (HSA, примерно 67 кДа, Green Cross), растворенным в 10 мМ фосфатного буфера в молярном отношении комплекс IFN-PEG:альбумин, равном 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. После доведения концентрации фосфатного буфера реакционного раствора до 100 мМ, к реакционному раствору добавляли восстановитель, NaCNBH₃, при конечной концентрации 20 мМ, и смесь оставляли на 20 часов для реакции при 4°С и при мягком помешивании. При проведении этого эксперимента было обнаружено, что оптимальное молярное соотношение комплекса IFN-PEG к альбумину в реакционной смеси, при котором обеспечивается наибольшая реактивность и продуцируется наименьшее количество побочных продуктов, таких как димеры, составляет 1:2.

После завершения реакции присоединения, реакционную смесь подвергали вытеснительной хроматографии на колонке с Superdex® (Pharmacia) для удаления непрореагировавших веществ и побочных продуктов, и для очистки продуцированного белкового конъюгата IFN-PEG-альбумин. После концентрирования реакционной смеси и ее загрузки на колонку, через эту колонку пропускали 10 мМ натрийацетатный буфер при скорости потока 2,5 мл/мин для удаления несвязанного альбумина и непрореагировавших веществ, а затем колонку элюировали для очистки только белкового конъюгата IFN-PEG-альбумин. Поскольку собранные фракции белкового конъюгата IFN-PEG-альбумин содержали небольшое количество примесей, непрореагировавшего альбумина и димеров интерферона-альфа, то эти примеси удаляли с помощью катионообменной хроматографии. Фракции белкового конъюгата IFN-PEG-альбумин загружали на колонку SP5PW (Waters), уравновешенную 10 мМ ацетата натрия (рН 4,5), и эту колонку элюировали линейным градиентом 0-0,5М NaCl в 10 мМ натрийацетатного буфера (рН 4,5) с использованием 1М NaCl, в результате чего выделяли белковый конъюгат IFN--PEG-альбумин с высокой степенью очистки.

Методом, описанным выше, альбумин конъюгировали с человеческим гормоном роста, G-CSF, и с производным G-CSF, в результате чего получали конъюгаты hGH-PEG-альбумин, G-CSF-PEG-альбумин и ¹⁷S-G-CSF-PEG-альбумин.

Сравнительный пример 3: Получение комплекса Fab’-S-40К PEG

Свободный цистеиновый остаток Fab’-фрагмента, очищенного в стадии 1 примера 8, активировали путем инкубирования в активирующем буфере (20 мМ ацетат натрия (рН 4,0), 0,2 мМ (DTT) в течение 1 часа. Затем буфер заменяли PEG-модифицирующим буфером, 50 мМ фосфатом калия (рН 6,5), добавляли малеимид-PEG (Mw: 40 кДа, Shearwater) в молярном отношении Fab’:40 кДа PEG = 1:10, и проводили реакцию при 4°С в течение 24 часов при мягком помешивании.

После завершения реакции, реакционный раствор загружали на колонку с Superdex 200 (Pharmacia), уравновешенную 10 мМ натрийфосфатным буфером (рН 7,3), и эту колонку элюировали тем же самым буфером при скорости потока 1 мл/мин. Fab’, конъюгированный с 40 кДа PEG (Fab’-40К PEG), элюировался относительно рано, что обусловлено его высокой молекулярной массой, а непрореагировавший Fab’ элюировался позже, что позволяло удалять непрореагировавший Fab’. Для полного удаления непрореагировашего Fab’, собранные фракции комплекса Fab’-40К PEG снова загружали на колонку polyCAT, 21 х 250 (PolyLC), и эту колонку элюировали линейным градиентом 0,15-0,5М NaCl в 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 4,5), в результате чего получали чистый комплекс Fab’-S-40К PEG, содержащий 40-кДа PEG, присоединенный к группе -SH фрагмента Fab’.

Экспериментальный пример 1: Идентификация и количественный анализ белковых конъюгатов

<1-1> Идентификация белковых конъюгатов

Белковые конъюгаты, полученные как описано в предыдущих примерах, анализировали с помощью электрофореза в нередуцирующем SDS-PAGE с использованием 4-20% градиентного геля и 12% геля и ELISA (R&D System).

Результаты SDS-PAGE-анализа, проиллюстрированные на фиг.3, показали, что реакция связывания физиологически активного полипептида, не-пептидного полимера, PEG и Fc-фрагмента иммуноглобулина приводила к успешному продуцированию конъюгата IFN-PEG-Fc (А), конъюгата ¹⁷Ser-G-CSF-PEG-Fc (В) и конъюгата ЕРО-PEG-Fc (С).

Кроме того, DG Fc, полученный как описано в примере 10, анализировали с помощью электрофореза в нередуцирующем 12% SDS-PAGE. Как показано на фиг.6b, полоса DG Fc детектировалась в положении, которое соответствовало молекулярной массе нативного Fc, не содержащего сахарных групп.

<1-2> Количественный анализ белковых конъюгатов

Белковые конъюгаты, полученные как описано в предыдущих примерах, количественно оценивали с помощью вытеснительной хроматографии на колонке HiLoad 26/60 с Superdex 75 (Pharmacia) с использованием 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,0) в качестве элюирующего буфера, где площадь пика каждого белкового конъюгата сравнивали с площадью пика контрольной группы. Стандарты в предварительно определенном количестве, а именно IFN, hGH, G-CSF, ¹⁷Ser-G-CSF, ЕРО и Fc, отдельно подвергали вытеснительной хроматографии и определяли переводной коэффициент между концентрацией и пиком. Каждый белковый конъюгат в предварительно определенном количестве снова подвергали вытеснительной хроматографии. Затем путем вычитания площади пика, соответствующего Fc-фрагменту иммуноглобулина, из полученной площади пика определяли количество физиологически активного белка, присутствующего в каждом белковом конъюгате. На фиг.4 представлен результат вытеснительной хроматографии очищенного конъюгата IFN-PEG-Fc, где наблюдался один пик. Этот результат показал, что очищенный белковый конъюгат не содержит мультимерных примесей, таких как димер, тример или мономеры с большим числом звеньев.

После количественной оценки физиологически активного полипептида, конъюгированного с Fc, с использованием антитела против физиологически активного полипептида, было выявлено, что это антитело препятствует связыванию с этим полипептидом, на что указывало получение значения более низкого, чем фактическое значение, вычисленное с помощью хроматографии. В случае ELISA-анализа конъюгата IFN-PEG-Fc, этот анализ давал значение, составляющее примерно 30% от фактического значения.

<1-3> Оценка чистоты и массы белковых конъюгатов

Белковые конъюгаты, полученные как описано в предыдущих примерах, подвергали вытеснительной хроматографии и измеряли оптическую плотность при 280 нм. Результаты показали, что конъюгаты IFN-PEG-Fc, hGH-PEG-Fc, G-CSF-PEG-Fc и ¹⁷Ser-G-CSF-PEG-Fc обнаруживали один пик при времени удерживания вещества с молекулярной массой 70-80 кДа.

С другой стороны, проводили обращенно-фазовую ВЭЖХ для определения чистоты белковых конъюгатов, полученных как описано в примерах 1, 11 и 13, а именно IFN-PEG-Fc, IFN-PEG-DG Fc и IFN-PEG-производное рекомбинантного AG Fc. При этом использовали обращенно-фазовую колонку (колонка 259 VHP54, Vydac). Эту колонку элюировали 40-100% градиентом ацетонитрила с 0,5% TFA, и чистоту анализировали путем измерения оптической плотности при 280 нм. Результаты, проиллюстрированные на фиг.8, показали, что образцы не содержали несвязанный интерферон или Fc-фрагмент иммуноглобулина, и было обнаружено, что все белковые конъюгаты IFN-PEG-Fc (А), IFN-PEG-DG Fc (В) и IFN-PEG-производное рекомбинантного AG Fc (С) имели чистоту, превышающую 96%.

Для определения точных молекулярных масс очищенных белковых конъюгатов, массу каждого конъюгата анализировали на высокоэффективном масс-спекторофотометре MALDI-TOF (Voyager De-STR, Apllied Biosystems). В качестве матрикса использовали синаповую кислоту. 0,5 мкл каждого тест-образца наносили на предметное стекло и сушили воздухом, а затем снова смешивали с равным объемом матриксного раствора, сушили воздухом и вводили в источник ионов. Детекцию осуществляли с использованием линейного анализатора TOF, работающего в позитивном режиме. Ионы подвергали ускорению с использованием щелевого источника для вылета частиц с запаздыванием вылета (DE), где время запаздывания вылета частиц составляло от 750 нсек до 1500 нсек при общем напряжении ускорения примерно 2,5 кВ.

Молекулярные массы, наблюдаемые при масс-спектрометрии MALDI-TOF для белковых конъюгатов Fc, полученных как описано в примерах, представлены ниже в таблице 1. На фиг.5 представлены результаты масс-спектрометрии MALDI-TOF для конъюгата ЕРО-PEG-Fc, а на фиг.7 представлены результаты масс-спектрометрии MALDI-TOF для конъюгатов IFN-PEG-Fc и IFN-PEG-DG Fc. В результате было обнаружено, что белковый конъюгат ЕРО-PEG-Fc имеет чистоту более чем 95%, и молекулярную массу, очень близкую к теоретической Mw. Кроме того, было обнаружено, что ЕРО связывался с Fc-фрагментом иммуноглобулина в отношении 1:1.

Таблица 1
	Теоретическая Mw (кДа)	Измеренная Mw (кДа)
IFNa-PEG-Fc (E.1)	75,4	75,9
hGH-PEG-Fc (E.3)	78,4	78,6
G-CSF-PEG-Fc (E.4)	75,3	75,9
Производное 17S-G-CSF-PEG-Fc (E.4)	75,0	75,9
EPO-PEG-Fc (E.5)	91,4	91,0

Кроме того, в результате оценки с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF молекулярных масс Fc и DG Fc, полученных как описано в примере 10, было установлено, что DG Fc имеет молекулярную массу 50 кДа, которая примерно на 3 кДа меньше массы нативного Fc (фиг.6а). Поскольку Mw 3 кДа соответствует теоретическому размеру сахарных групп, то эти результаты продемонстрировали, что сахарные группы были полностью удалены.

В нижеследующей таблице 2 представлены результаты масс-спектрометрии MALDI-TOF конъюгата IFN-PEG-DG Fc, полученного как описано в примере 11, и конъюгатов IFN-PEG-производное рекомбинантного AG Fc (I и II), полученных как описано в примере 13. Было установлено, что конъюгат IFN-PEG-DG Fc был на 3 кДа меньше, чем конъюгат IFN-PEG-Fc, а конъюгат IFN-PEG-производное рекомбинантного AG Fc (I) был примерно на 3-4 кДа меньше, чем указанный конъюгат IFN-PEG-Fc, имеющий массу 75,9 кДа. Конъюгат IFN-PEG-производное рекомбинантного AG Fc (II), связанный с Fc-мономером, имел молекулярную массу, которая была меньше на 24,5 кДа, т.е. на величину, соответствующую молекулярной массе мономера Fc.

Таблица 2
	Теоретическая Mw (кДа)	Измеренная Mw (кДа)
IFN-PEG-DG Fc (Е.11)	72,8	73,0
IFN-PEG-производное рекомбинантного AG Fc (I)(Е.13)	72,3	72,2
IFN-PEG-производное рекомбинантного AG Fc (II)(Е.13)	46,8	46,6

Экспериментальный пример 2: Фармакокинетический анализ I

Нативные формы физиологически активных белков (контролей) и белковые конъюгаты, полученные как описано выше в примерах и в сравнительных примерах, комплексы -40К PEG, конъюгаты -PEG-альбумин, конъюгаты -PEG-Fc, конъюгаты -PEG-DG Fc, и конъюгаты -PEG-производное рекомбинантного AG Fc оценивали на их стабильность в сыворотке и на фармакокинетические параметры у крыс SD (пять крыс на группу). Контроль, а также комплексы -40К PEG, конъюгаты -PEG-альбумин, конъюгаты -PEG-Fc, конъюгаты -PEG-DG Fc, и конъюгаты -PEG-производное рекомбинантного AG Fc (тест-группы) отдельно подкожно инъецировали крысам в дозе 100 мкг/кг. После подкожной инъекции через 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 30, 48, 72 и 96 часов брали пробы крови у животных контрольных групп, и через 1, 6, 12, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 240 и 288 часов брали пробы крови у животных тест-групп. Пробы крови собирали в пробирки с антикоагулянтом, гепарином, и центрифугировали в течение 5 минут в высокоскоростной микроцентрифуге Эппендорфа для удаления клеток крови. Уровни белка в сыворотке измеряли с помощью ELISA с использованием антител, специфичных к физиологически активным белкам.

Результаты фармакокинетических анализов нативных форм IFN, hGH, G-CSF и ЕРО и их -40К PEG-комплексов, их -PEG-альбумин-конъюгатов, -PEG-Fc-конъюгатов и -PEG-DG Fc-конъюгатов представлены ниже в таблицах 3-7. В нижеследующих таблицах, TM_ax означает время, необходимое для достижения максимальной концентрации лекарственного средства в сыворотке, Т_1/2 означает время полужизни лекарственного средства в сыворотке, а MRT (среднее время пребывания) означает среднее время пребывания молекулы лекарственного средства в организме.

Таблица 3
Фармакокинетические данные интерферона-альфа
	Нативный IFN	IFN 40K PEG (C.E.1)	IFN-PEG-альбумин (С.Е.2)	IFN PEG-Fc (E.1)	IFN PEG-DG Fc (E.11)	IFN-PEG-производ ное рекомбинантного AG Fc (I)(Е.13)	IFN-PEG-произ водное рекомбинантного AG Fc (II)(Е.13)
Tmax (часы)	1,0	30	12	30	48	24	24
T1/2 (часы)	1,7	35,8	17,1	90,4	71,0	61,2	31,2
MRT (часы)	2,1	71,5	32,5	150,1	120,6	111,0	58,8

Таблица 4
Фармакокинетические данные человеческого фактора роста
	Нативный hGH	hGH-40К PEG (C.E.1)	hGH-PEG-альбумин (C.E.2)	hGH-PEG-Fc (E.3)
Tmax (часы)	1,0	12	12	12
T1/2 (часы)	1,1	7,7	5,9	11,8
MRT (часы)	2,1	18,2	13,0	18,8

Таблица 5
Фармакокинетические данные G-CSF
	Нативный G-CSF	G-CSF-40К PEG (C.E.1)	G-CSF-PEG-альбумин (C.E.2)	G-CSF-PEG-Fc (E.4)
Tmax (часы)	2,0	12	12	12
T1/2 (часы)	2,8	4,8	5,2	6,9
MRT (часы)	5,2	24,5	25,0	32,6

Таблица 6
Фармакокинетические данные производного 17S-G-CSF
	Производное нативного 17S-G-CSF	17S-G-CSF-40К PEG (C.E.1)	17S-G-CSF-PEG-альбумин (C.E.2)	17S-G-CSF-PEG-Fc (E.4)
Tmax (часы)	2,0	24	24	24
T1/2 (часы)	2,9	4,3	6,4	7,0
MRT (часы)	5,8	24,4	25,1	33,2

Таблица 7
Фармакокинетические данные ЕРО
	Нативный ЕРО	в высокой степени гликозилированный ЕРО	ЕРО-PEG-Fc (E.5)	ЕРО-PEG-производное рекомбинантного AG Fc (E.13)
Tmax (часы)	6,0	12	30	48
T1/2 (часы)	9,4	18,4	61,5	87,9
MRT (часы)	21,7	26,8	117,6	141,6

Как видно из результатов, представленных в таблице 3, и на графике фармакокинетических данных, представленном на фиг.9, время полужизни белкового конъюгата IFN-PEG-Fc в сыворотке составляет 90,4 часа, и это время примерно в 50 раз выше, чем у нативного IFN и примерно в 2,5 раза выше, чем у комплекса IFN-40К PEG, который был получен как описано в сравнительном примере 1, и время полужизни которого составляет 35,8 часов. Кроме того, было обнаружено, что время полужизни в сыворотке белкового конъюгата IFN-PEG-Fc настоящего изобретения значительно превышает время полужизни в сыворотке конъюгата IFN-PEG-альбумин, составляющее 17,1 часа.

С другой стороны, как показано в таблице 3 и на фиг.11, время полужизни конъюгата IFN-PEG-DG Fc в сыворотке составляет 71,0 часа, т.е. оно почти аналогично времени полужизни конъюгата IFN-PEG-Fc, что указывает на то, что дегликозилирование Fc не оказывает значительного влияния на in vivo стабильность конъюгата IFN-PEG-DG Fc. Кроме того, было обнаружено, что конъюгат, полученный с использованием производного рекомбинантного AG Fc, продуцированного рекомбинантным методом, обладает таким же эффектом, как и DG Fc, происходящий от нативной формы. Однако время полужизни в сыворотке комплекса, связанного с мономером Fc, было наполовину меньше чем у комплекса, связанного с нормальным димером Fc.

Как показано в таблице 4, человеческий гормон роста, конъюгированный с Fc-фрагментом IgG настоящего изобретения, имел более длительное время полужизни в сыворотке. То есть по сравнению с нативной формой (1,1 ч), комплекс hGH-40К PEG и конъюгат hGH-PEG-альбумин имели несколько более длительное время полужизни, составляющее 7,7 ч и 5,9 ч соответственно, а белковый конъюгат hGH-PEG-Fc настоящего изобретения имел значительно более длительное время полужизни в сыворотке, которое составляло 11,8 ч.

Фармакокинетические данные для G-CSF и его производных, представленные в таблице 5 и 6, показали, что конъюгаты G-CSF-PEG-Fc и ¹⁷S-G-CSF-PEG-Fc обнаруживают гораздо большее время полужизни в сыворотке, чем комплекс -40К PEG- и конъюгат -PEG-альбумин. Было установлено, что Fc-фрагмент иммуноглобулина, присутствующий в сыворотке, способствовал увеличению продолжительности действия физиологически активных белков в нативных формах, а также в форме их производных, имеющих модификации в некоторых аминокислотных остатках, на уровне, аналогичном уровню нативных форм. Исходя из этих результатов, совершенно очевидно, что способ настоящего изобретения будет столь же эффективен и в отношении других белков и их производных.

Как показано в таблице 7 и на фиг.10, конъюгирование нативного гликозилированного ЕРО с Fc-фрагментом также приводит к увеличению времени полужизни в сыворотке. То есть ЕРО, в своей нативной форме, имеет время полужизни в сыворотке 9,4 часа, а при высокой степени гликозилирования, способствующего увеличению его стабильности в сыворотке, он имел более длительное время полужизни в сыворотке, составляющее 18,4 часа. Конъюгат ЕРО-PEG-Fc, содержащий ЕРО, присоединенный к Fc-фрагменту иммуноглобулина настоящего изобретения, обнаруживал значительное увеличение времени полужизни в сыворотке, а именно до 61,5 часов. Кроме того, при конъюгировании с рекомбинантным агликозилированным (AG) Fc-производным, происходящим от E.coli, время полужизни ЕРО увеличивалось до 87,9 часов, что указывало на то, что агликозилирование Fc-фрагмента позволяет получить белковый конъюгат, не оказывающий нежелательного влияния на стабильность данного белка в сыворотке, т.е. этот Fc-фрагмент не обладал функциями антитела.

Исходя из вышеуказанных результатов совершенно очевидно, что белковые конъюгаты настоящего изобретения, полученные путем ковалентного присоединения Fc-фрагмента иммуноглобулина посредством не-пептидного полимера, дают увеличение времени полужизни в сыворотке в несколько раз или в несколько десятков раз по сравнению со временем полужизни их нативных форм. Кроме того, если Fc иммуноглобулина был агликозилирован путем продуцирования в E.coli или дегликозилирован путем обработки ферментом, то указанное увеличение времени полужизни в сыворотке его белкового конъюгата поддерживалось на аналогичном уровне.

Более конкретно, по сравнению с белками, модифицированными 40 кДа-PEG, который, среди других молекул PEG, обеспечивал наиболее продолжительное действие этих белков в сыворотке, эти конъюгаты белка с Fc иммуноглобулина обнаруживали самую высокую стабильность в сыворотке. Кроме того, по сравнению с белковыми конъюгатами, которые, вместо Fc иммуноглобулина, имели присоединенный к ним альбумин, белковые конъюгаты настоящего изобретения обладали исключительно высокой стабильностью в сыворотке, что указывает на то, что белковые конъюгаты настоящего изобретения могут быть с успехом использованы для получения белковых лекарственных средств с пролонгированным действием. Эти результаты показали, что конъюгаты настоящего изобретения, по сравнению со стандартными белками, конъюгированными с PEG или альбумином, дают превосходный эффект в отношении стабильности в сыворотке и MRT для белков широкого спектра, включая производные колониестимулирующего фактора, образованные точковой мутацией, что указывает на то, что такая стабильность и продолжительность действия белковых конъюгатов настоящего изобретения может быть достигнута и для других физиологически активных полипептидов.

С другой стороны, после получения белкового конъюгата IFN-10К-PEG-Fc (пример 7) с использованием не-пептидного полимера, 10 кДа-PEG, этот конъюгат был проанализирован на время его полужизни в сыворотке методом, описанным выше, и полученные результаты показали, что его время полужизни в сыворотке составляло 48,8 часов, и это время было значительно короче, чем время полужизни (79,7 часов) белкового конъюгата, полученного с использованием 3,4 кДа-PEG.

Кроме того, время полужизни белковых конъюгатов в сыворотке снижается с увеличением молекулярной массы не-пептидного полимера PEG. Эти результаты указывают на то, что самым главным фактором, способствующим увеличению стабильности в сыворотке и продолжительности действия белковых конъюгатов в сыворотке, является конъюгированный Fc-фрагмент иммуноглобулина, а не не-пептидный полимер.

Даже если реакционно-способную группу PEG заменить на другую реакционно-способную группу, не являющуюся альдегидной группой, то белковые конъюгаты с таким PEG будут давать такие же эффекты в отношении кажущейся молекулярной массы и времени полужизни в сыворотке, как и конъюгаты, полученные с использованием PEG, имеющего альдегидную реакционно-способную группу.

Экспериментальный пример 3: Фармакокинетический анализ II

Для определения времени полужизни в сыворотке конъюгатов Fab’-S-PEG-N-Fc и Fab’-N-PEG-N-Fc, полученных как описано в примерах 8 и 9, и комплекса Fab’-S-40К PEG, полученного как описано в сравнительном примере 3, проводили фармакокинетический анализ лекарственных средств, полученных на основе указанных конъюгатов и указанного комплекса, методом, описанным в экспериментальном примере 2 с использованием Fab’ в качестве контроля. Результаты представлены на фиг.12.

Как показано на фиг.12, конъюгаты Fab’-S-PEG-N-Fc и Fab’-N-PEG-N-Fc обнаруживали более длительное время полужизни в сыворотке, которое было в два или в три раза больше, чем время полужизни Fab’ или комплекса Fab’-S-40К PEG.

Экспериментальный пример 4: Оценка внутриклеточной активности белковых конъюгатов

<4-1> Сравнение внутриклеточных активностей конъюгатов белка IFN

Для сравнения внутриклеточной активности конъюгатов белка IFN, конъюгаты: IFN-PEG-Fc (пример 1), IFN-PEG-DG Fc (пример 11), IFN-PEG-производное рекомбинантного AG Fc (пример 13), IFN-40К PEG (сравнительный пример 1) и IFN-PEG-альбумин (сравнительный пример 2) оценивали на противовирусную активность в биоанализе клеточных культур с использованием клеток коровьих почек Madin Darby (MDBK) (АТСС CCL-22), инфицированных вирусом везикулярного стоматита. В качестве стандартного материала использовали не-PEGилированный интерферон альфа-2b, поставляемый Национальным институтом по биологическим стандартам и контролю (NIBSC).

Клетки MDBK культивировали в среде МЕМ (минимальная поддерживающая среда, JBI), в которую были добавлены 10% FBS и 1% пенициллин/стрептомицин, при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Анализируемые образцы и стандартный материал разводили культуральной средой в предварительно определенных концентрациях, и 100 мкл аликвоты этих разведений вносили в каждую лунку 96-луночного планшета. Культивированные клетки отделяли, добавляли в планшет, содержащий образцы в объеме 100 мкл, и культивировали примерно в течение 1 часа при 37С в атмосфере 5% СО₂. Затем, в каждую лунку планшета добавляли 50 мкл вируса везикулярного стоматита (VSV) при 5-7 х 10³ б.о.е., после чего клетки культивировали примерно в течение 16-20 часов при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Лунку, которая не содержала образца или стандартного материала, а содержала лишь один вирус, использовали в качестве негативного контроля, а лунку, которая содержала только клетки, использовали в качестве позитивного контроля.

После удаления культуральной среды, в планшет добавляли 100 мкл раствора нейтрального красного для окрашивания жизнеспособных клеток, а затем инкубировали в течение 2 часов при 37°С в атмосфере 5% СО₂. После удаления супернатантов, в каждую лунку планшета добавляли 100 мкл смеси 1:1 100% этанола и 1% уксусной кислоты. После тщательного перемешивания для растворения всех кристаллов нейтрального красного, элюированного из окрашенных клеток, измеряли оптическую плотность при 540 нм. Негативный контроль использовали в качестве пустышки и вычисляли величины ED₅₀ (дозы, вызывающие 50%-ное ингибирование клеточного роста), принимая клеточный рост позитивного контроля за 100%.

Таблица 8
	Конц. (нг/мл)	Удельная активность (МЕ/мг)	Относительная активность (%) для нативного IFN
Нативный IFN	100	4,24Е+08	100
IFN-40К PEG	100	2,04Е+07	4,8
IFN-PEG-альбумин	100	2,21Е+07	5,2
IFN-PEG-Fc	100	1,19Е+08	28,1
IFN-PEG-DG Fc	100	1,09Е+08	25,7
IFN-PEG-производное рекомбинантного AG Fc	100	9,58Е+07	22,6

Как показано в таблице 8, IFN-40К PEG давал уменьшение активности до 4,8% по отношению к активности нативного IFN. В частности, по мере увеличения размера PEG-части, стабильность белкового конъюгата в сыворотке увеличивалась, а его активность постепенно снижалась. Сообщалось, что интерферон-альфа при его модификации 12 кДа-PEG имеет in vitro активность 25%, а при модификации 40 кДа-PEG его активность составляет 7% (Р. Bailon et al., Bioconjugate Chem. 12: 195-202, 2001). Таким образом, поскольку, при увеличении молекулярной массы PEG-части, время полужизни белкового конъюгата увеличивается, а его биологическая активность резко снижается, то необходимо было получить такой белковый конъюгат, который имел бы продолжительное время полужизни в сыворотке и более высокую активность. Кроме того, конъюгат IFN-PEG-альбумин имел слабую активность, которая составляла примерно 5,2% от активности нативного IFN. В противоположность этому, конъюгаты IFN-PEG-Fc и IFN-PEG-DG Fc настоящего изобретения обнаруживали значительно более высокую относительную активность (по отношению к активности нативного IFN), 28,1% и 25,7%. Кроме того, конъюгирование IFN с производным рекомбинантного AG Fc приводило к аналогичному увеличению активности. Исходя из этих результатов, имеются все основания предполагать, что интерферон-альфа, конъюгированный с Fc-фрагментом иммуноглобулина, имеет значительно более длительное время полужизни в сыворотке и обладает значительно более высокой фармацевтической эффективностью in vivo.

<4-2> Сравнение внутриклеточных активностей конъюгатов белка человеческого гормона роста.

Для сравнения внутриклеточной активности конъюгатов белка человеческого гормона роста, проводили сравнительную оценку внутриклеточной активности конъюгат hGH-PEG-Fc, hGH-40К PEG и hGH-PEG-альбумин.

Внутриклеточные активности конъюгатов hGH измеряли с помощью in vitro анализа с использованием клеточной линии нодулярной лимфомы крыс, Nb2 (Европейская коллекция клеточных культур (ЕСАСС) #97041101), в которой наблюдался зависящий от человеческого гормона роста митогенез.

Клетки Nb2 культивировали в среде Фишера, в которую были добавлены 10% FBS (фетальной бычьей сыворотки), 0,075% NaCO₃, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ глутамина, после чего их 24 часа культивировали в той же самой среде, но не содержащей 10% FBS. Затем культивированные клетки подсчитывали и в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли примерно 2х10⁴-аликвоты клеток. Затем конъюгат hGH-PEG-Fc, конъюгат hGH-40К PEG, конъюгат hGH-PEG-альбумин (стандартные конъюгаты, поставляемые Национальным институтом по биологическим стандартам и контролю (NIBSC)), используемые в качестве контроля, и нативный человеческий гормон роста (НМ-hGH) разводили и добавляли в каждую лунку при различных концентрациях с последующим инкубированием в течение 48 часов при 37^оС в атмосфере 5% СО₂. После этого для измерения пролиферативной активности клеток путем определения числа клеток в каждой лунке, в каждую лунку добавляли 25 мкл 1х водного раствора реагента 96 для определения клеточного титра (Promega) и клетки снова культивировали в течение 4 часов. Затем измеряли оптическую плотность при 490 нм и подсчитывали титр для каждого образца. Результаты представлены ниже в таблице 9.

Таблица 9
	Конц. (нг/мл)	Удельная активность (МЕ/мг)	Относительная активность (%) для нативного НМ-hGH
Нативный hGH	100	2,71Е+06	100
hGH (стандарт от NIBSC)	100	2,58Е+06	95,2
hGH-40К PEG	100	0,206Е+06	7,6
hGH-PEG-альбумин	100	0,141Е+06	5,2
hGH-PEG-Fc	100	0,76Е+06	28,1
Удельная активность*=1/ED50х106 (ED50: количество белка, необходимого для стимуляции 50%-го роста от максимального роста клеток.

Как показано в таблице 9, в случае человеческого гормона роста, конъюгирование с 40 кДа-PEG (hGH-40К PEG) также приводило к снижению активности примерно на 7,6% по сравнению с активностью нативной формы, а конъюгат hGH-PEG-альбумин обнаруживал низкую in vitro активность, которая составляла примерно 5,2% от активности нативного hGH. Однако конъюгат hGH-PEG-Fc настоящего изобретения обнаруживал увеличение относительной активности на более чем 28% по отношению к активности нативного hGH. Исходя из этих результатов имеются все основания предполагать, что человеческий гормон роста, конъюгированный с Fc-фрагментом иммуноглобулина, имеет значительно более длительное время полужизни в сыворотке и обладает значительно более высокой фармацевтической эффективностью in vivo. Кроме того, очевидно, что повышенная активность белковых конъюгатов Fc иммуноглобулина настоящего изобретения обусловлена увеличением их стабильности в сыворотке и сохранением аффинности связывания с рецепторами благодаря присутствию Fc иммуноглобулина или наличию пространства, образованного не-пептидным полимером. Поэтому можно предположить, что такими эффектами также обладают белковые конъюгаты Fc-фрагмента иммуноглобулина, связанного с другими физиологически активными белками.

<4-3> Сравнение внутриклеточных активностей конъюгатов белка G-CSF

Для сравнения внутриклеточных активностей белковых конъюгатов с производным G-CSF, проводили сравнение внутриклеточной активности нативного G-CSF (Filgrastim, Jell Pharm. Co., Ltd.), ¹⁷S-G-CSF-производного, 20К PEG-G-CSF (Neulasta), 40К PEG-¹⁷Ser-G-CSF, ¹⁷Ser-G-CSF-PEG-альбумин и ¹⁷S-G-CSF-PEG-Fc.

Сначала, человеческую миелоидную клеточную линию HL-60 (АТСС CCL-240, пациентка с промиелоцитарным лейкозом/36-летняя женщина индоевропейской расы) культивировали в среде RPMI 1640, в которую было добавлено 10% FBS. Культивированные клетки суспендировали при плотности примерно 2,2х10⁵ клеток/мл, и добавляли ДМСО (диметилсульфоксид со степенью чистоты, пригодной для культивирования, Sigma) при конечной концентрации 1,25% (об./об.). Затем 90 мкл клеточной суспензии высевали в каждую лунку 96-луночного планшета (Corning/96-луночный планшет с выпариванием при низкой температуре), после чего планшет оставляли до достижения плотности примерно 2х10⁴ клеток на лунку и культивировали в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение примерно 72 часов.

Каждый образец, в котором концентрация белка была определена с использованием набора для ELISA G-CSF (R&D systems), разводили средой RPMI 1640 до идентичной концентрация 10 мкг/мл, а затем проводили двухкратное разведение средой RPMI 1640 девятнадцать раз. Эти серийные двухкратные разведения отдельно добавляли в каждую лунку, содержащую клетки HL-60 в объеме 10 мкл, так, чтобы концентрация каждого образца изначально составляла 1 мкг/мл. Затем клетки культивировали в инкубаторе при 37°С в течение 72 часов.

Пролиферацию клеток HL-60 анализировали с использованием реагента 96 для определения клеточного титра (Cell Titer 96^TM (Cat. NO G4100, Promega) и увеличивающееся число клеток определяли путем измерения оптической плотности при 670 нМ.

Таблица 10
	ED50 (МЕ/мг)	Относительная активность (%) для нативного G-CSF
Нативный G-CSF	0,30	100
17Ser-G-CSF	0,26	115
G-CSF-20К PEG (Neulasta)	1,20	25
17Ser-G-CSF-40К PEG	10,0	<10,0
17Ser-G-CSF-PEG-альбумин	1,30	23,0
17Ser-G-CSF-PEG-Fc	0,58	51,7

Как показано в таблице 10, белковые конъюгаты Fc иммуноглобулина и производного G-CSF, имеющие аминокислотную замену, ¹⁷Ser-G-CSF, также обнаруживали такие же эффекты, как и нативные белковые G-CSF-конъюгаты. Ранее уже сообщалось, что ¹⁷Ser-G-CSF-PEG имел относительно более длительное время полужизни в сыворотке, но более низкую активность по сравнению с не-PEGилированным ¹⁷Ser-G-CSF (публикация выложенной корейской патентной заявки 2004-82268). Более конкретно, по мере увеличения размера PEG-части, стабильность белкового конъюгата в сыворотке увеличивалась, а его активность постепенно снижалась. ¹⁷Ser-G-CSF-40К PEG обнаруживал очень низкую активность, которая составляла примерно менее 10% от активности нативной формы. Таким образом, поскольку, при увеличении молекулярной массы PEG-части, время полужизни белкового конъюгата в сыворотке увеличивается, а его биологическая активность резко снижается, то необходимо получить такой белковый конъюгат, который имел бы более длительное время полужизни в сыворотке и более высокую активность. Конъюгат ¹⁷Ser-G-CSF-PEG-альбумин также обнаруживал слабую активность, которая составляла примерно 23% от активности нативного G-CSF. В противоположность этому, конъюгат ¹⁷Ser-G-CSF-PEG-Fc обладал значительно более высокой относительной активностью, которая составляла более чем 51% от активности нативного G-CSF. Исходя из этих результатов, имеются все основания предполагать, что ¹⁷Ser-G-CSF, конъюгированный с Fc-фрагментом иммуноглобулина, имеет значительно более длительное время полужизни в сыворотке и обладает значительно более высокой фармацевтической эффективностью in vivo.

<4-4> Анализ на нейтрализацию цитотоксичности Fab’-конъюгатов

Анализ на активность in vitro проводили с использованием конъюгатов Fab’-S-PEG-N-Fc и Fab’-N-PEG-N-Fc, полученных как описано в примерах 8 и 9, и комплекса Fab’-S-40К PEG, полученного как описано в сравнительном примере 3. В процессе анализа на цитотоксичность, проводимого путем измерения TNF-опосредованной цитотоксичности, оценивали Fab’-конъюгаты для того, чтобы определить, нейтрализуют ли указанные конъюгаты TNF-индуцированный апоптоз в клеточной линии мышиных фибробластов, L929 (АТСС CRL-2148).

Конъюгаты Fab’-S-PEG-N-Fc и Fab’-N-PEG-N-Fc и комплекс Fab’-S-40К PEG подвергали серийному двухкратному разведению и в лунки 96-луночного планшета добавляли 100 мкл-аликвоты. rhTNF- (R&D Systems) и актиномицин D (Sigma), используемый в качестве ингибитора синтеза РНК при конечных концентрациях 10 нг/мл и 1 мкг/мл соответственно добавляли в каждую лунку, а затем инкубировали в течение 30 минут в инкубаторе при 37°С в 5% СО₂ и переносили в микропланшет для анализа. В каждую лунку добавляли клетки L929 при плотности 5х10⁴ клеток/50 мкл среды и культивировали в течение 24 часов в инкубаторе при 37°С в 5% СО₂. После удаления культуральной среды, в каждую лунку добавляли 50 мкл МТТ (Sigma), растворенного в PBS при концентрации 5 мг/мл, и клетки культивировали примерно в течение 4 часов в инкубаторе при 37°С в 5% СО₂. Затем в каждую лунку добавляли 150 мкл ДМСО и определяли степень нейтрализации цитотоксичности путем измерения оптической плотности при 540 нм. В качестве контроля использовали Fab’, очищенный в стадии 1 примера 8.

Как показано на фиг.13, все белковые конъюгаты, используемые в этом тесте, имели такой же титр, как и Fab’. Эти результаты показали, что если белковый конъюгат получали путем присоединения Fc иммуноглобулина к свободному цистеиновому остатку у N-конца или у С-конца Fab’, посредством PEG, то Fab’ имел значительно более длительное время полужизни в сыворотке и обладал высокой активностью in vivo.

<4-5> Анализ на комплементзависимую цитотоксичность (CDC)

Для того чтобы определить, связываются ли производные, полученные как описано в примерах, и белки, соответствующие константным областям иммуноглобулинов, которые были экспрессированы в трансформантах E.coli или очищены, с человеческим C1q, проводили твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) в соответствии с нижеописанной процедурой. В качестве тест-групп были использованы константные области иммуноглобулина, полученные с использованием трансформантов НМ10932 и НМ10927 и депонированные в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ) 15 сентября 2004 под регистрационными номерами КССМ-10597 и КССМ-10598, и производные, полученные как описано в предыдущих примерах. В качестве стандартов были использованы гликозилированный иммуноглобулин (IVIG-глобулин S, Green Cross PBM) и несколько коммерчески доступных антител, применяемых в качестве терапевтических антител. Тестируемые и стандартные образцы приготавливали в 10 мМ карбонатного буфера (рН 9,6) при концентрации 1 мкг/мл. Образцы разделяли на аликвоты и вносили в 96-луночный планшет (Nunc) в количестве 200 нг на лунку и планшет оставляли на ночь при 4°С для сенсибилизации. Затем каждую лунку три раза промывали PBS-T (137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ КН₂РО₄, 0,05% твина-20), блокировали 250 мкл блокирующего буфера (1% альбумина бычьей сыворотки в PBS-T) при комнатной температуре в течение ночи, после чего снова три раза промывали тем же самым PBS-T. Стандартные и тестируемые образцы разводили PBS-T в предварительно определенной концентрации и добавляли в сенсибилизированные антителами лунки, планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем три раза промывали PBS-T. После этого в планшет добавляли 2 мкг/мл Clq (R&D Systems) и этот планшет оставляли для реакции на 2 часа при комнатной температуре, а затем шесть раз промывали PBS-T. Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл, при 1:1000-разведении, конъюгата человеческая пероксидаза-антитело против человеческого Clq (Biogenesis, USA) в блокирующем буфере и оставляли для реакции на 1 час при комнатной температуре. После трехкратной промывки каждой лунки PBS-T, равные объемы окрашивающих реагентов А и В смешивали (окрашивающий реагент А: стабилизированная пероксидаза; и окрашивающий реагент В: стабилизированный хромоген; DY 999, R&D Systems), а затем в каждую лунку добавляли 200 мкл смеси, и смесь инкубировали в течение 30 минут. После этого в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора 2М серной кислоты для завершения реакции. Планшет считывали с использованием микропланшет-ридера (Molecular Device). Оптическую плотность стандартных и тестируемых образцов измеряли при 450 нм, и полученные результаты были систематизированы на фиг.14 и 15 соответственно.

При сравнивании подклассов иммуноглобулина на активность их Fc-фрагментов по отношению к комплементу, самая высокая аффинность связывания с C1q наблюдалась для человеческого иммуноглобулина IgG1 (Fitzgerald), более низкая – в IgG2 (Fitzgerald), а еще более низкая – в IgG4 (Fitzgerald), что указывало на различие в активностях этих подклассов по отношению к комплементу. IVIG, используемый в этом тесте и представляющий собой пул подклассов IgG, обладал почти такой же аффинностью связывания с C1q, как и очищенный IgG1, поскольку IVIG, в основном, состоит из IgG1. По сравнению с этими стандартами, с точки зрения изменения аффинности связывания с C1q при агликозилировании, активность Fc IgG1, обладающего наиболее сильной активностью по отношению к комплементу, заметно снижалась. Fc IgG4, который, как известно, не индуцирует активацию комплемента, в очень редких случаях обладал аффинностью связывания с C1q, что указывает на то, что Fc IgG4, может быть использован как превосходный рекомбинантный носитель, не обладающий активностью по отношению к комплементу (фиг.14).

Для того чтобы определить, сохраняет ли данный носитель присущее ему отсутствие аффинности связывания с C1q даже после его конъюгирования с физиологически активным пептидом, были получены конъюгаты IFN-альфа-Fc с использованием гликозилированного Fc, ферментативно дегликозилированного Fc и агликозилированного рекомбинантного Fc в качестве носителей для IFN-альфа, и эти конъюгаты оценивали на их аффинность связывания с C1q. Гликозилированный конъюгат IFN-альфа с присоединенным к нему Fc (IFN-PEG-Fc: гликозилированный IgG1Fc) сохранял высокую аффинность связывания с C1q. В противоположность этому, если интерферон-альфа присоединен к Fc, который был дегликозилирован с использованием PNGазы F и других ферментов, то полученный конъюгат (IFN-PEG-DGFc: дегликозилированный IgG1Fc) обнаруживал значительно более низкую аффинность связывания с C1q, которая была аналогична аффинности происходящего от E.coli конъюгата агликозилированного Fc. Кроме того, в случае, когда IgG1-часть конъюгата агликозилированного IgG1 с Fc, присоединенным к интерферону-альфа (IFN-PEG-AGFcG1: агликозилированный IgG1Fc) заменяли на IgG4-часть, то полученный конъюгат интерферона (IFN-PEG-FcG4, производное 1: агликозилированный IgG4Fc) обнаруживал полную потерю своей аффинности связывания с C1q. Когда IgG1-Fc-часть заменяли на мономер Fc IgG4, то также отмечали, что полученный конъюгат (IFNa-PEG-FcG4, производное 2:

агликозилированный IgG4Fc) полностью терял способность связываться с C1q. Эти результаты показали, что такие формы Fc-фрагмента IgG4 могут быть использованы в качестве превосходных носителей, у которых отсутствуют эффекторные функции, присущие фрагментам антител (фиг.15).

Экспериментальный пример 5: Измерение относительной активности ЕРО-ПЭГ-Fc

<5-1> Измерение относительной активности BRP-EPO относительно ЕРО-ПЭГ-Fc

Биологическую активность конъюгата ЕРО-ПЭГ-Fc измеряли способом, описанным в европейской фармакопеи (ЕР). Мышам с моделью гипоксии, BDF-1, вводили ЕРО-ПЭГ-Fc в 3 различных концентрациях, а затем измеряли повышение количества ретикулоцитов в крови для оценки относительной активности ЕРО-ПЭГ-Fc относительно BRP-EPO.

Биологическая активность конъюгата ЕРО-ПЭГ-Fc составила 6580000 Ед/мг по концентрации ЕРО. Также биологическая активность составляла 248000 Ед/мг по концентрации всего белка. Таким образом, биологическая активность ЕРО-ПЭГ-Fc была значительно выше, чем активность ЕРО (>100,000 Ед/мг).

<5-2> Тест PD in vivo

Измеряли изменение концентрации ретикулоцитов после однократного введения конъюгата ЕРО-ПЭГ-Fc крысам SD. Крысам RD вводили одинаковое количество природного ЕРО (Recormon, Roche) и в качестве контроля высокогликозилированный ЕРО (Aranesp, Amgen) соответственно и вводили ЕРО-ПЭГ-Fc в том же количестве, что нативный ЕРО и высокогликозилированный ЕРО, и 1/10 указанного количества ЕРО-ПЭГ-Fc. Результаты показаны на фиг.16.

В результате у группы, которой вводили ЕРО-ПЭГ-Fc в количестве 1/10 нативного ЕРО и высокогликозилированный ЕРО, отмечали сходное повышение концентрации ретикулоцитов с концентрацией группы, которой вводили природный ЕРО и высокогликозилированный ЕРО. Кроме того, у группы, которой вводили ЕРО-ПЭГ-Fc в том же количестве, что и природный ЕРО и высокогликозилированный ЕРО, отмечали аналогичное повышение концентрации ретикулоцитов, но время возращения к нормальной концетрации ретикулоцитов было в 10-раз длиннее, чем у природного ЕРО и высокогликозилированного ЕРО. Следовательно, эти результаты указывают, что ЕРО-ПЭГ-Fc в 10 раз сильнее, чем природный ЕРО и высокогликозилированный ЕРО.

Экспериментальный пример 6; Тест на повышение массы

Измеряли биологическую активность конъюгата hGH-ПЭГ-Fc. Крысам с удаленным гипофизом вводили природный hGH ЕРО-ПЭГ-Fc, и затем измеряли повышение веса.

Конкретно, ежедневно вводили 300 мкг/кг rhGH в течение 12 суток (общее введенное количество: 3600 мкг/кг) в качестве контроля. Также вводили 600 мкг/кг hGH-ПЭГ-Fc два раза в течение 12 суток (общее введенное количество: 1200 мкг/кг) и 300 мкг/кг hGH-ПЭГ-Fc четыре раза в течение 12 суток (общее введенное количество; 1200 мкг/кг). Результаты показаны на фиг.17.

В результате, в группе, которой вводили hGH-ПЭГ-Fc в количестве 1/3 природного hGH 1 раз в течение 6 дней, отмечали сходное изменение веса как в группе, которой вводили природный hGH. Кроме того, у группы, которой вводили hGH-ПЭГ-Fc в количестве 1/3 природного hGH 2 раза в течение 6 дней, отмечали большее повышение массы, чем в группе, получавшей природный hGH. Следовательно, эти результаты указывают, что биологическая активность hGH-ПЭГ-Fc в 6 раз выше активности природного.

Экспериментальный пример 7: Конъюгат IFN альфа-2а (НМ10660А) с повышенной продолжительностью действия

В этом эксперименте измеряли in vivo активность конъюгата IFN альфа-2а (IFN-PEG-Fc) с повышенной продолжительностью действия. Клетки SK-OV-3 (раковые клетки яичника человека) трансплантировали мышам nude. Мышам nude вводили 30 мкг/кг нативного IFN альфа-2а, 5 дней/неделя в течение 4 недель. Другим мышам nude вводили 30 или 150 мкг/кг IFN-PEG-Fc (НМ10660А), один раз в неделю в течение 4 недель. Измеряли способность ингибировать рост раковых клеток.

Как показано на фиг.18, активность конъюгата IFN-PEG-Fc по настоящему изобретению выше физиологической активности природного IFN.

Экспериментальный пример 8: Конъюгат G-CSF (HM10460A) с повышенной продолжительностью действия

В этом эксперименте измеряли in vivo активность конъюгата G-CSF (G-CSF-PEG-Fc) с повышенной продолжительностью действия. Модель нейтропении получали путем введения противоопухолевого средства СРА у мышей CD-1. Через 2 дня после введения СРА, мышам с моделью нейтропении однократно вводили 200 мкг/кг G-CSF-PEG-FC (НМ10460А). В сравнительном эксперименте другим мышам с моделью нейтропении вводили 50 мкг/кг/день филграстим (природный G-CSF) в течение 4 последовательных дней. Затем измеряли повышение ANC в каждой группе.

Как показано на фиг.19, конъюгат G-CSF-PEG-FC по настоящему изобретению имел гораздо большую активность, по сравнению с физиологической активностью природного G-CSF.

Промышленная применимость

Как описано выше, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению обеспечивает значительное увеличение времени полужизни лекарственных средств в плазме. С другой стороны, использование белковых конъюгатов позволяет устранить большинство значительных недостатков, присущих стандартным композициям пролонгированного действия, путем снижения титров лекарственных средств, и, тем самым, увеличения их времени пребывания в кровотоке и увеличения in vivo активности этих белковых конъюгатов по сравнению с альбумином, который, как ранее считалось, является наиболее эффективным. Кроме того, при использовании указанных белковых конъюгатов риск индуцирования иммунных ответов отсутствует. Благодаря этим преимуществам, указанные белковые конъюгаты могут быть использованы для изготовления белковых лекарственных препаратов пролонгированного действия. В соответствии с настоящим изобретением, белковые лекарственные препараты пролонгированного действия способны ослаблять боли у пациентов, возникающие при частых инъекциях, а также поддерживать соответствующие концентрации активных полипептидов в сыворотке в течение длительного периода времени, и тем самым обеспечивать стабильную фармацевтическую эффективность.

Кроме того, описанный способ получения белкового конъюгата позволяет решить проблемы, связанные с продуцированием гибридных белков путем генетических манипуляций, включая трудности, связанные с получением экспрессионных систем и с гликозилированием, отличающимся от гликозилирования нативной формы; с риском индуцирования иммунного ответа; с ограниченной ориентацией белкового гибрида и с низкими выходами, обусловленными неспецифическими реакциями; а также проблемы, связанные с химическим синтезом, такие как токсичность химических соединений, используемых в качестве связующих агентов, а поэтому указанный способ получения белковых лекарственных средств с более длительным временем полужизни в сыворотке и с высокой активностью является экономически выгодным.

Формула изобретения

1. Физиологически активный белковый конъюгат, состоящий из физиологически активного полипептида и Fc-фрагмента иммуноглобулина, причем указанный полипептид и указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина ковалентно связаны посредством PEG (полиэтиленгликоля).

2. Белковый конъюгат по п.1, где PEG на обоих своих концах ковалентно связан через реакционно-способную группу с физиологически активным полипептидом и Fc-фрагментом иммуноглобулина.

3. Белковый конъюгат по п.1, где указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина является негликозилированным.

4. Белковый конъюгат по п.1, где указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина состоит из 1-4 доменов, выбранных из группы, включающей домены С_H1, С_H2, С_H3 и
С_H4.

5. Белковый конъюгат по п.4, где указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина, кроме того, содержит шарнирную область.

6. Белковый конъюгат по п.1, где указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина выбран из группы, состоящей из Fc-фрагментов IgG, IgA, IgD, IgE, IgM и их комбинаций и гибридов.

7. Белковый конъюгат по п.6, где указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина выбран из группы, состоящей из Fc-фрагментов IgGI, IgG2, IgG3, IgG4 и их комбинаций и гибридов.

8. Белковый конъюгат по п.7, где указанным Fc-фрагментом иммуноглобулина является Fc-фрагмент IgG4.

9. Белковый конъюгат по п.8, где указанным Fc-фрагментом иммуноглобулина является Fc-фрагмент агликозилированного IgG4 человека.

10. Белковый конъюгат по п.2, где указанная реакционно-способная группа PEG выбрана из группы, состоящей из альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутилальдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного.

11. Белковый конъюгат по п.10, где указанным сукцинимидным производным является сукцинимидилпропионат, сукцинимидилкарбоксиметил, гидроксисукцинимидил или сукцинимидилкарбонат.

12. Белковый конъюгат по п.11, где PEG имеет на обоих концах реакционно-способную альдегидную группу в качестве реакционно-способной группы.

13. Белковый конъюгат по п.1, где PEG каждым из своих концов посредством свободной реакционно-способной группы присоединен к амино-концу, лизиновому остатку, гистидиновому остатку или цистеиновому остатку Fc-фрагмента иммуноглобулина и физиологически активного полипептида.

14. Белковый конъюгат по п.1, где указанный физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из гормонов, цитокинов, ферментов, антител, факторов роста, факторов регуляции транскрипции, факторов свертывания крови, антигенов вирусных вакцин, структурных белков, белков-лигандов и рецепторов.

15. Белковый конъюгат по п.14, где указанный физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из гормона роста человека, релизинг-фактора гормона роста, пептида, высвобождающего гормон роста, интерферонов, рецепторов интерферона, колониестимулирующих факторов, глюкагон-подобных пептидов, рецептора, связанного с G-белком, интерлейкинов, рецепторов интерлейкинов, ферментов, интерлейкин-связывающих белков, цитокин-связывающих белков, фактора активации макрофагов, пептида макрофага, В-клеточного фактора, Т-клеточного фактора, белка А, ингибитора аллергии, гликопротеинов некроза клеток, иммунотоксина, лимфотоксина, фактора некроза опухоли, супрессоров опухолей, метастатического фактора роста, антитрипсина альфа-1, альбумина, альфа-лактальбумина, аполипопротеина-Е, эритропоэтина, высокогликозилированного эритропоэтина, ангиопоэтинов, гемоглобина, тромбина, пептида, активирующего рецептор тромбина, тромбомодулина, фактора VII, фактора VIIa, фактора VIII, фактора IX, фактора XIII, фактора активации плазминогена, фибрин-связывающего пептида, урокиназы, стрептокиназы, гирудина, белка С, С-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, лептина, тромбоцитарного фактора роста, эпителиального фактора роста, эпидермального фактора роста, ангиостатина, ангиотензина, фактора роста костей, белка, стимулирующего рост костей, кальцитонина, инсулина, атриопептина, фактора, индуцирующего образование хряща, элкатонина, фактора активации соединительной ткани, ингибитора пути тканевого фактора, фолликуло-стимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, релизинг-фактора лютеинизирующего гормона, факторов роста нервной ткани, паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулин-подобного фактора роста, адренокортикоидного гормона, глюкагона, холецистокинина, панкреатического полипептида, пептида, высвобождающего гастрин, релизинг-фактора кортикотропина, тиреоид-стимулирующего гормона, аутотаксина, лактоферрина, миостатина, рецепторов, антагонистов рецепторов, антигенов клеточной поверхности, антигенов вирусных вакцин, моноклональных антител, поликлональных антител и фрагментов антител.

16. Белковый конъюгат по п.15, где указанным физиологически активным полипептидом является гормон роста человека, интерферон-альфа, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин или Fab’-фрагмент антитела.

17. Способ получения белкового конъюгата по п.1, включающий:
(а) (а1) ковалентное связывание Fc-фрагмента иммуноглобулина или физиологически активного полипептида с одним концом активированного PEG;
(а2) выделение из полученной реакционной смеси комплекса, содержащего Fc-фрагмент иммуноглобулина или физиологически активный полипептид, связанный с PEG;
(а3) ковалентное связывание физиологически активного полипептида или Fc-фрагмента иммуноглобулина соответственно с другим концом PEG выделенного комплекса с получением белкового конъюгата, содержащего Fc-фрагмент иммуноглобулина и физиологически активный полипептид, ковалентно связанные посредством PEG; и
(b) выделение указанного белкового конъюгата по п.1, где физиологически активный полипептид и Fc-фрагмент ковалентно связаны через PEG,
где на стадии (а1) физиологически активный полипептид и PEG используют в реакционной смеси в молярном соотношении 1:1,25-1:5, или Fc фрагмент иммуноглобулина и PEG используют в реакционной смеси в молярном соотношении 1:5-1:10, и где на стадии (а3) комплекс, полученный на стадии (а2) и Fc фрагмент иммуноглобулина или указанного физиологически активного полипептида, используют в реакционной смеси в молярном соотношении 1:0,5-1:20.

РИСУНКИ