Патент на изобретение №2356575
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА DIROFILARIA REPENS
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к иммунодиагностике, и может быть использовано для прижизненной серодиагностики дирофиляриоза у животных и человека. Способ включает получение очищенного соматического антигена Dirofilaria repens при помощи последовательной механической и ультразвуковой гомогенизации с экстракцией белков в 0,25 М водном растворе сахарозы, осаждение супернатанта в охлажденном ацетоне, растворение вакуумно-высушеного осадка в калий-фосфатном буфере. Способ обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности. 3 табл., 1 ил.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунодиагностике дирофиляриоза, и может быть использовано для серодиагностики данного заболевания у человека и животных. Дирофиляриоз является одной из важных проблем паразитологии. Несмотря на то, что этот паразитоз отнесен к редким, в последние годы отмечается рост числа случаев данного заболевания у человека. Это обусловлено высокой пораженностью данным возбудителем собак и отсутствием надлежащих мер по их выявлению и дегельминтизации. Диагностика дирофиляриоза у человека затруднена из-за отсутствия иммунологических тестов. Проблема иммунодиагностики этого гельминтоза является приоритетной задачей гельминтологической науки и практики, в связи с чем способ получения антигена дирофилярий имеет большую научную и практическую ценность. Известен способ получения антигена дирофилярий, включающий помещение самки Dirofilaria immitis в 0,9% солевой раствор (в соотношении 1:3), ультразвуковую гомогенизацию в трех циклах при 70 кГц в течение 30 с при температуре 0°С, центрифугирование при 15000 g в течение 30 мин при температуре 4°С, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена (Е.Espinoza, M.Cordero, A.Muro, F.Lorente, F.Simon. Anti-Dirofilaria immitis IgE: Seroepidemiology and seasonal variation in an exposed human population / Tropical Medicine and Parasitology. – 1993. – V.44. – Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, не обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности, так как дает перекрестные реакции с сыворотками крови больных другими паразитозами (токсокароз, аскаридоз, фасциолез, эхинококкоз). Для увеличения специфичности данного антигена Simon F. et al сыворотки предварительно обрабатывают антигенами Toxocara canis, Ascaris suum, Fasciola hepatica и Echinococcus granulosus (F.Simon, A.Muro, M.Corder, J.Marti. A seroepidemiologic survey of human dirofilariosis in Western Spain / Tropical Medicine and Parasitology. – 1991. – V.42. – Целью изобретения является разработка способа получения очищенного соматического антигена из неполовозрелой самки Dirofilaria repens с высокими показателями специфичности для его дальнейшего использования в диагностике дирофиляриоза у людей и животных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Цель достигается путем оптимизации условий гомогенизации паразита (использование дополнительно механической гомогенизации), что позволяет добиться полного разрушения тканей и клеток; использованием экстракции белка в 0,25 М водном растворе сахарозы, тем самым увеличивается концентрация белка в антигене; проведением дополнительной очистки антигена дирофилярий от липоидов с помощью ацетона, что повышает его специфичность. Способ включает следующие этапы. 1. Подготовка неполовозрелой самки Dirofilaria repens к гомогенизации. Неполовозрелую самку Dirofilaria repens, удаленную хирургическим путем, отмывают многократно физиологическим раствором и помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы (в соотношении 1:3). Пробу замораживают при температуре -18°С. 2. Получение полного соматического экстракта. Проводят механическую гомогенизацию гельминта 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С. Для дальнейшей экстракции белков гомогенат выдерживают при температуре 4°С в течение 12 часов. Проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С. 3. Очистка экстракта в ацетоне. Суспензию антигена медленно по каплям добавляют во флакон с охлажденным ацетоном (1 объем суспензии на 20 объемов ацетона) при непрерывном быстром перемешивании при 0°С. Смесь во флаконах выдерживают 1 час в холодильнике при температуре +4°С. Проводят центрифугирование смеси в центрифуге при 2000 об/мин в течение 8 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость удаляют. Пробирку с осадком высушивают под вакуумом в течение 3 часов при 0°С. К сухому остатку во флаконе добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 6,4. Флакон энергично встряхивают в течение 1-2 минут, а затем помещают в холодильник при 4°С на 12 часов для полной гидратации препарата. Раствор центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость используют как антиген. 4. Анализ диагностических свойств полного соматического очищенного антигена. Чувствительность и специфичность полученного антигена определяли в ИФА по общепринятой методике. Полученный антиген использовали в концентрации 40 мкг/мкл в объеме 100 мкл на лунку. Разведение сывороток 1:200. Пример 1. Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных. В опытах использовали сыворотки крови собак больных дирофиляриозом Dirofilaria repens, дирофиляриозом Dirofilaria immitis, свободных от данной инвазии и собак с другими паразитозами. Кровь всех собак предварительно была исследована на наличие микрофилярий классическим способом. Результаты представленные в таблице 1, свидетельствуют, что чувствительность и специфичность очищенного соматического антигена с сыворотками крови животных составила 100%. Пример 2. Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей. В этом эксперименте использовались сыворотки больных дирофиляриозом людей (банк сывороток Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии) и людей вне инвазии: здоровых и больных токсокарозом и другими паразитозами (лямблиозом, описторхозом). Результаты представлены в таблице 2. По результатам ИФА установлено, что чувствительность теста с сыворотками крови людей составила 84,62%, специфичность – 87,50%. Пример 3. Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибиции антител. Для этого соматический антиген в различных разведениях (концентрация белка от 21,90 до 1,10 мк/мл) добавляли в стандартизированные дозы сыворотки больного дирофиляриозом, инкубировали 30 мин при +37°С. Далее смесь антиген-антитело обрабатывали в ИФА по стандартной методике. Результаты реакции ингибиции представлены в таблице 3 и на чертеже. Как видно из таблицы и чертежа, отмечалась ярко выраженная зависимость эффекта ингибиции от внесенной дозы антигена. Чем выше концентрация белка вносимого антигена, тем ниже оптическая плотность данной сыворотки.
Формула изобретения
Способ получения очищенного соматического антигена Dirofilaria repens, включающий гомогенизацию ультразвуковую, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, отличающийся тем, что предварительно проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 ч, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20, с экспозицией 1 ч при температуре 4°С.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3. – P.172).
