Патент на изобретение №2356033

(54) СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА (ВАРИАНТЫ) И СОЕДИНЕНИЕ БЛАГОРОДНОГО МЕТАЛЛА, ИСПОЛЬЗУЕМОЕ ДЛЯ ДАННОГО СПОСОБА

(57) Реферат:

Изобретение относится к измерению поверхностного плазмонного резонанса. Способ измерения поверхностного плазмонного резонанса включает помещение соединения благородного металла на нижнюю грань призмы, облучение призмы светом для обнаружения отраженного света. Соединение благородного металла содержит заместители на стороне, противоположной стороне, контактирующей с призмой, при этом исследуемый образец добавляют к стороне, имеющей заместители в соединении благородного металла. Технический результат – изобретение дает возможность легко обнаружить существование фосфорилированного пептида (белка) и определить, является ли пептид в биологических материалах фосфорилированным или нет. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил.

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу измерения поверхностного плазмонного резонанса и к соединению благородного металла, используемому для данного способа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Определенные виды ферментов в живом организме имеют сериновый, треониновый или тирозиновый остаток на специфическом участке, таком как активный центр или аллостерический участок. Активность данных ферментов контролируется фосфорилированием или дефосфорилированием гидроксильных групп энзимами, называемыми киназами. Кроме того, в некоторых ферментах их активность контролируется фосфорилированием или дефосфорилированием аминогрупп или иминогрупп лизина, аргинина или гистидина или карбоксильных групп аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты.

В качестве таких метаболических систем, контролируемых фосфорилированием-дефосфорилированием, хорошо известны система регулирования и система расщепления гликогенеза. Данные метаболические системы главным образом являются каскадно-контролируемыми и управляются фосфорилированием-дефосфорилированием.

В последние годы стало ясно, что данное фосфорилирование-дефосфорилирование играет важную роль в метаболических системах, имеющих отношение к заболеваниям.

Например, отклонения в фосфорилировании-дефосфорилировании, как предполагают, вносят вклад в перерождение клеток в раковые клетки. То есть развитие и прерывание клеточных циклов контролируется фосфорилированием или дефосфорилированием различных ферментов (белков), причем циклин и циклинзависимая киназа (CDK) участвуют в данном фосфорилировании или дефосфорилировании. В случае, когда данный механизм поврежден, фосфорилирование или дефосфорилирование повреждено. В результате вызывается рост аберрантных клеток.

Также было выяснено, что протеин киназы С участвует в дегрануляции гистамина, приводящего к аллергическим заболеваниям, таким как атопический дерматит и сенная лихорадка, и что фосфорилированный тау-протеин участвует в нейрофибриллярном клубке, возникающем в головном мозге пациента, страдающего болезнью Альцгеймера.

Принимая во внимание вышеизложенное, понимание ситуации фосфорилирования-дефосфорилирования белков должно быть полезным не только для исследования экспрессии генов в клеточной ткани живого организма или оценки активности ферментов, но также для диагностирования и медицинского лечение заболеваний.

Однако традиционно используемые способы определения фосфорилированных или дефосфорилированных белков имеют различные недостатки.

Например, ферментный иммунологический анализ обладает преимуществом, состоящим в том, что им можно анализировать очень небольшое количество исследуемого образца белка, но трудно получить достаточное количество необходимых антител. Более того, когда молекулярная масса исследуемого протеина не превышает нескольких кДа, нельзя приготовить антитело, связывающееся с фосфорилированным участком в белке.

Кроме того, возможным способом является определение специфического связывания фосфорной кислоты с белком с использованием фосфорной кислоты, меченной радиоизотопом ³²P. Однако обращение с радиоизотопом заслуженно нуждается в особой осторожности, и использование радиоизотопа требует сбор и удаление жидких отходов.

Более того, поскольку фосфорилированные белки и дефосфорилированные белки имеют соответственно различный электрический заряд, также можно использовать двухмерный электрофорез. Однако, особенно в анализе биологических материалов, различные виды белков, включенные в образец, будут сильно затруднять идентификацию пятен. Если радиоизотоп используют для идентификации данных пятен, то вышеуказанные проблемы возрастают.

Кроме вышеописанных способов определения фосфорилированных или дефосфорилированных белков был разработан метод, использующий Поверхностный Плазмонный Резонанс (в дальнейшем называемый ППР), в качестве общего метода исследования соединений, таких как белки, специфически связывающихся с особыми соединениями, такими как лиганды (ссылка к фиг.1). В дальнейшем данный способ будет описан более детально.

Когда свет полностью отражается на поверхности раздела между материалами, имеющими различные коэффициенты преломления, на общей поверхности отражения генерируется свет, называемый нераспространяющейся волной. Кроме того, на поверхности металла генерируется вид волны сжатия электрона, возникающего на поверхности раздела металл – диэлектрическое вещество, которая называется поверхностным плазмоном. Когда угол падающего света контролируют так, что фазовые скорости как нераспространяющейся волны, так и поверхностного плазмона могут быть совпадающими, данный поверхностный резонанс будет резонансно возбуждаться, и, таким образом, данный поверхностный плазмон может значительно увеличить электромагнитное поле на поверхности металла. В данном случае, поскольку энергия падающего света поглощается возбуждением поверхностного плазмона, интенсивность отраженного света снижается.

Градус угла падения и длина волны падающего света, дающего данное поглощение, показывают значительное резкое изменение согласно состоянию поверхности металла, особенно в пределах нескольких сотен нанометров. Соответственно изменение состояния, например существование соединений на поверхности металла, чувствительно влияет на интенсивность отраженного света. Когда лиганды или аналогичные соединения связаны с поверхностью металла и затем исследуемый образец воздействует на металл, наличие соединений, взаимодействующих с лигандами или аналогичными соединениями, изменяет интенсивность отраженного света. Следовательно, когда лиганды или аналогичные соединения наносят на поверхность металла, как показано на фиг.1, и оценивают интенсивности отраженного света с добавлением и без добавления исследуемого образца, то можно добиться оценки существования соединений, взаимодействующих с лигандом или аналогичным соединением. Также можно использовать данный способ для биологической визуализации. То есть в клетках или тканях живого организма данный способ будет давать возможность изображения локализации соединения, взаимодействующего со специфическим соединением.

В японском переводе международной публикации РСТ Hei 11-512186 описан пример способа. Согласно данному документу, когда подвижный буфер исследуемый образец подвижный буфер последовательно воздействует на пленку благородного металла, как показано на фиг.1, градус угла падения, дающего ППР, показывает изменение со временем, как показано на фиг.2. Способ указанного документа измеряет данное изменение со временем и исследует минимальное и максимальное значение коэффициента отражения, а также связь между коэффициентом преломления и периодом времени. Данный документ также показывает, что можно определить константу диссоциации и константу ассоциации между соединением, нанесенным на пленку благородного металла, и соединением исследуемого образца и концентрацию соединения в образце.

Кроме того, японский перевод международной публикации РСТ Hei 10-505910 описывает способ осуществления ППР измерения. В данном способе N-(5-амино-1-карбоксипентил)иминодиацетат связан с пленкой благородного металла посредством карбоксиметилированного декстрана, далее с ним координируют никель и измеряют ППР. Поскольку данный комплекс никеля показывает специфическое сродство к пептиду, имеющему два соседних гистидиновых остатка, его называют His-tag, и он позволяет определить пептид, содержащий дигистидиновый остаток в исследуемом образце.

Кроме того, для измерения поверхностного плазмонного резонанса можно использовать спектроскопию комбинационного рассеивания. Спектроскопия комбинационного рассеивания представляет собой метод получения информации о соединениях, где в рассеянном свете, генерированном облучением вещества монохроматическим светом с фиксированной частотой _О, измеряют рассеянный свет (свет комбинационного рассеивания) (_О±_i), отличный от вышеупомянутой частоты. Более детально, поскольку данная частота комбинационного рассеивания _I равна частоте между колебательными уровнями или энергии вращения молекулы, или кристаллической составляющей вещества, это обеспечивает источники информации для определения, идентификации и количественного анализа энергетических уровней вещества (ссылка на Dictionary for Chemistry (Kagaku Daijiten)” (Tokyo Kagaku Dojin).

Однако поскольку данный свет комбинационного рассеивания является очень слабым, его измерение обычно осуществляли, увеличивая свет, используя эффект поверхностного плазмонного резонанса (например, публикация нерассмотренной заявки на патент Hei 9-257578). Хотя, в общем, свет не соединяется с электронной волной (плазмоном), он может соединяться на поверхности металлической частицы. В таком случае данный технический прием увеличивает интенсивность слабой полосы комбинационного рассеивания металлом, существующим в непосредственной близости к образцу, который необходимо измерить.

Однако эффект усиления интенсивности полосы комбинационного рассеивания посредством традиционной технологии не являлся непременно удовлетворительным. Причина заключается в том, что не все целевые молекулы могут контактировать с металлом, даже когда подложку (металл) 2 и образец 3 заставляют близко находиться друг к другу, как на фиг.1 Hei 9-257578, хотя меньшее расстояние между целевой молекулой и металлом дает более сильный эффект поверхностного плазмонного резонанса. Такое же обстоятельство наблюдается, когда металл добавляют в водный раствор образца.

Между прочим, Hironori Takeda et al., RAPID COMMUNICATIONS IN MASSSPECTROMETRY, vol.17, Issue 18, pp.2075-2081 (2003) описывает способ определения молекулярной массы фосфорилированного соединения с использованием соединения, специфически связанного с фосфатной группой, т.е. группой сложного моноэфира фосфорной кислоты. Однако данный документ не предоставляет ни описания, ни предложения технической идеи как заставить металл приблизиться к целевому соединению посредством данного специфического связывающего соединения или идеи применения данного соединения для измерения поверхностного плазмонного резонанса.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

При вышеописанной ситуации цель настоящего изобретения состоит в предложении способа измерения поверхностного плазмонного резонанса для обнаружения фосфорилированного пептида (белка) в исследуемом образце и для оценки того, является ли пептид фосфорилированным или нет. Цель настоящего изобретения также заключается в предложении соединения благородного металла, применимого для данного способа, которое содержит заместители (Phos-tag) со специфической и высокой координационной способностью по отношению к группе сложного моноэфира фосфорной кислоты.

Кроме того, другая цель настоящего изобретения состоит в предложении предшественника для получения соединения благородного металла, содержащего на своей поверхности Phos-tag в качестве заместителей.

Чтобы решить описанные выше проблемы, авторы настоящего изобретения посвятили себя исследованию комплекса металла, способного координироваться с фосфатной группой (группой сложного моноэфира фосфорной кислоты), связанной с белком, и обнаружили, что заместитель по настоящему изобретению имеет чрезвычайно высокую способность координации с двумя гидроксильными группами в ионе фосфорной кислоты или в сложном моноэфире фосфорной кислоты, в результате заместитель может образовывать связь с пептидом или сильно координировать фосфатную группу (группу сложного моноэфира фосфорной кислоты), и он может специфически связываться с фосфорилированным пептидом с получением комплекса даже в смешанном образце, включающем множество пептидов. Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что измерение ППР с использованием данного заместителя может решить вышеописанные проблемы, приведя к осуществлению настоящего изобретения.

Первый способ измерения поверхностного плазмонного резонанса включает

помещение соединения благородного металла на нижнюю грань призмы, облучение призмы светом для обнаружения отраженного света, где

соединение благородного металла содержит заместители следующей ниже формулы (I) на стороне, противоположной стороне, контактирующей с призмой, и

исследуемый образец добавляют к стороне, содержащей заместители (I) в соединении благородного металла

где Х представляет связующую группу.

Кроме того, второй способ измерения поверхностного плазмонного резонанса по настоящему изобретению включает добавление соединения благородного металла, содержащего заместители вышеуказанной формулы (I) на своей поверхности, к исследуемому образцу и использование спектроскопии комбинационного рассеивания.

Соединение благородного металла по настоящему изобретению используют для вышеуказанного способа измерения поверхностного плазмонного резонанса, и оно имеет заместители, представленные формулой (I), на своей поверхности. Когда соединение благородного металла используют первым способом, оно предпочтительно имеет форму пленки, а когда его используют вторым способом, оно предпочтительно имеет форму частиц.

Соединение-предшественник в качестве промежуточного продукта соединения благородного металла легко превращается в соединение благородного металла обработкой солями цинка или аналогичными соединениями, и оно имеет заместители, представленные формулой (VII), на поверхности благородного металла. Поскольку форму соединения-предшественника определяют в соответствии с формой соединения благородного металла в качестве получаемого целевого соединения, предпочтительно оно имеет форму пленки металла или форму частицы металла

где X представляет связующую группу.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 схематически иллюстрирует одну процедуру измерения ППР. После регулирования длины волны падающего света и угла падения для измерения ППР, то есть для уменьшения интенсивности отраженного света, к пленке благородного металла, содержащей связанный лиганд, добавляют исследуемый образец и наблюдают изменение интенсивности падающего света. На данной фигуре номер позиции 1 представляет призму, 2 представляет пленку благородного металла, 3 представляет лиганд и 4 представляет белок, включенный в исследуемый образец, который взаимодействует с лигандом.

Фиг.2 схематически иллюстрирует изменение со временем угла ППР при непрерывном использовании в порядке подвижный буфер исследуемый образец подвижный буфер, при измерении ППР на фиг.1. Данный чертеж иллюстрирует, что связывание соединения в исследуемом образце с пленкой благородного металла дает изменение в угле падения в измерении ППР.

Фиг.3 иллюстрирует результат ППР измерения образца, включающего фосфорилированный -казеин.

Фиг.4 иллюстрирует результат ППР измерения образца, включающего дефосфорилированный -казеин.

Фиг.5 иллюстрирует результат ППР измерения образца, включающего нефосфорилированный бычий сывороточный альбумин (BSA) в качестве обычного белка.

Фиг.6 иллюстрирует разницу, полученную вычитанием RU значений проточной ячейки B из RU значений проточной ячейки A в результатах тестов, проиллюстрированных на фиг.3-5.

Фиг.7 иллюстрирует результат ППР измерений образцов, включающих фосфорилированный пептид (P-p60csrc) или нефосфорилированный пептид (p60csrc).

Фиг.8 иллюстрирует результат ППР измерений образца, включающего фосфорилированный -казеин.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В дальнейшем, прежде всего, будет описан способ измерения ППР по настоящему изобретению.

Измерение ППР в первом способе по настоящему изобретению можно осуществить, используя широко известные приборы. Например, можно использовать прибор, описанный в подробном описании патента США 5313264. Данный способ измерения ППР чрезвычайно подходит для определения фосфорилированного пептида, основываясь на преимуществах, что:

1) операция введения метки, например введение флуоресцентной окрашивающей группы, не является необходимой,

2) способ обладает высокой чувствительностью по отношению к молекулам со сравнительно высокой молекулярной массой, и

3) легкое образование связи молекул, содержащих тиольную группу или дисульфидную группу, с поверхностью соединения благородного металла, такого как золото, дает возможность введения заместителей на поверхность с высокой плотностью.

Принцип измерения уже был описан выше с использованием фиг.1 и 2, а описание, касающееся прибора, измеряющего ППР, будет конкретно дано в дальнейшем. На фиг.1, когда светом облучают пленку благородного металла со стороны призмы, так что задают общее отражение, интенсивность отраженного света будет падать при определенном угле, основанном на генерировании ППР. Поскольку данный угол резко различается на основе изменения количества соединения, т.е. изменения массы, связанного с пленкой благородного металла, то прибор, измеряющий ППР, может показать данное изменение массы в виде данных измерения (Резонансных единиц, 1 RU – 1 пг/мм²) от интенсивности отраженного света.

Затем после введения заместителей, показывающих специфическую связывающую способность по отношению к фосфорилированному пептиду, в пленку благородного металла, на пленку воздействуют исследуемым образцом для получения данных.

Затем сравнение полученных данных и данных в стационарном состоянии дает возможность понять существование или количество фосфорилированного пептида в исследуемом образце.

Второй способ по настоящему изобретению может непосредственно использовать обычные приборы для спектроскопии комбинационного рассеивания. Однако необходимо заставить соединение благородного металла (частицы благородного металла) по настоящему изобретению подвергнуться воздействию исследуемого образца. В результате не только пик фосфорилированного пептида сдвигается, но также интенсивность пика увеличивается эффектом поверхностного плазмонного резонанса, основанным на связывании соединения благородного металла, по сравнению со случаем без действия соединения благородного металла по изобретению. Таким образом, сравнение данных с данными спектра комбинационного рассеивания в случае без действия соединения благородного металла по настоящему изобретению дает возможность оценить, фосфорилирован ли пептид или нет.

Исследуемый образец, используемый во втором способе по настоящему изобретению, имеет форму водного раствора или водной дисперсии. Причиной является то, что соединение благородного металла по настоящему изобретению необходимо связать с фосфорилированным пептидом. Исследуемый образец может, например, представлять собой необработанные биологические материалы, и предпочтительно он представляет собой образец, полученный очисткой пептида, который необходимо оценить на существование фосфорилирования. Причина заключается в том, что удовлетворительный спектр не может быть получен из-за существования примесей в спектроскопии комбинационного рассеивания.

Заместитель, используемый в соединении благородного металла по настоящему изобретению, является чрезвычайно превосходным с точки зрения специфической связывающей способности по отношению к фосфорилированному пептиду и имеет следующие структуры:

где X представляет связующую группу.

Причина выбора Zn в качестве координационного металла в формуле (I) заключается в том, что он обладает чрезвычайно высокой координационной способностью по отношению к фосфатной группе (группе сложного моноэфира фосфорной кислоты) фосфорилированного белка.

В соединении благородного металла по настоящему изобретению связующая группа представляет собой группу для связывания части, представляющей собой благородный металл, и вышеуказанной основной структуры, то есть основной части, имеющей способность взаимодействия с фосфорилированным протеином, в дальнейшем называемой Phos-tag. Связующая группа обладает функциями, дающими возможность легкого получения соединения благородного металла по настоящему изобретению и увеличения степени свободы заместителя (I) для реализации легкой координации с фосфатной группой, связанной с пептидом. Вид связующей группы особым образом не ограничивается, пока она обладает вышеуказанной функцией, и она включает, например, цепь сахарозы, С₁-С₆ алкиленовую группу, аминогруппу (-NH-), группу простого эфира (-O-), тиоэфирную группу (-S-), карбонильную группу (-C(=O)-), тионильную группу (-C(=S)-), группу сложного эфира, амидогруппу, группу мочевины (-NHC(=O)NH-), группу тиомочевины (-NHC(=S)NH-), комплекс биотин-стрептавидин, комплекс биотин-авидин; цепь сахарозы, содержащую на своем конце группу, выбранную из группы, состоящей из аминогруппы, группы простого эфира, тиоэфирной группы, карбонильной группы, тионильной группы, группы сложного эфира, амидогруппы, группы мочевины, группы тиомочевины; и С₁-С₆ алкиленовую группу, содержащую на своем конце группу, выбранную из группы, состоящей из аминогруппы, группы простого эфира, тиоэфирной группы, карбонильной группы, тионильной группы, группы сложного эфира, амидогруппы, группы мочевины, группы тиомочевины, комплекса биотин-стрептавидин, комплекса биотин-авидин; С₁-С₆ алкиленовую группу, содержащую на своих обоих концах группы, идентичные друг другу или отличные друг от друга, выбранные из группы, состоящей из аминогруппы, группы простого эфира, тиоэфирной группы, карбонильной группы, тионильной группы, группы сложного эфира, амидогруппы, группы мочевины, группы тиомочевины; и группы, полученной линейным связыванием двух или более групп, выбранных из группы, состоящей из вышеуказанных групп.

Концевой группой на стороне, связанной с частью благородного металла связующей группы, предпочтительно является тиоэфирная группа. Причиной является то, что данное соединение благородного металла можно легко получить, используя тиольное соединение или дисульфидное соединение.

В настоящем изобретении цепь сахарозы” показывает обычный связанный линейный или разветвленный сахарид, и, например, в качестве примера можно привести декстран, полученный полимеризацией гликозидной связи D-глюкозы. Кроме функции вышеописанной связующей группы данная цепь сахарозы обладает высокой гидрофильностью и превосходным сродством к биологическим материалам. Кроме того, поскольку данную цепь сахарозы, имеющую разветвленную цепь, можно легко синтезировать, то можно преимущественно связать большее количество основных каркасов замещающей группы (I).

В настоящем описании С₁-С₆ алкиленовая группа” представляет линейную или разветвленную двухвалентную алифатическую углеводородную группу с числом атомов углерода от 1 до 6 и включает, например, метилен, этилен, пропилен, тетраметилен, гексаметилен, метилэтилен, метилпропилен, диметилпропилен и аналогичные. Предпочтительной является С₁-С₄ алкиленовая группа, и особенно предпочтительной является С₁-С₂ алкиленовая группа.

Длина вышеуказанной связующей группы особым образом не ограничивается, и предпочтительно она не превышает 200 нм, более предпочтительно не превышает 100 нм. Это потому, что связующая группа, имеющая меньшую длину, дает возможность более отчетливо обнаружить фосфорилированный пептид.

В пиридиновое кольцо заместителя (I) можно ввести метильную группу или аналогичную, пока полученный в результате заместитель имеет то же функциональное действие на заместитель (I). Такой эквивалент также будет включен в объем настоящего изобретения.

Кроме того, положение связующей группы в заместителе (I) по настоящему изобретению особым образом не ограничивается, и связующая группа может существовать в положении, иллюстрируемом следующим ниже заместителем (I’).

Заместитель (I’) и заместитель (I) полностью эквивалентны друг другу, и нет необходимости разъяснять, какой заместитель можно получить в реакции синтеза. Возможно, что их фактически получают в виде смеси, и естественно заместитель (I’) также будет включен в объем настоящего изобретения.

В настоящем изобретении благородные металлы” представляют собой золото, серебро, платину, родий, рутений, палладий, осмий или иридий. В настоящем изобретении предпочтительно используют любой из металлов, выбранный из группы, включающей золото, серебро, платину или родий, особенно предпочтительно используют золото. Причина заключается в том, что золото, как доказано, демонстрирует удовлетворительный эффект поверхностного плазмонного резонанса.

В первом способе форма пленки является предпочтительной формой соединения благородного металла по настоящему изобретению. Причина состоит в том, что пленочные материалы можно применить в измерительной аппаратуре поверхностного плазмона без какой-либо обработки. Толщина данной пленки благородного металла особым образом не ограничивается, и предпочтительно она составляет от 10 до 100 нм и обычно примерно 50 нм.

Во втором способе предпочтительной является форма частицы. Причина состоит в том, что поскольку настоящее изобретение заставляет соединение благородного металла связываться с фосфорилированным пептидом, включенным в исследуемый образец, растворенный или диспергированный, то соединение благородного металла необходимо диспергировать в исследуемом образце. Средний размер частицы предпочтительно находится в диапазоне от 30 до 50 нм. Диаметр частицы менее 30 нм иногда может не предоставить достаточный эффект увеличения света комбинационного рассеивания, а диаметр частицы более 50 нм делает возможным избыточное агрегирование частиц в течение измерений. Однако поскольку данный диапазон представляет средний размер частиц, то частицы вне данного диапазона могут существовать.

Способы измерения среднего размера частиц особым образом не ограничиваются. Поскольку размеры частиц, которые необходимо измерить, вероятно, находятся в диапазоне от нескольких нм до десятков нм, то распределение размера частиц можно измерить прибором, применимым для метода лазерного рассеяния, подходящим для измерения диаметра микрочастиц (фотометр для измерения рассеивания лазерного света), и можно вычислить средний диаметр частиц.

Хотя соединение благородного металла по настоящему изобретению можно легко получить способом, включающим схему 1, способ получения не ограничивается способами, иллюстрируемыми в дальнейшем.

Схема 1

где X представляет вышеуказанную связующую группу, R¹ и R² представляют реакционноспособные группы для получения -X-Phos-tag группы на поверхности пленки благородного металла.

В схеме 1 сначала получают R¹ в качестве реакционноспособной группы для образования связующей группы X, вводя замещением на благородный металл. Здесь виды связи между реакционноспособной группой R¹ и благородным металлом не является необходимым разъяснять, и типы связывания особым образом не обсуждаются. Например, известно, что тиольное соединение и дисульфидное соединение самопроизвольно адсорбируется на поверхности благородного металла, образуя мономолекулярную пленку, называемую самоорганизованным монослоем. Затем, когда существует связывание между реакционноспособной группой R¹ и благородным металлом через атом серы, типы связывания между благородным металлом и атомом серы в вышеприведенной схеме особым образом не ограничиваются, и они должны быть просто связаны определенным взаимодействием.

Когда конечное целевое соединение представляет собой пленку благородного металла, пленку благородного металла, замещенную реакционноспособной группой R¹, следует просто разрезать с получением подходящей формы для используемого прибора ППР, после того как материал благородного металла выковывают в подходящую толщину. Когда конечное целевое соединение представляет собой частицу, после получения частицы с использованием широко известных методов получения металлических частиц избыточно маленькие или избыточно большие частицы следует просто удалить, используя мембранный фильтр или аналогичное устройство, соответствующие желаемому диаметру частиц.

Из схемы 1 ясно, что, когда реакционноспособную группу R¹ заставляют связываться с поверхностью благородного металла посредством атома серы, взаимодействие между тиольным соединением (например, R¹-SH) и благородным металлом продвигается легко, и реакционные условия или аналогичное просто должны следовать традиционным методам. Например, просто контакт поверхности благородного металла с раствором тиольного соединение может начать конденсацию между ними.

Затем, чтобы связать предшественник Phos-tag посредством связующей группы X, заставляют взаимодействовать производное тетракис(пиридин-2-илметил)-1,3-диаминопропан-2-ола (соединение (VI), содержащее заместитель R². В схеме 1 типы R¹ и R², растворители, реакционные температуры, другие реагенты, методы очистки или аналогичное в процессе взаимодействия R¹ и R² в основном определяются видом X. Например, когда R¹ и R² необходимо связать амидо связью, чтобы получить X, то в качестве примера пары R¹ и R² можно привести пару из группы, содержащей аминогруппу (первичную аминогруппу), и активированной карбоксильной группы. В качестве реакционных условий в данном случае следует просто использовать обычные условия в области синтетической химии. Таким образом, на поверхности можно получить соединение благородного металла (VII), содержащее заместители.

Кроме того, соединения благородного металла, содержащие заместители (VII), также можно получить следующими способами.

где X представляет группу, содержащую атом серы со стороны благородного металла среди вышеуказанных связующих групп, и X’ представляет часть, отличную от концевого атома серы среди X (когда X просто представляет собой атом серы, X’ просто представляет собой ковалентную связь).

Поскольку взаимодействие тиольного соединения и благородного металла протекает чрезвычайно легко, как указано выше, производное тетракис(пиридин-2-илметил)-1,3-диаминопропан-2-ола, замещенное группой, содержащей тиольную группу на своем конце, дает возможность синтеза предшественника соединения благородного металла, содержащего на своей поверхности Phos-tag.

Наконец, добавление соли металла к соединению благородного металла, содержащему заместитель (VII), дает соединение благородного металла, содержащее на своей поверхности Phos-tag. Например, в данном случае можно добавить нитрат цинка (II) или ацетат цинка (II), и в случае добавления ацетата цинка (II) сразу получают следующее ниже соединение, содержащее координированную с ним уксусную кислоту.

Данное соединение более стабильно, чем заместитель (I), и его можно удобно хранить. Данное соединение является эквивалентом заместителя (I), и его можно использовать таким же образом, как заместитель (I). То есть, поскольку группа сложного моноэфира фосфорной кислоты обратимо координируется с уксусной кислотой при измерениях ППР, то можно обнаружить фосфорилированные пептиды.

Исходное соединение (соединение (VI)) в схеме 1 для присоединения Phos-tag к благородному металлу можно получить следующей ниже схемой 2.

Схема 2

где R² имеет такое же обозначение, как указано ранее. Hal представляет собой атом галогена и предпочтительно представляет собой атом брома.

Соединение (II) (1,3-диамино-2-пропанол) в качестве исходного соединения имеется в продаже. Кроме того, поскольку соединение (III) и соединение (IV) имеют сравнительно простые структуры, они имеются в продаже или их можно синтезировать обычными методами, известными специалисту в данной области.

В схеме 2 соединение (IV) сначала получают реакцией конденсации соединения (II) и (III) в присутствии катализатора. Хотя в данной реакции возможно последующее введение соединения (III), использование соединения (III) в количестве 3 эквивалентов или более дает возможность синтеза соединения (IV) в одностадийной реакции.

В схеме 2 реакцию восстановительного аминирования осуществляют в качестве реакции конденсации. В данном случае в качестве растворителя можно использовать любые растворители без особенных ограничений, пока растворитель может по существу растворять соединение (II) и (III) и не подавлять реакцию. Например, можно использовать спирты, такие как метанол, этанол и изопропанол; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, тетрагидрофуран и диоксан; воду и смеси вышеуказанных растворителей.

В реакции восстановительного аминирования после конденсации соединения (II) и (III) в присутствии концентрированной хлористоводородной кислоты в качестве катализатора восстановление осуществляют обычным восстановителем.

В качестве реакционной температуры предпочтительные условия могут просто основываться на виде сырья или аналогичном. Например, взаимодействие можно осуществлять при температуре от 20 до 80°C и в течение периода времени от 12 до 100 часов.

После завершения реакции растворитель или аналогичное выпаривают под вакуумом и затем к реакционной смеси добавляют воду. Затем, после экстракции неводным растворителем, полученную органическую фазу сушат безводным сульфатом магния или аналогичным и используемый растворитель выпаривают под вакуумом. Затем полученный остаток очищают обычными известными методами, такими как колоночная хроматография на силикагеле, получая соединение (IV).

Способ получения соединения (IV) не ограничивается способом, представленным схемой 2, и, например, соединение (IV) также можно синтезировать из соединения (II) и галогенированных соединений.

Последующее взаимодействие с соединением (V) может дать соединение (VI). В качестве данной реакции используют реакцию синтеза обычных третичных аминов. Например, можно использовать реакцию конденсации в присутствии оснований в растворителях. Кроме того, введение защитной группы и отщепление защитной группы можно соответствующе осуществить согласно виду R² в данной стадии. Или соединение (VI) можно синтезировать обменом неактивного заместителя в R² посредством конверсии функциональной группы после стадии, использующей соединение, содержащее группу неактивного заместителя вместо R² в соединении (V). Например, после стадии, использующей соединение, содержащее нитрогруппу в качестве неактивного заместителя, нитрогруппу можно конвертировать в аминогруппу в качестве реакционноспособной группы.

В качестве заместителя, который можно использовать для способа по настоящему изобретению, также вместо заместителя (I) можно использовать следующее ниже комплексное соединение (VIII).

где X имеет такое же обозначение, как указано выше. R³-R⁵ представляют электронодонорный заместитель в 4 позиции или 6 позиции пиридинового кольца.

Заместитель (VIII), используемый в способе по настоящему изобретению, имеет пиридиновый азот в электронно-обогащенном состоянии из-за электронодонорного заместителя, введенного в подходящую позицию замещения, и, следовательно, он имеет выдающееся координационное свойство по отношению к цинку, давая более легкую продуктивность и устойчивость. Данный заместитель можно использовать в качестве соответствующего заместителю (I).

Хотя настоящее изобретение в дальнейшем будет более детально описано со ссылкой к Примерам получения и Тестовым примерам, объем настоящего изобретения ими не ограничивается.

ПРИМЕРЫ

Пример получения 1

Получение Phos-tag сенсорного чипа для ППР анализа

Сенсорный чип (изготовлен BIOCRE, Sensor Chip CMS), покрытый карбоксиметилдекстраном, устанавливают в приборе для измерения ППР (изготовленном BIOCRE, BIOCORE J).

В качестве подвижного буфера используют 10 мМ водный раствор HEPES, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновую кислоту, – гидроксида натрия (рН 7,4), включающий 5х10^-3% (об./об.) Tween 20, 0,20 М нитрата натрия и 10 мкМ нитрата цинка. Температуру сенсорного чипа устанавливают при 25°C и расход подвижного буфера устанавливают при 30 мкл/мин. После проверки стабильного значения поверхностного плазмонного резонанса смесь водных растворов EDC (1-этил-3,4-диметиламинопропилкарбодиимида, 200 мМ) в качестве активатора карбоксильной группы и NHS (N-гидроксисукцинамида, 50 мМ) добавляют в течение 6 минут для активации карбоксильной группы сенсорного чипа.

Затем, чтобы нанести Phos-tag на сенсорный чип в течение 6 минут добавляют 50% (об./об.) ацетонитрильный раствор (10 мМ) N,N,N’-три(2-пиридилметил)-N’-[5-N-(2-аминоэтил)карбамоил-2-пиридилметил]-1,3-диаминопропан-2-ола. Затем для блокирования оставшихся активированных карбоксильных групп в течение 6 минут добавляют 1,0 М водный раствор моноэтаноламина.

Вышеприведенной операцией получают канал для образца, то есть проточную ячейку A, имеющую сенсорную секцию со связанным с ней Phos-tag.

Сравнительный пример получения 1

Канал для образца, то есть проточную ячейку B, имеющую эталонную секцию без связанного с ней Phos-tag, изготавливают параллельно проточной ячейке A, используя процедуру, аналогичную процедуре приведенного выше примера получения 1, включая активирование карбоксильной группы и ее блокирование, за исключением того, что Phos-tag не наносят.

Тестовый пример 1

В качестве аналитических образцов используют (i) -казеин (пентафосфорилированный белок, изготовленный SIGMA), (ii) дефосфорилированный -казеин и (iii) бычий сывороточный альбумин (BSA, изготовленный New England BioLabs). Дефосфорилированный -казеин получают, инкубируя смешанный раствор -казеина 10 мг/мл (50 мкл), кислую фосфотазу из картофеля (SIGMA) и 0,20 М MES-NaOH (рН 6,8, 50 мкл) при 38°C в течение 12 часов. Каждый образец растворяют в подвижном буфере, используемом в примере получения 1, чтобы получить раствор образца с концентрацией образца 1,5 мкМ.

Измерение ППР осуществляют для раствора образца. Более детально, проточные ячейки A и B, изготовленные в примере получения 1 и сравнительном примере получения 1 соответственно, стабилизируют подвижным буфером. Каждый раствор образца подают в ячейки при температуре 25°C и с расходом 30 мкл/мин и ассоциацию осуществляют в течение 15 минут. Затем подают только подвижный буфер в течение 15 минут для диссоциации. После измерения для каждого раствора образца пропускают водный раствор 25 мМ однозамещенного фосфата калия – 25 мМ двузамещенного фосфата натрия (рН 6,86) в течение 6 минут, 0,20 М водный раствор двузамещенного этилендиаминтетраацетата натрия (рН 7,4) в течение 6 минут и подвижный буфер в течение 5 минут, чтобы реактивировать сенсорный чип, то есть удалить остаточное связанное вещество.

Фиг.3-5 показывают каждый из результатов ППР теста соответствующего образца (i)-(iii), и фиг.6 показывает разницу, полученную вычитанием значения RU проточной ячейки B из значения RU проточной ячейки A в результатах теста каждого образца. Согласно результатам фиг.4-6 изменение проточных ячеек A и B является почти одинаковым, показывая, что дефосфорилированный -казеин и BSA не дают специфического связывания. С другой стороны, результаты фиг.3 и 6 делают понятным, что фосфорилированный -казеин дает специфическое связывание с сенсорной частью, содержащей связанный с ней Phos-tag (количество максимального связывания = 3150 RU). Следовательно, доказано, что способом по настоящему изобретению можно определить только фосфорилированный пептид.

Тестовый пример 2

В качестве аналитического образца используют (iv) фосфорилированный SRC пептид (монофосфорилированный пептид, изготовленный ANA SPEC Inc.) и (v) SRC пептид (нефосфорилированный пептид, изготовленный ANA SPEC Inc.). Каждый образец растворяют в подвижном буфере, используемом в примере получения 1, чтобы получить растворы образца с концентрациями образца от 1 до 15 мкМ.

Измерения ППР для растворов образцов осуществляют, используя проточные ячейки A и B, изготовленные в примере получения 1 и сравнительном примере получения 1. Более детально, измерения ППР осуществляют при тех же условиях, как в тестовом примере 1, за исключением того, что ассоциацию и диссоциацию образцов осуществляют в течение 5 минут соответственно, и реактивацию сенсорного чипа (удаление остаточного связанного вещества) осуществляют 0,40 М фосфатным буфером (рН 7,0) в течение 5 минут, 0,20 М водным раствором двузамещенного этилендиаминтетраацетата натрия (рН 7,4) в течение 5 минут и подвижным буфером из примера получения 1 в течение 5 минут в тестовом примере 1. Фиг.7 показывает результаты.

Результаты показывают, что нефосфорилированный пептид почти не показывает изменение даже при концентрации 15 мкМ. С другой стороны, данные результаты показывают, что фосфорилированный пептид дает возможность четко распознать свое существование не только при концентрации 15 мкМ, но также при концентрациях 1 мкМ и 5 мкМ. Следовательно, четко доказано, что настоящим изобретением можно четко определить существование связывания фосфорной кислоты в пептидах, имеющих идентичную последовательность аминокислот.

Пример получения 2

Получение сенсорного чипа Phos-tag для ППР анализа

Стрептавидинсодержащий сенсорный чип, имеющий связанный на своей поверхности стрептавидин (изготовленный BIOCRE, Sensor Chip SA), устанавливают в прибор для измерения ППР (изготовленный BIOCRE, BIOCORE J).

В качестве подвижного буфера используют 10 мМ водный раствор HEPES, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоната, – гидроксида натрия (рН 7,4), включающий 5×10^-3% (об./об.) Tween 20, 0,20 М нитрата натрия и 10 мкМ нитрата цинка. Температуру сенсорного чипа устанавливают при 25°C и подвижный буфер пропускают с расходом 30 мкл/мин, пока значение поверхностного плазмонного резонанса не покажет стабильное состояние.

Затем, чтобы заставить Phos-tag закрепиться к сенсорному чипу, пропускают раствор подвижного буфера, содержащий 1,0 мМ N,N,N’-три(2-пиридилметил)-N’-[5-N-2-(6-D-биотинамидогексакарбоксиамидэтил)карбамоил-2-пиридилметил]-1,3-диаминопропан-2-ола, имеющего структуру биотина на своем конце, причем соединение имеет следующую ниже структуру. Используемые условия представляют собой: температура 25°C, расход 30 мкл/мин и период времени для ассоциации 6 минут.

Поскольку вышеуказанное соединение координируется с ионом цинка в подвижном буфере с образованием Phos-tag, и биотин на конце показывает чрезвычайно высокое сродство к стрептавидину, Phos-tag будет нанесен на сенсорный чип.

Сравнительный пример получения 2

Сенсорный чип, не содержащий связанный с ним Phos-tag, получают, используя такую же процедуру, как в примере получения 2, за исключением того, что Phos-tag не наносят.

Тестовый пример 3

В качестве аналитического образца используют -казеин (пентафосфорилированный белок, SIGMA), растворенный в подвижном буфере, представляющем собой 10 мМ водный раствор HEPES – гидроксид натрия (рН 7,4), включающий 5×10^-3% (об./об.) Tween 20, 0,20 М нитрата натрия и 10 мкМ нитрата цинка. Концентрацию образца устанавливают равной 1,5 мкМ.

ППР измерения для анализа образца осуществляют при следующих условиях: температура 25°C, расход 30 мкл/мин, период времени для ассоциации 15 минут и период для диссоциации 10 минут. После измерения пропускают 0,40 М водный раствор фосфората в течение 6 минут, 0,20 М раствор двузамещенного этилендиаминтетраацетата натрия (рН 8,0) в течение 6 минут и подвижный буфер в течение 5 минут для реактивации сенсорного чипа, то есть удаления остаточного связанного вещества.

Фиг.8 показывает результаты теста. Данные результаты показывают, что значение RU увеличивается на 2056 благодаря потоку анализируемого образца, давая возможность идентификации связывания фосфорилированного белка к пленке благородного металла по настоящему изобретению, то есть сенсорному чипу на основе благородного металла, содержащего связанный с ним Phos-tag. Кроме того, эксперимент, проводимый при идентичных условиях, как описано выше, с использованием бычьего сывороточного альбумина вместо фосфорилированного белка, потерпел неудачу, не давая изменение значения RU. Следовательно, четко показано, что пленка благородного металла по настоящему изобретению дает возможность определить только белок, содержащий связанную с ним фосфорную кислоту.

Кроме того, эксперимент, осуществленный при идентичных условиях с использованием сенсорного чипа, изготовленного сравнительным примером получения 2, не дает никакого изменения значения RU.

ПРИМЕНИМОСТЬ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Способ измерения поверхностного плазмонного резонанса (ППР) по настоящему изобретению позволяет определить существование фосфорилированного пептида (белка) даже в исследуемом образце, таком как биологические материалы, включающем разнообразные соединения. Кроме того, способ также будет определять количество и концентрацию фосфорилированного пептида. Более того, способ также может определить, является ли пептид фосфорилированным или нет. Поэтому использование способа по настоящему изобретению для биологических материалов или аналогичного является очень полезным с точки зрения возможности применения для диагностирования заболеваний.

Более того, поскольку соединение благородного металла по настоящему изобретению показывает превосходные координационные связывающие свойства по отношению к фосфорилированным пептидам по сравнению с обычными благородными металлами, соединение благородного металла применимо в качестве вещества, используемого в вышеописанных способах. Применимым также является промежуточное соединение.

Формула изобретения

1. Способ измерения поверхностного плазмонного резонанса, включающий
помещение соединения благородного металла на нижнюю грань призмы, облучение призмы светом для обнаружения отраженного света, где соединение благородного металла содержит заместители следующей ниже формулы (I) на стороне, противоположной стороне, контактирующей с призмой, исследуемый образец добавляют к стороне, имеющей заместители (I) в соединении благородного металла

где Х представляет связующую группу, и
измерение интенсивности отраженного света с возможностью определения фосфорилированного пептида.

2. Способ измерения поверхностного плазмонного резонанса, включающий
добавление соединения благородного металла, содержащего заместители формулы (I) на своей поверхности, к исследуемому образцу,

где X представляет связующую группу,
использование спектроскопии комбинационного рассеяния и
измерение интенсивности пика фосфорилированного пептида с возможностью оценки фосфорилирован пептид или нет.

3. Соединение благородного металла, содержащее заместители следующей ниже формулы (I) на своей поверхности

где Х представляет связующую группу, обеспечивающую соединение заместителей с поверхностью благородного металла.

4. Соединение благородного металла по п.3, где соединение благородного металла имеет форму пленки.

5. Соединение благородного металла по п.3, где соединение благородного металла имеет форму частиц.

6. Промежуточное соединение для получения соединения формулы (I) по п.3, содержащее заместители следующей ниже формулы (VII) на поверхности благородного металла

где X представляет связующую группу, обеспечивающую соединение заместителей с поверхностью благородного металла.

7. Промежуточное соединение по п.6, где соединение благородного металла имеет форму пленки.

8. Промежуточное соединение по п.6, где соединение благородного металла имеет форму частиц.

РИСУНКИ