Патент на изобретение №2355766
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАКТАТСОДЕРЖАЩИХ РАСТВОРОВ
(57) Реферат:
Способ получения лактатсодержащих растворов включает культивирование в среде с глюкозосодержащим субстратом клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae, причем клетки иммобилизованны в криогеле поливинилового спирта. Осуществляют сорбцию лактат-ионов через сильноосновный гелевый анионит, элюирование сорбированных лактат-ионов с анионита. Полученный элюат обесцвечивают пропусканием при комнатной температуре через слой активированного угля. Последующее концентрирование осуществляют вакуумным выпариванием при температуре 30-40°С. Для получения раствора молочной кислоты анионит применяют в Cl–-форме, а элюирование проводят раствором соляной кислоты с концентрацией 0,15-0,5 М. Для получения раствора соли молочной кислоты анионит применяют в OH–-форме, а элюирование проводят 0,5-1,0 М раствором щелочи NaOH или КОН, или раствором соли KCl или NaCI, при градиенте концентраций от 0 до 3 М или при постоянной концентрации, выбранной из этого диапазона, или эквимолярной смесью растворов указанных щелочей и солей. Способ позволяет получить целевой продукт с концентрацией 940 г/л, с чистотой 98,2%. 2 з.п. ф-лы.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения высококонцентрированных очищенных лактатсодержащих растворов, в частности высококонцентрированных очищенных растворов молочной кислоты и ее солей, на основе культуральной жидкости, полученной в результате культивирования клеток микроорганизмов. L(+)-молочная кислота и ее соли находят широкое применение в пищевой и химической промышленности, в фармакологии, косметологии, ветеринарии, в текстильной и кожевенной промышленности, в сельском хозяйстве. Изомеры молочной кислоты используются в качестве мономеров для синтеза биоразлагаемых полимеров.
Биотехнологическим путем лактатсодержащие продукты получают из глюкозосодержащих гидролизатов различных видов возобновляемого сырья (сахаро-, целлюлозо- и крахмалосодержащих отходов сельского хозяйства и пищевой промышленности) с применением клеток микроорганизмов Lactobacillus casei, L. delbruckii, Rhizopus arrhizus, R. oryzae и др. Несмотря на большое количество источников, в которых описаны различные подходы к концентрированию и очистке лактатсодержащих продуктов, полученных биотехнологическим путем, поиск эффективных, экономичных, пригодных для промышленного использования способов очистки и концентрирования молочной кислоты и ее солей, полученных культивированием микроорганизмов, остается актуальным. Экономическая привлекательность биотехнологического получения молочной кислоты и ее солей определяется эффективностью каждой последовательной стадии процесса, включающего: конверсию глюкозы в конечный продукт, выделение лактат-ионов из содержащей клеточные метаболиты культуральной жидкости, концентрирование целевого продукта. Ряд способов получения высококонцентрированных растворов молочной кислоты из культуральной жидкости сочетают применение ионнообменной хроматографии с другими методами очистки и концентрирования. Например, известен способ получения высококонцентрированных растворов молочной кислоты из культуральной жидкости, включающий следующие этапы: предварительное концентрирование упариванием, двухступенчатый электродиализ, двухступенчатая ионно-обменная очистка, включающая пропускание лактатсодержащего раствора через сильный катионит в Н+-форме для удаления катионов металлов, а затем через слабый анионит для удаления сульфатов [ЕР 0393818 А1, опубл. 24.10.1990]. Способ, хотя и приводит к получению растворов молочной кислоты высокой степени чистоты (99,9%), но не может считаться технологически приемлемым с учетом многостадийности и высокой себестоимости конечного продукта. Основными критериями для сравнительной оценки различных процессов получения высококонцентрированных лактатсодержащих растворов с использованием ионообменной хроматографии являются: режим выделения и очистки растворов (скорости нанесения и элюирования, растворов, содержащих лактат-ионы, температура), выход целевого продукта, режим процесса концентрирования, а также конечная концентрация целевого продукта. Известен способ получения высококонцентрированных растворов молочной кислоты из культуральной жидкости, полученной при конверсии сахаросодержащих отходов сельского хозяйства (меласса, багасса) под действием свободных клеток бактерий Lactobacillus delbreuckii [US Pat. Appl. 20060036062, опубл. 16.02.2006]. Изначально в питательную среду вводят карбонат кальция, который, взаимодействуя с молочной кислотой, накапливающейся в ходе культивирования клеток до концентрации 50-66 г/л, образует лактат кальция, который впоследствии разрушают концентрированной серной кислотой. Раствор молочной кислоты с концентрацией 16 г/л, полученный при разложении лактата кальция, пропускают со скоростью 3-5 объемов носителя/ч через катионит. Выход молочной кислоты составляет 88%. Далее проводят вакуумное выпаривание полученного раствора молочной кислоты при 80-84°С до конечной концентрации молочной кислоты 580 г/л. В материалах, раскрывающих этот способ, авторы не указывают используемые катионит и элюент, а также степень чистоты конечного продукта. Поскольку в качестве носителя используют катионит, в растворе, очевидно, остаются посторонние анионы органических кислот, загрязняющие конечный продукт. Высокая температура вакуумного выпаривания на стадии концентрирования неизбежно приводит к частичной полимеризации молочной кислоты. Известен принятый за прототип заявляемого технического решения способ получения высококонцентрированного раствора соли молочной кислоты на основе культуральной жидкости, образующейся при культивировании бактерий Lactobacillus casei и содержащей 80-100 г/л молочной кислоты [US Patent 5210294, опубл. 11.05.1993]. Для выделения лактат-ионов из культуральной жидкости используют анионит Amberlite IRA-420. Скорость протока исходного раствора через колонку составляет 1-5 объемов носителя/ч. Элюируют лактат-ионы с хроматографического носителя 3-10%-ным раствором карбоната аммония, получая в результате смесь лактата аммония и карбоната аммония. Последний разрушают нагреванием до температуры 90°С. Выход лактат-ионов после хроматографической стадии составляет 70%, а степень чистоты конечного продукта – 90%. Далее проводят выпаривание полученного раствора до концентрации 900 г/л. К недостаткам этого способа можно отнести: – высокие энергетические затраты на стадии разрушения карбоната аммония, – относительно низкий выход конечного продукта при пропускании растворов с лактат-ионами через хроматографический носитель, – высокую стоимость применяемых ионно-обменных смол. Важно подчеркнуть, что применение свободных бактериальных клеток в качестве продуцента лактат-ионов приводит к получению сложных по составу культуральных жидкостей, требующих дополнительных стадий для их очистки, усложняющих и удорожающих этап выделения целевого продукта. Задачей предлагаемого изобретения является разработка экономичного, удобного для промышленного применения биотехнологического способа получения высококонцентрированных очищенных лактатсодержащих растворов – растворов молочной кислоты и ее солей. Поставленная задача решается тем, что предлагаемый способ получения высококонцентрированных очищенных лактатсодержащих растворов включает получение лактатсодержащей культуральной жидкости путем культивирования в среде с глюкозосодержащим субстратом клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, сорбцию лактат-ионов на сильноосновном гелевом анионите, элюирование лактат-ионов с анионита, обесцвечивание элюата пропусканием через активированный уголь при комнатной температуре с последующим его концентрированием вакуумным выпариванием при температуре 30-40°С. Для продуцирования лактат-ионов заявляемый способ предусматривает, в отличие от прототипа, использование клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта (ПВС), при их культивировании в питательных средах с глюкозосодержащим субстратом, содержащих в качестве основного источника углерода глюкозу или клейстеризованный крахмал или его кислотные гидролизаты [Патент РФ 2253677, приоритет от 02.10.2002]. Получение иммобилизованных клеток в соответствии с указанным патентом предусматривает диспергирование в водном растворе ПВС биомассы клеток, обладающих лактатдегидрогеназной активностью, последующую криогенную обработку полученной смеси и инкубирование полученных образцов криогелей, содержащих включенные в полимерную матрицу клетки, в питательной среде с целью повышения активности иммобилизованной биомассы.
Стадия ферментации, в соответствии с заявляемым способом, характеризуется следующими преимуществами: – возможность получения оптически чистой молочной кислоты и ее солей (до 99% L(+)-формы); – возможность использования в качестве основных источников углерода при продуцировании лактат-ионов широкого спектра глюкозосодержащих субстратов, в том числе крахмала и гидролизатов крахмалосодержащего сырья; – низкая концентрация побочных продуктов (0,5-1,5%); – сохранение метаболической активности биомассы при высоких концентрациях молочной кислоты в культуральной среде; – возможность использования питательных сред без дополнительного внесения дорогостоящих органических источников азота и витаминов; – простота отделения биомассы от конечного продукта; – возможность многоразового использования одной и той же биомассы в иммобилизованном виде, что упрощает задачу ее утилизации и улучшает экологические показатели процесса. Существенным отличием заявляемого способа от прототипа является последовательное применение для выделения и очистки целевого продукта от других метаболитов, содержащихся в полученной описанным способом культуральной жидкости, сильноосновного гелевого анионита и активированного угля, используемых в настоящее время в системах очистки сточных вод, и ранее никем не применявшихся в таком сочетании для очистки и обесцвечивания растворов молочной кислоты и ее солей. Сильноосновные гелевые аниониты, например АВ-17-8-чс, АВ-17-8, АВ-16ГС и др., обладают макропористой структурой, обеспечивающей более высокие скорости протока обрабатываемых жидкостей в сравнении с известными аналогами и позволяющими осуществлять выделение лактат-ионов непосредственно из культуральной жидкости, полученной при культивировании мицелиальных грибов. Аниониты представляют собой гелевые смолы, состоящие из гомогенных полимерных гелевых частиц, которые получают при использовании химической продукции крупнотоннажного производства (стирола, дивинилбензола, полиаминов), что обуславливает их дешевизну (носители, как минимум, в 35 раз дешевле известных аналогов). Сильноосновные гелевые аниониты полимеризационного типа характеризуются высокой осмотической стабильностью, высокой химической стойкостью к воздействию щелочей и кислот, а также нерастворимы в воде и органических растворителях. В заявляемом техническом решении для получения растворов молочной кислоты сильноосновный гелевый анионит используют в Cl–-форме, а элюирование лактат-ионов с анионита осуществляют растворами кислоты, например 0,15-0,5 М HCl. Для получения растворов солей молочной кислоты сильноосновный гелевый анионит используют в OH–-форме, а элюирование лактат-ионов с анионита осуществляют растворами щелочей, например 0,5-1,0 М NaOH или КОН, или растворами солей, например KCl, NaCl, используя градиент концентраций в интервале от 0 до 3 М или постоянную концентрацию, выбранную из этого диапазона, или эквимолярной смесью растворов щелочи и соли, например NaOH и NaCl. Используемые интервалы концентраций являются оптимальными с точки зрения полноты элюирования лактат-ионов со смолы и минимизации возможности протекания побочных процессов (например, полимеризации молочной кислоты). Скорость элюирования сорбированных лактат-ионов с носителя – до 10 об. носителя/ч. Пропускание лактатсодержащей культуральной жидкости через анионит и элюирование осуществляют в диапазоне температур, который, как правило, составляет 18-28°С, при этом верхний предел температурного диапазона обусловлен температурой культуральной жидкости, поступающей на колонку с анионитом непосредственно после окончания культивирования, а нижний предел обусловлен охлаждением системы по мере проведения процесса до температуры окружающей среды. Обесцвечивание лактатсодержащих растворов, полученных элюированием с анионита, осуществляют их пропусканием при комнатной температуре через колонку с активированным углем. Скорость пропускания раствора через колонку с углем – до 24 объемов носителя/ч. На этой стадии получают очищенные бесцветные растворы молочной кислоты и ее солей, которые пригодны для применения не только в пищевой промышленности, где допустимо применение растворов, имеющих окраску от желтого до коричневого оттенков, но и в других областях, например в фармацевтике, косметологии, в синтезе биополимеров для шовных материалов и имплантатов. Таким образом, применение стадии обесцвечивания пропусканием через колонку с активированным углем позволяет существенно улучшить качество и расширить сферы применения конечного продукта. Для обесцвечивания может быть использован активированный уголь различных типов (гранулированный, таблетированный, мелкодисперсный и др.), а проведение самой процедуры не требует особых условий и осуществляется при комнатной температуре с использованием стандартных колонок, заполненных активированным углем. Концентрирование очищенного лактатсодержащего раствора вакуумным выпариванием проводят с использованием стандартного выкуумного испарителя, позволяющего вести процесс при температуре 30-40°С. Повышение температуры выше 40°С приводит к частичной, но необратимой полимеризации продукта, существенно ухудшающей его качество. Использование температуры ниже 30°С нецелесообразно, так как требует использования более дорогостоящего оборудования, в частности вакуумного насоса большого разрежения. Такое сочетание признаков как использование клеток мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель ПВС, для получения содержащей лактат-ионы культуральной жидкости, использование сильноосновного гелевого анионита для хроматографического выделения лактат-ионов из культуральной жидкости, элюирование лактат-ионов с анионита без дополнительного нагревания раствором кислоты в указанном диапазоне концентраций для получения молочной кислоты или раствором щелочи или соли, или смесью растворов щелочи и соли в указанных концентрациях для получения лактатов, применение активированного угля для обесцвечивания лактатсодержащих растворов, полученных после элюирования, концентрирование полученных лактатсодержащих растворов вакуумным выпариванием при температуре, не превышающей 40°С, заявлено впервые. Совокупность описанных последовательных стадий, применяемых для реализации предлагаемого способа, обеспечивает решение поставленной задачи – получение высококонцентрированных очищенных лактатсодержащих растворов – растворов молочной кислоты и ее солей. Ниже приведены конкретные примеры реализации заявляемого технического решения. Во всех примерах культуральные жидкости получены в соответствии с известным способом [Патент РФ Пример 1. Получение раствора молочной кислоты с концентрацией 900 г/л Культуральную жидкость, содержащую лактат-ионы в концентрации 20 г/л, полученную при культивировании иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. oryzae F-814 (NRRL 395) на среде с клейстеризованным крахмалом, наносят на анионит АВ-17-8-чс в Cl–-форме со скоростью 5 об. носителя/ч и элюируют при комнатной температуре раствором 0,5 М HCl со скоростью 5 об. носителя/ч. Выход целевого продукта на стадии очистки при помощи анионообменной хроматографии 98%. Далее полученный элюат пропускают через слой гранулированного активированного угля со скоростью 24 об. колонки/ч и концентрируют методом вакуумного выпаривания при 35°С до концентрации 900 г/л водного раствора молочной кислоты. Чистота целевого продукта 97,8%. Пример 2. Получение раствора молочной кислоты с концентрацией 910 г/л Культуральную жидкость, содержащую лактат-ионы в концентрации 135 г/л, получаемую при культивировании иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. oryzae F-841 (АТСС 34612) на среде с глюкозой, наносят на анионит АВ-17-8 в Cl– форме со скоростью 3 об. носителя/ч и элюируют при комнатной температуре раствором 0,15 М НС1 со скоростью 1 об. носителя/ч. Выход целевого продукта на стадии очистки при помощи анионообменной хроматографии 99%. Далее полученный элюат пропускают через слой гранулированного активированного угля со скоростью 10 об. колонки/ч и концентрируют методом вакуумного выпаривания при 33°С до концентрации 910 г/л водного раствора молочной кислоты. Чистота целевого продукта 97,3%. Пример 3. Получение раствора лактата натрия с концентрацией 940 г/л Культуральную жидкость, содержащую лактат-ионы в концентрации 180 г/л, полученную при культивировании иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. oryzae F-223 (АС-3) на среде с глюкозой, наносят на анионит АВ-17-8-чс в ОН– форме со скоростью 10 об. колонки/ч и элюируют при комнатной температуре в градиенте концентраций раствора NaCl от 0 до 3 М со скоростью 10 об. носителя/ч. Выход целевого продукта на стадии очистки при помощи анионообменной хроматографии составляет 99%. Далее полученный элюат пропускают через слой таблетированного активированного угля со скоростью 6 об. носителя/ч и концентрируют методом вакуумного выпаривания при 30°С до получения водного раствора лактата натрия концентрацией 940 г/л. Чистота целевого продукта 98,2%. Пример 4. Получение раствора лактата натрия с концентрацией 800 г/л Культуральную жидкость, содержащую лактат-ионы в концентрации 30 г/л, полученную при культивировании иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба R. oryzae F-814 (NRRL 395) на среде с клейстеризованным крахмалом, наносят на анионит АВ-16ГС в ОН– форме со скоростью 1 об. носителя/ч и элюируют при комнатной температуре раствором 1 М NaOH со скоростью 1 об. носителя/ч. Выход целевого продукта на стадии очистки при помощи анионообменной хроматографии 100%. Далее полученный элюат пропускают через слой гранулированного активированного угля со скоростью 10 об. носителя/ч и концентрируют методом вакуумного выпаривания при 40°С до концентрации 800 г/л водного раствора лактата натрия. Чистота целевого продукта 96,7%. Пример 5. Получение раствора лактата натрия с концентрацией 880 г/л Культуральную жидкость, содержащую лактат-ионы в концентрации 55 г/л, получаемую при культивировании иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. oryzae F-555 на среде с кислотным гидролизатом крахмала, наносят на анионит АВ-17-8-чс в OH–-форме со скоростью 0,5 об. носителя/ч и элюируют при комнатной температуре смесью растворов 0,5 М NaCl и 0,5 М NaOH со скоростью 0,5 об. носителя/ч. Выход целевого продукта на стадии очистки при помощи анионообменной хроматографии 99%. Далее полученный элюат пропускают через слой порошкообразного активированного угля со скоростью 20 об. колонки/ч и концентрируют методом вакуумного выпаривания при 37°С до концентрации 880 г/л водного раствора лактата натрия. Чистота целевого продукта 97,8%. Пример 6. Получение раствора лактата калия с концентрацией 860 г/л Культуральную жидкость, содержащую лактат-ионы в концентрации 100 г/л, получаемую при культивировании на среде с глюкозой иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. Oryzae F-841 (АТСС 34612), наносят на анионит АВ-17-8-чс в OH–-форме со скоростью 3 об. носителя/ч и элюируют при комнатной температуре раствором 2 М KCl со скоростью 3 об. колонки/ч. Выход целевого продукта на стадии очистки при помощи анионообменной хроматографии 96%. Далее полученный элюат пропускают через слой гранулированного активированного угля со скоростью 10 об. носителя/ч и концентрируют методом вакуумного выпаривания при 32°С до концентрации 860 г/л водного раствора. Чистота целевого продукта 96,9%. Эффективность и промышленная применимость заявляемого способа обусловлена следующими преимуществами по сравнению с известными аналогами и прототипом. 1. Для реализации способа может быть использован широкий спектр глюкозосодержащих субстратов, в том числе крахмал и гидролизаты крахмалосодержащего сырья. 2. Использование клеток мицеллиального гриба R. oryzae, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, позволяет отказаться от введения в культуральную среду дополнительных ингредиентов – витаминов и органических источников азота, необходимых для культивирования бактерий. 3. Использование клеток мицеллиального гриба R. oryzae, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, обеспечивает меньшее содержание примесей в получаемой культуральной жидкости и позволяет сократить количество стадий, исключив стадию ультрафильтрации перед стадией очистки на ионнообменом носителе. 4. Удешевление способа достигают также за счет применения дешевых носителей (например, сильноосновный гелевый анионит АВ-17-8-чс или АВ-17-8 или АВ-16ГС и активированный уголь) и снижения энергозатрат за счет проведения стадий очистки и обесцвечивания без дополнительного нагрева, а стадии вакуумного концентрирования при температуре, не превышающей 40°С. 5. Способ позволяет повысить выход конечных продуктов по сравнению с прототипом на 25% при значительном сокращении времени на его реализацию, при этом способ обеспечивает получение целевых продуктов с чистотой, превышающей 96%. Таким образом, заявляемый способ включает легко реализуемые в промышленных масштабах операции, предполагает использование недорогих, доступных отечественных материалов, не требует больших энергетических затрат, а заявленная последовательность операций позволяет получить высококонцентрированные очищенные растворы молочной кислоты и ее солей.
Формула изобретения
1. Способ получения лактатсодержащих растворов, включающий получение лактатсодержащей культуральной жидкости путем культивирования в среде с глюкозосодержащим субстратом клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, сорбцию лактат-ионов на сильноосновном гелевом анионите, элюирование лактат-ионов с анионита, обесцвечивание элюата пропусканием через активированный уголь при комнатной температуре с последующим его концентрированием вакуумным выпариванием при температуре 30-40°С. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения раствора молочной кислоты применяют сильноосновный гелевый анионит в Cl–-форме, а элюирование проводят раствором соляной кислоты с концентрацией 0,15-0,5 М. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения раствора соли молочной кислоты применяют сильноосновный гелевый анионит в ОН–-форме, а элюирование проводят 0,5-1,0 М раствором щелочи NaOH или KOH, или раствором соли KCl или NaCl при градиенте концентраций от 0 до 3 М или при постоянной концентрации, выбранной из этого диапазона, или эквимолярной смесью растворов указанных щелочей и солей.
|
||||||||||||||||||||||||||
2-4. P.87-100].