Патент на изобретение №2355423
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) АДЪЮВАНТ
(57) Реферат:
Изобретение относится к вирусологии. Предложено применение экстракта бересты в качестве адъюванта. Экстракт бересты повышает иммуногенность целевого антигена при совместном введении. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и медицине. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.
Настоящее изобретение относится к области медицины и ветеринарии, более конкретно к вирусологии. Угроза вирусных эпидемий продолжает волновать человечество. При выработке стратегии борьбы с вирусными возбудителями вирусологи единодушны во мнении, что главенствующее место должны занять вакцины, как наиболее эффективные медицинские средства профилактики и снижения смертности населения. Поэтому последние несколько лет во всем мире ведутся интенсивные разработки вакцинных препаратов, поскольку вакцины (живые и инактивированные) показали себя как безвредные, безопасные для окружающих иммуногенные препараты, хотя, в ряде случаев, их эффективность оставляет желать лучшего. Применительно к инактивированным вакцинам наибольшую эффективность можно прогнозировать в случае использования в качестве основы вирулентного вирусного штамма, но при этом резко возрастает сложность производства, обусловленная, опасностью работы и необходимостью строгого контроля за полнотой инактивации возбудителя. Отличительной особенностью инактивированных вакцин является включение в их состав адъювантов. Адъювант – это субстанция, добавляемая в вакцинный препарат для увеличения выработки организмом антител. Наиболее часто в этих целях используют гидроокись алюминия. Последние исследования показали, что помимо увеличения времени нахождения антигена в месте введения и его адсорбции, она повышает экспрессию HLA-антигенов II класса, молекул В 7-2 (CD 86 и CD 83), экспрессию костимулирующих молекул, молекул адгезии и продукцию интерлейкина – 4, что сопровождается изменением морфологии в сторону дендритных клеток. В результате исследований последних лет разработаны и другие, более активные адъюванты. В экспериментах на животных показана эффективность использования при иммунизации GpG-олигодезоксинуклеотидов, выделенных из бактериальных ДНК и синтетически созданных. Эффективность мукозальной риппозной вакцинации повышается при использовании токсинов холерного вибриона и энтеротоксинов кишечной палочки, кораубазидана (полисахарида, продуцируемого внеклеточно апатогенным грибом), хитозана (полисахарида, полученного из оболочки ракообразных), бакуловируса и синтетического агониста TLR4, синтетической двуцепочечной РНК-поли (1:С). Профилактическая активность инактивированных вакцин с новым адъювантом MF 59 при иммунизации пожилых людей, особенно с хроническими заболеваниями, оказалась выше, чем обычных сорбированных препаратов. Применяемые в медицинской практике адъюванты, в частности адъювант Фрейнда, дороги, содержат остатки клеточных структур, способных вызвать выработку посторонних антител. Их высокая вязкость затрудняет работу на мелких животных. Задачей настоящего изобретения является поиск нового адъюванта, лишенного в значительной степени указанных недостатков. Проведенные авторами настоящего изобретения исследования привели к обнаружению возможности использования в качестве такого адъюванта экстракта бересты (белой части березовой коры) с преобладающим содержанием бетулина. Предпочтительным является использование указанного препарата в виде наночастиц. Объектом исследования являлись экспериментальные образцы инактивированных вирусных антигенов в комплексе с адъювантом на основе наночастиц «Бересты экстракта сухого» с преобладающим содержанием (65%) бетулина (далее по тексту бетулин). Указанный экстракт производится заявителем настоящей заявки – ООО «Березовый мир» и используется в качестве БАД. Осуществлялось сравнительное изучение иммуногенных свойств рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В и инактивированного антигена клещевого энцефалита (КЭ) в комплексе с адъювантами на основе наночастиц бетулина. Для иммунизации животных использовали следующие препараты: – Рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (полуфабрикат вакцины), концентрация HBsAg – 50 мкг/мл; – Инактивированный антиген вируса клещевого энцефалита (цельновирионный полуфабрикат вакцины), концентрация белка Е-10 мкг/мл; – Адъювант 1 (АД-1): экстракт бересты сухой с содержанием бетулина 65%, (БЭС-65); – Адъювант 2 (АД-2): высушенный препарат наночастиц БЭС, (РЯ); – Адъювант 3 (АД-3): 0,5% водный раствор наночастиц бетулина (ГИПХ). – Известный адъювант (гидроксид алюминия, ГАл): 0,5% водный раствор. Адъюванты АД-2 и АД-3 готовились следующим образом. Адъювант АД-3 (0,5% водный раствор наночастиц): – растворение бересты экстракта сухого (БЭС-65) в органическом растворителе при концентрации 2,5-5 г/л; – добавление (впрыскивание) к указанному раствору большого количества воды (до 25 объемов воды по отношению к объему раствора); – удаление растворителя и основной части воды. Адъювант АД-2 (высушенный препарат наночастип): – к полученному водному раствору наночастип (см. получение АД-3) добавляют криопротектор (например, сорбит) и лиофилизируют. Перед иммунизацией адъюванты АД-1 и АД-2 растворяли в фосфатном буфере (рН 7,5), обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут, после чего охлаждали. В опытах изучали препараты следующего состава: На основе рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В Препарат 1, состав: HBsAg – 10 мкг/мл, ГАл – 500 мкг/мл Препарат 2, состав: HBsAg – 10 мкг/мл, АД-1 – 500 мкг/мл Препарат 3, состав: HBsAg – 10 мкг/мл, АД-2 – 500 мкг/мл Препарат 4, состав: HBsAg – 10 мкг/мл, АД-3 – 500 мкг/мл Препарат 5, состав: HBsAg – 10 мкг/мл, АД-1 – 100 мкг/мл Препарат 6, состав: HBsAg – 10 мкг/мл, АД-2 – 100 мкг/мл Препарат 7, состав: HBsAg – 10 мкг/мл, АД-3 – 100 мкг/мл На основе инактивированного антигена клещевого энцефалита (ВКЭ) Препарат 8, состав: ВКЭ белок Е -1 мкг/мл, ГАл – 500 мкг/мл Препарат 9, состав: ВКЭ белок Е – 1 мкг/мл, АД-1 – 500 мкг/мл Препарат 10, состав: ВКЭ белок Е – 1 мкг/мл, АД-3 – 500 мкг/мл Препарат 11, состав: ВКЭ белок Е – 1 мкг/мл, АД-1 – 100 мкг/мл Препарат 12, состав: ВКЭ белок Е – 1 мкг/мл, АД-3 – 100 мкг/мл В качестве референс препаратов использовали: Реф. 1: HBsAg – 10 мкг/мл Реф. 2: ВКЭ белок Е – 1 мкг/мл Реф. 3: АД-1 – 500 мкг/мл Реф. 4: Физраствор Титры специфических антител в сыворотках крови иммунизированных мышей определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) и торможения гемагглютинации (РТГА). Для количественного определения вируса КЭ применяли экспериментальную тест-систему с использованием моноклональных антител к поверхностному гликопротеину Е. Протективную активность препаратов с вирусом КЭ определяли введением внутрибрюшинно 300-400 летальных доз референс-штамма «Абсеттаров» через неделю после последней иммунизации. В течение 14 дней после заражения вели учет на специфичность умерших животных. Пример 1 Иммуногенные и протективные активности различных вирусных препаратов оценивали при подкожной иммунизации беспородных белых мышей массой 14-16 г. Препараты вводили однократно и двукратно с интервалом 14 дней. В качестве контроля белым мышам подкожно однократно и двукратно вводили референс препараты. Через 21 день после окончания цикла иммунизации у животных из каждой группы брали кровь и готовили объединенный пул сывороток крови для определения титра AT в ИФА и РТГА. Результаты, характеризующие иммунологическую эффективность различных препаратов, представлены в таблице 1.
По иммуногенности препараты, содержащие адъюванты, мало отличались друг от друга, за исключением титров ИФА при иммунизации HBs Ag с АД-2. Как следует из полученных данных, в условиях одно- и двукратной иммунизации экспериментальные образцы антигенов при введении с адъювантами на основе наночастиц экстракта бересты проявляли более высокую иммуногенность, чем сам антиген и антиген, адсорбированный на гидроокиси алюминия. Наибольшую иммуногенную эффективность показал препарат HBs Ag, введенный с адъювантом АД-2. Данный адъювант повышал эффективность иммунизации как для HBs Ag, так и для инактивированного КЭ. Разница заключалась в том, что для инактивированного КЭ более выраженные результаты были получены после второй иммунизации. Пример 2 Для приготовления опытной вакцины адъювант АД-2 Сбэс=2% смешивали с антигеном вируса ньюкаслской болезни в соотношении 1:1. Смесь тщательно встряхивали и вводили цыплятам в грудную мышцу в объеме 0,5 мл. Другую группу цыплят привили инактивированной вакциной против ньюкаслской болезни, изготовленной в ФГУ “ВНИИЗЖ” на основе адъюванта ISA-70 (соотношение Аг:Ад 30:70). Третья группа цыплят оставалась невакцинированной. Сыворотки крови отбирались на 14, 21 и 31 сутки после вакцинации и исследовались в РТГА эритроцитов петуха вирусом ньюкаслской болезни. Результаты испытания представлены в таблице 2.
Пример 3 Опытный образец вакцины с адъювантом АД-2 готовили смешиванием препарата с инактивированным антигеном реовируса птиц в соотношении 1:1 и тщательным их перемешиванием. Одновременно с этим используя тот же антиген готовили образец на основе адъюванта ISA 70 в соотношении антиген-адъювант 30:70, который использовали для сравнения иммунного ответа. Цыплят 45-суточного возраста вакцинировали опытным образцом с препаратом наночастиц и контрольным образцом на основе ISA 70 в дозе 0,5 мл в область груди. Группу цыплят оставили невакцинированными. Сыворотки крови отбирались через 15 и 30 суток после вакцинации и исследовались в ИФА с использованием соответствующего набора для определения уровня антител. Результаты исследований представлены в таблицах 3 и 4.
Пример 4 Опытный образец вакцины с адъювантом АД-2 готовили смешиванием его с инактивированным антигеном метапневмовируса птиц в соотношении 1:1 и тщательным перемешиванием. Как и в опыте 2 готовили контрольный образец на основе адъюванта ISA 70. Цыплят 45-суточного возраста вакцинировали опытными с препаратом наночастиц и контрольными образцами на основе ISA 70 в дозе 0,5 мл в область груди. Группу цыплят оставили невакцинированными. Сыворотки крови отбирались через 15 и 30 суток после вакцинации и исследовались в ИФА с использованием соответствующего набора для определения уровня антител. Результаты исследований представлены в таблице 4.
Результаты исследований показывают, что использование препарата наночастиц экстракта бересты совместно с антигенами вируса ньюкаслской болезни, реовируса птиц и мета пневмовируса птиц в соотношении 1:1 и внутримышечном применении в дозе 0,5 мл на цыпленка имеет выраженное адъювантное действие, проявляющееся в повышении титра антител против соответствующего антигена и не уступающего по значению с действием адъюванта ISA70 для вируса ньюкаслской болезни и реовируса птиц.
Формула изобретения
1. Применение экстракта бересты в качестве адъюванта. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт бересты используют в виде наночастиц. 3. Применение по п.2 в виде водного раствора наночастиц.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
