Патент на изобретение №2355422
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКОПЛАЗМОЗНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПУТЕМ ГИПЕРИММУНИЗАЦИИ КРОЛИКОВ
(57) Реферат:
Изобретение касается получения микоплазмозных диагностических сывороток для диагностики микоплазмозов свиней в реакции непрямой иммунофлуоресценции. Способ предусматривает использование антигенов из трех культур микоплазм – Mycoplasma hyosynoviae, M. hyorhinis и Ureaplasma sp.Б которые используют для гипериммунизации кроликов в течение 21 дня путем дробного внутривенного введения антигенов каждые три дня с трехкратным применением иммуностимулятора левомизола. Динамику синтеза антител изучают на 7, 14 и 21 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Постановка реакции проводится по общепринятой методике. Для оценки реакции используют четырехкрестовую систему. Установлено, что на 7-й день после первого введения антигена антитела в РНИФ выявлялись в низких титрах 1:10-1:20. На 14-й день положительная реакция в РНИФ была при более высоких разведениях в пределах 1:320-1:640, а на 21-е сутки синтез антител достиг максимального уровня 1:640-1:1280. Использование способа обеспечивает получение противомикоплазмозных сывороток в более высоких диагностических титрах антител, сокращение сроков гипериммунизации и возможность использования полученных сывороток для диагностики микоплазмозов свиней в РНИФ. 5 табл.
Способ получения микоплазмозных сывороток для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) относится к методам лабораторной диагностики микоплазмозов и может быть использован в ветеринарной медицине. Известны способы получения гипериммунных сывороток при бруцеллезе, лептоспирозе животных, описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2007 гг. ( Однако данные способы обладают следующими недостатками: длительные сроки гипериммунизации; невысокие титры образующихся в крови кроликов антител и низкая активность полученных сывороток. Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения диагностических сывороток путем гипериммунизации кроликов, используемых в РНИФ для диагностики микоплазмозов плотоядных (Новикова Н.Н. Экспресс-методы диагностики ассоциативного урогенитального микоплазмоза плотоядных: дис Суть этого способа состоит в следующем. Для гипериммунизации используются трехсуточные культуры микоплазм, выделенные от плотоядных (M.fermentans, M.canis, M.laidlawii, U.urealyticum). Культуральную жидкость центрифугируют при 6 тыс. оборотах /мин в течение часа. Осадок после трехкратного ресуспендирования в физиологическом растворе и последующего центрифугирования доводят до концентрации 1,7 млрд микробных тел в 1 мл по бактериальному стандарту мутности. Гипериммунизацию микоплазмами проводят на 8 кроликах (по 2 головы на каждый штамм) весом 2,5-3 кг. Суть гипериммунизации состоит в дробном внутривенном введении антигена кроликам каждые три дня с двукратным применением иммуностимулятора левомизола подкожно.
Динамику синтеза антител изучают на 7, 14, 21 и 30 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлюоресценции, которую ставят на предметных стеклах по стандартной методике, учет реакции проводят в крестах, свечение менее чем на два креста считают отрицательным. В качестве антигенов в РНИФ применяют 1 млрд взвеси микоплазм, инактивированных на водяной бане при 70°С – 30 мин. На 30-е сутки всех кроликов тотально обескровливают и получают микоплазмозные диагностические сыворотки.
Наиболее высокий уровень антител регистрируется на 21-30 дни после гипериммунизации, который колеблется в пределах 1:320-1:640. Целью изобретения является получение микоплазмозных диагностических сывороток путем гипериммунизации кроликов для диагностики микоплазмозов свиней в реакции непрямой иммунофлуоресценции. Поставленная цель достигается при соблюдении ряда приемов: получением антигенов из трех культур микоплазм (М.hyosynoviae, M.hyorhinis и Ureaplasma sp.); гипериммунизацией кроликов в течение 21 дня путем дробного внутривенного введения антигенов каждые три дня с трехкратным применением иммуностимулятора левомизола. Описание метода Для гипериммунизации кроликов используются трехсуточные инактивированные нагреванием до 70°С в течение 30 минут культуры микоплазм (штаммы М.hyosinoviae, М.hyorhinis и Ureaplasma sp.), которые отмывали от питательной среды путем центрифугирования при 6000 об. 30 мин, осадок после трехкратного ресуспендирования и последующего центрифугирования разводили до концентрации 1,7 млрд микробных клеток в 1 мл по бактериальному стандарту мутности (ГИСК им. Л.А.Тарасовича). Иммуностимулятор левамизол вводили трехкратно для повышения иммуногенности вводимых штаммов микоплазм и сроки гипериммунизации сократили до 21-х суток в связи с максимальным титром антител в крови кроликов на 21-е сутки. В дальнейшем титр антител в крови кроликов начинает снижаться.
Динамику синтеза антител изучали на 7,14 и 21 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). На 21-е сутки всех кроликов тотально обескровливали и получали микоплазмозные диагностические сыворотки. При постановке РНИФ была использована следующая методика. На тщательно обезжиренные без царапин предметные стекла наносили пастеровской пипеткой параллельно друг другу несколько капель антигенов. Антигены высушивали и фиксировали над пламенем спиртовки. Затем на каждую каплю антигена наносили такую же каплю сыворотки, начиная с последнего разведения. Стекла выдерживали во влажной камере при 37°-38°С в течение 50-60 мин для образования комплекса антиген – антитело. После чего их промывали от несвязавшихся антител дистиллированной водой, подсушивали и наносили в красящем титре (подобранным опытным путем) ослиный антикроличий глобулин меченный ФИТЦ (флуоресцеин изотиоционатом натрия), изготовленный НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Затем стекла помещали на 15-20 минут во влажную камеру при температуре 37°-38°С. По истечении этого времени мазки промывали дистиллированной водой, просушивали и просматривали в люминесцентном микроскопе с обязательными контролями. 1. Антиген + сыворотка положительная + сыворотка люминесцентная; 2. Антиген + сыворотка отрицательная + сыворотка люминесцентная; 3. Антиген + физиологический раствор + сыворотка люминесцентная. Микроскопию проводили в падающем свете микроскопа МБИ-15. Для оценки интенсивности свечения использовали четырехкрестовую систему: ++++ – очень яркая люминесценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с телом клетки; +++ – яркая люминесцирующая периферия клетки; ++ или + – слабое свечение периферии клетки; – (минус) люминесценция клеток отсутствует. За положительный результат принимали яркое специфическое свечение контуров микробов в виде ободков с оценкой в 3 и 4 креста; сомнительные результаты оценивали в 2 креста при наличии слабого свечения контуров клеток.
Установлено, что на 7-й день после первого введения антигена антитела в РНИФ выявлялись в низких титрах 1:10-1:20. На 14-й день положительная реакция в РНИФ была при более высоких разведениях в пределах 1:320-1:640, а на 21-е сутки синтез антител достиг максимального уровня 1:640-1:1280. Преимущество данного способа получения противомикоплазмозных сывороток в более высоких диагностических титрах антител, в сокращении сроков гипериммунизации и в возможности использования полученных сывороток для диагностики микоплазмозов свиней в РНИФ. Контроль на видовую специфичность и активность полученных микоплазмозных сывороток в РНИФ. Для изучения видовой специфичности и активности использовали кроличьи антимикоплазмозные сыворотки в разведениях с 1:10 до 1:640 и микоплазмозные антигены, полученные вышеописанным способом. Определяя видовую специфичность и активность полученных микоплазмозных кроличьих сывороток в РНИФ, установили, что полученные сыворотки реагируют только с аналогичными антигенами и активны во всех используемых разведениях.
Формула изобретения
Способ получения микоплазмозных диагностических сывороток для диагностики микоплазмозов свиней в реакции непрямой иммунофлуоресценции путем гипериммунизации кроликов антигенами, полученными из трех культур микоплазм, с предусмотренным по схеме введением иммуностимулятора левомизола и изучением динамики синтеза антител на 7-е, 14-е и 21-е сутки, отличающийся тем, что в качестве антигенов используются инактивированные нагреванием при 70°С в течение 30 мин штаммы микоплазм, выделенных от свиней, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma hyorhinis и Ureaplasma species, по схеме иммуностимулятор левамизол вводят трехкратно и сроки гипериммунизации сокращают до 21 суток в связи с максимальным титром антител против вводимых микоплазмозных антигенов в крови кроликов на 21-е сутки.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
канд. вет. наук.: 16.00.03. / Н.Н.Новикова; – Новосибирск – 2002. – С.55-60).