Патент на изобретение №2355190

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ

(57) Реферат:

Способ получения биологически активной добавки заключается в трехстадийной обработке водной суспензии клеток дрожжей экзогенными ферментами с получением целевого продукта в виде ферментолизата. На первой и второй стадиях используют первую и вторую ферментные композиции. При этом первая ферментная композиция содержит на 1 г сухих дрожжей 0,05-5,0 ед. активности протеиназ и 10,0-50,0 ед. активности смеси эндо-бета-глюканазы и экзо-бета-глюканазы. Вторая ферментная композиция содержит 50,0-300,0 ед. активности смеси эндо-бета-глюканазы и экзо-бета-глюканазы, 5,0-20,0 ед. активности маннаназы и 0,01-0,5 ед. активности хитиназы. Обработку суспензии клеток дрожжей первой ферментной композицией осуществляют при температуре 54-56°С в течение 1 ч 45 мин – 2 ч 15 мин. Обработку второй ферментной композицией массы, полученной после завершения первой стадии, осуществляют при температуре 45-48°С в течение 3 ч 45 мин – 4 ч 15 мин. На третьей стадии осуществляют обработку полученной массы ферментами второй ферментной композиции при температуре 35-38°С в течение 6-12 ч. Способ позволяет получить целевой продукт с высоким выходом и высоким содержанием аминокислот. Выход продукта составляет 92%, концентрация аминного азота составляет 6,3%. 7 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано при производстве биологически активных добавок и в медицине.

Известен способ получения белоксодержащей биологически активной добавки, предусматривающий обработку биомассы клеток дрожжей экзогенными гидролитическими ферментами (Патент РФ 2230466, кл. A23L 1/30, опубл. 2004 г.) /1/.

Однако в данном известном способе не описаны условия обработки клеток дрожжей гидролитическими ферментами, не раскрыт состав используемого ферментного препарата, что не позволяет воспроизвести этот известный способ в части осуществления процесса ферментолиза.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является известный способ получения продукта обработки клеток дрожжей композицией гидролитических ферментов (Патент РФ 2104300, кл. A23L 1/28, опубл. 1998 г.) /2/.

Однако качество целевого продукта, получаемого этим известным способом, недостаточно высокое.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является повышение качества и биологической ценности целевого продукта за счет его обогащения низкомолекулярными биологически активными продуктами глубокого ферментативного гидролиза клеточных полимеров дрожжей.

Указанный технический результат достигается тем, что способ получения биологически активной добавки заключается в осуществлении трехстадийной обработки водной суспензии клеток дрожжей экзогенными ферментами, катализирующими гидролиз клеточных полимеров, с использованием на первой и второй стадиях соответственно первой и второй ферментных композиций и с получением целевого продукта в виде ферментолизата, при этом первая ферментная композиция содержит на 1 г сухих дрожжей 0,05-5,0 ед. ПС протеиназ и 10,0-50,0 ед. -ГкС смеси эндо--глюканазы и экзо--глюканазы, а вторая – 50,0-300,0 ед. -ГкС смеси эндо--глюканазы и экзо--глюканазы, 5,0-20,0 ед. МС маннаназы и 0,01-0,5 ед. ХС хитиназы, обработку суспензии клеток дрожжей первой ферментной композицией осуществляют при температуре 54-56°С в течение 1 часа 45 мин – 2 ч 15 мин, обработку второй ферментной композицией массы, полученной после завершения первой стадии, осуществляют при температуре 45-48°С в течение 3 ч 45 мин – 4 ч 15 мин, а на третьей стадии осуществляют дальнейшую обработку полученной массы ферментами второй ферментной композиции при температуре 35-38°С в течение 6-12 ч.

Перед обработкой клеток дрожжей экзогенными ферментами рекомендуется инактивировать эндогенные ферменты клеток дрожжей.

Инактивацию эндогенных ферментов клеток дрожжей рекомендуется осуществлять путем термической обработки водной суспензии их клеток при температуре 85-95°С в течение 15-20 мин.

Обработку суспензии клеток дрожжей ферментными композициями рекомендуется осуществлять при постоянном перемешивании.

В первой ферментной композиции в качестве источника протеиназ можно использовать протосубтилин.

В качестве источника эндо--глюканазы и экзо--глюканазы в ней можно использовать целловеридин.

Во второй ферментной композиции в качестве источника протеиназ, эндо--глюканазы, экзо--глюканазы, маннаназы и хитиназы можно использовать культуральную жидкость штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931.

В качестве источника эндо--глюканазы, экзо--глюканазы в ней дополнительно рекомендуется использовать целловеридин.

Способом согласно изобретению рекомендуется проведение при определенных режимных параметрах трехстадийной ферментативной обработки суспензии дрожжевых клеток, что обеспечивает глубокий ферментативный гидролиз клеточных полимеров и приводит к получению ферментолизата, обладающего высокой биологической активностью.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1. Готовят водную суспензию из 100 г сухих пекарных дрожжей и 250 мл воды. Смесь тщательно перемешивают. Для инактивации эндогенных ферментов дрожжевых клеток приготовленную суспензию нагревают до температуры 85°С и выдерживают при этой температуре в течение 20 мин, после чего смесь охлаждают до температуры 54°С. Смесь имеет естественный рН 5,8. В нее задают ферменты, катализирующие ферментативный гидролиз -глюкана (целловеридин как источник смеси экзо--глюканазы и эндо--глюканазы в количестве 10,0 ед. -ГкС на 1 г сухих дрожжей), и ферменты, катализирующие гидролиз по пептидным связям белково--глюканового, белково-маннанового и белково-хитинового полимеров (протосубтилин как источник протеиназ из расчета 0,05 ед. ПС на 1 г сухих дрожжей). Активность в препарате целловеридина 1000 ед. -ГкС на 1 г препарата. Активность в препарате протосубтилина 260 ед. ПС на 1 г препарата. Ферментативный гидролиз полимеров дрожжевых клеток на первой стадии проводят при естественном рН в течение 2 ч 15 мин при температуре 54°С при постоянном перемешивании. После завершения первой стадии ферментативного гидролиза полученная смесь состоит из продуктов гидролиза -глюкана, освободившихся белков цитоплазмы, белков, образовавшихся в результате ферментативного гидролиза по пептидным связям белково--глюканового, белково-маннанового и белково-хитинового полимеров, а также освободившихся из белковых комплексов -глюкана, маннана и хитина. Затем суспензию, обработанную ферментами на первой стадии, охлаждают до температуры 45°С. При проведении второй стадии ферментативного гидролиза используют культуральную жидкость штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931, полученную при его культивировании на среде, содержащей, %: ячменную муку – 4,0, пшеничные отруби – 2,0, КН₂PO₄ – 1,0, вода водопроводная – остальное. Штамм культивирован в аэробных условиях при температуре 32°С в течение 42 ч. Культуральная жидкость содержит высокоактивный комплекс протеиназ и пептидаз (карбоксильную, металлозависимую и сериновую протеиназу, аминопептидазу и карбоксипептидазу) с активностью 30 ед. ПС на 1 мл культуральной жидкости, смесь экзо--глюканазы и эндо--глюканазы с активностью 4,5 ед./мл, а также маннаназу и хитиназу. Культуральную жидкость микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931 дозирируют из расчета 20 ед. Пс на 1 г сухих дрожжей (67 мл культуральной жидкости), доводят активность -глюканаз до 40,0 ед. ГкС на 1 г сухих дрожжей добавлением препарата целловеридина. Ферментолиз дрожжевой суспензии на второй стадии проводят при естественном рН в течение 4 ч 15 мин при температуре 45°С при постоянном перемешивании. Об окончании второй стадии ферментолиза судят по нарастанию концентрации аминного азота и растворимых сухих веществ в супернатанте обрабатываемой суспензии дрожжевых клеток. Затем температуру полученной массы снижают до 35°С и выдерживают ее при этой температуре в течение 6 ч. При этом ферментолиз клеточных полимеров катализирует те ферменты, которые были введены в процесс на первой и второй стадиях обработки дрожжевых клеток. Полученный ферментолизат нагревают до температуры 85°С и выдерживают при этой температуре в течение 15 мин для инактивации экзогенных ферментов, затем его сушат на распылительной сушилке. В полученном ферментолизате концентрация аминного азота составляет 6,3%, концентрация редуцирующих веществ (углеводов) – 30,9%. Выход гидролизата составляет 92%. Препарат содержит биологически активные продукты глубокого ферментативного гидролиза клеточных полимеров дрожжей: активные пептиды, незаменимые и заменимые аминокислоты, биологически активные продукты гидролиза полимеров клеточной стенки (-глюкана, маннанов, хитина) и рекомендуется к использованию как биологически активная добавка.

Пример 2. Целевой продукт получают по методике примера 1 с соблюдением перечисленных далее режимных параметров. Инактивацию эндогенных ферментов дрожжевых клеток проводят при 95°С в течение 15 мин. На первой стадии обработки суспензии дрожжевых клеток используют первую ферментную композицию, содержащую на 1 г сухих дрожжей 5,0 ед. ПС протеиназ и 50.0 ед. -ГкС смеси эндо--глюканазы и экзо--глюканазы, а на второй стадии – вторую ферментную композицию, содержащую на 1 г сухих дрожжей 100 ед. -ГкС смеси эндо--глюканазы и экзо--глюканазы, 20 ед. Мс маннаназы и 0,5 ед. ХС хитиназы. Ферментолиз на первой стадии проводят при температуре 56°С в течение 1 часа 45 мин. Ферментолиз на второй стадии проводят при температуре 48°С в течение 3 ч 45 мин. Затем температуру полученной массы снижают до 37°С и выдерживают ее при этой температуре в течение 12 ч. При этом ферментолиз клеточных полимеров катализирует те ферменты, которые были введены в процесс на первой и второй стадиях обработки дрожжевых клеток. В полученном ферментолизате концентрация аминного азота составляет 6,1%, концентрация редуцирующих веществ (углеводов) – 21,5%. Выход гидролизата составляет 91%.

Полученный ферментолизат характеризуется высоким содержанием аминокислот в свободной форме, активных низкомолекулярных пептидов и легкоусваиваемых продуктов гидролиза -глюкана, маннанов и хитина, а также отсутствием горьких пептидов.

Пример 3. Проведены клинические испытания, которые показали эффективность использования препарата, полученного по способу согласно изобретению, в качестве лечебно-профилактической добавки в питании больных, страдающих нарушениями обменных процессов и нарушениями работы желудочно-кишечного тракта. Препарат показал высокую эффективность его применения в постоперационный период. Успешно применяется препарат для лечения псориаза и атопического дерматита. Он способствует нормализации белкового обмена, повышению усваиваемости пищи, оказывает общеукрепляющее действие, обладает иммуномодулирующим действием.

Результаты испытаний у детей с нарушениями противоинфекционной защиты показали высокую эффективность препарата как средства повышения иммунного статуса и функциональной выносливости организма и средства улучшения обменных процессов. Препарат рекомендован детям и взрослым, длительно болеющим, имеющим очаги хронической инфекции, детям и взрослым со сниженными показателями сопротивляемости организма, а также лицам, вследствие каких-либо причин не получающих с пищей необходимого количества полноценного белка, витаминов и микроэлементов.

Комплексом проведенных медико-биологических исследований показано наличие антиоксидантных и антионкологических свойств продукта, получаемого способом согласно изобретению. Препарат вызывает селективный апоптоз клеток перевиваемых линий клеток опухолей, не оказывая при этом влияния на нормальные клетки человека, что заключается в изменении клеточного цикла опухолевых клеток и активации каспазы-3.

Таким образом, способ согласно изобретению позволяет получать высококачественную биологически активную добавку с антиоксидантными свойствами, рекомендуемую для лечебно-профилактических целей при питании людей с целью нормализации антиоксидантной защиты организма, а также в комплексной терапии и профилактике раковых заболеваний.

Формула изобретения

1. Способ получения биологически активной добавки, заключающийся в осуществлении трехстадийной обработки водной суспензии клеток дрожжей экзогенными ферментами, катализирующими гидролиз клеточных полимеров, с использованием на первой и второй стадиях соответственно первой и второй ферментных композиций и с получением целевого продукта в виде ферментолизата, при этом первая ферментная композиция содержит на 1 г сухих дрожжей 0,05-5,0 ед. активности протеиназ и 10,0-50,0 ед. активности смеси эндо-бета-глюканазы и экзо-бета-глюканазы, а вторая – 50,0-300,0 ед. активности смеси эндо-бета-глюканазы и экзо-бета-глюканазы, 5,0-20,0 ед. активности маннаназы и 0,01-0,5 ед. активности хитиназы, обработку суспензии клеток дрожжей первой ферментной композицией осуществляют при температуре 54-56°С в течение 1 ч 45 мин – 2 ч 15 мин, обработку второй ферментной композицией массы, полученной после завершения первой стадии, осуществляют при температуре 45-48°С в течение 3 ч 45 мин – 4 ч 15 мин, а на третьей стадии осуществляют дальнейшую обработку полученной массы ферментами второй ферментной композиции при температуре 35-38°С в течение 6-12 ч.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед обработкой клеток дрожжей экзогенными ферментами инактивируют эндогенные ферменты клеток дрожжей.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что инактивацию эндогенных ферментов клеток дрожжей осуществляют путем термической обработки водной суспензии их клеток при температуре 85-95°С и в течение 15-20 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку суспензии клеток дрожжей ферментными композициями осуществляют при постоянном перемешивании.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в первой ферментной композиции в качестве источника протеиназ используют протосубтилин.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в первой ферментной композиции в качестве источника эндо-бета-глюканазы и экзо-бета-глюканазы используют целловиридин.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что во второй ферментной композиции в качестве источника протеиназ, эндо-бета-глюканазы, экзо-бета-глюканазы, маннаназы и хитиназы используют культуральную жидкость штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что во второй ферментной композиции в качестве источника эндо-бета-глюканазы, экзо-бета-глюканазы дополнительно используют целловиридин.