|
|
(21), (22) Заявка: 2005117338/13, 12.12.2003
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
12.12.2003
(30) Конвенционный приоритет:
13.12.2002 US 60/433,448
13.12.2002 US 60/433,452
(43) Дата публикации заявки: 20.03.2006
(46) Опубликовано: 10.05.2009
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
US 6307024 (PRESNELL ET AL.), 23.10.2001. ASANO R. ET AL., FEBS Lett., 528(1-3), 70-76, 2002.
(85) Дата перевода заявки PCT на национальную фазу:
13.07.2005
(86) Заявка PCT:
US 03/39764 20031212
(87) Публикация PCT:
WO 2004/055168 20040701
Адрес для переписки:
107023, Москва, ул. Б.Семеновская, 49, оф.404, Фирма патентных поверенных ООО “ИННОТЭК”, пат.пов. Т.А.Вахниной, рег.  122
|
(72) Автор(ы):
ЧАН Чунг (US),
ЗЭМОСТ Брус Л. (US),
КАВЕРТ Даглас К. (US),
ЛИУ Хонг Й. (US),
ДЕ ДЖОНГ Кэрен С. (US),
МАЙЕР Джеффри Д. (US),
ХОЛДЕРМЕН Сьюзан Д. (US)
(73) Патентообладатель(и):
ЗАЙМОДЖЕНЕТИКС, Инк. (US)
|
(54) ПРОДУЦИРОВАНИЕ IL-21 В ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ-ХОЗЯЕВАХ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в биомедицинской промышленности. Предложены экспрессионные векторы для получения IL-21 в клетках Е.coli. Кодирующая IL-21 нуклеотидная последовательность, включенная в состав новых векторов, содержит модификации, которые направлены на оптимизацию кодонов и вторичной структуры мРНК для трансляции в Е.coli. В результате трансформации предложенными векторными конструкциями получены штаммы Е.coli, пригодные для применения в промышленном масштабе. Разработаны способы крупномасштабного производства IL-21, использующие названные штаммы, которые позволяют получать более 1 г/л рекомбинантного цитокина. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 12 табл.
Текст описания приведен в факсимильном виде.                                                                                                             
Формула изобретения
1. Экспрессионный вектор для продуцирования в Е.coli белка IL-21, содержащий следующие функционально присоединенные элементы:
(a) точку начала репликации;
(b) ДНК-элемент инициации транскрипции;
(c) полинуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO:27, и
(d) терминатор транскрипции.
2. Экспрессионный вектор по п.1, который дополнительно содержит селектируемый маркер.
3. Экспрессионный вектор рТАР337 для продуцирования в Е.coli белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:27, который депонирован в АТСС под номером РТА-4853.
4. Клетка-хозяин E.coli, трансформированная экспрессионным вектором по любому из пп.1-3.
5. Клетка-хозяин по п.4, которая является клеткой штамма E.coli W3110.
6. Способ продуцирования белка IL-21, предусматривающий:
(a) культивирование клеток-хозяев по п.5 в среде, подходящей для экспрессии IL-21;
(b) извлечение клеток из среды для выращивания;
(c) выделение из клеток белка IL-21.
7. Способ продуцирования белка IL-21, предусматривающий:
(a) культивирование клеток-хозяев по п.5 в среде для выращивания периодической ферментацией с подпиткой;
(b) извлечение клеток из среды для выращивания;
(c) выделение из клеток белка IL-21.
8. Способ продуцирования белка IL-21, предусматривающий:
(a) культивирование клеток-хозяев по п.4 или 5 во встряхиваемой колбе до OD600 от 5 до 20 в среде для выращивания;
(b) засев аппарата для ферментации от 1 до 12% об./об. содержимым встряхиваемой колбы;
(c) культивирование клеток в аппарате в среде для выращивания при рН от 6,2 до 7,2, в процессе которого питательный раствор подают ранее 15 ч фактической продолжительности ферментации (EFT);
(d) добавление на 20-30 часы фактической продолжительности ферментации индуцирующего агента;
(e) сбор клеток-хозяев в интервале от 48 до 56 ч фактической продолжительности ферментации;
(f) выделение из клеток белка IL-21.
9. Способ по п.8, в котором индуцирующим агентом является изопропилтиогалактопиранозид (IPTG) из расчета от 0,5 до 2 мМ.
10. Способ по п.8, где питательный раствор содержит углевод, выбранный из группы, состоящей из глицерина и глюкозы, в концентрации среды для выращивания и скоростью питания 5-15 г углевода в час.
11. Способ по п.10, где глицерин является 40-70%-ным (об./об.) глицерином, а глюкоза является 40-70%-ной (мас./об.) глюкозой.
12. Способ по п.10, где содержание глицерина составляет примерно 70% (об./об.) или содержание глюкозы составляет примерно 60% (мас./об.).
13. Способ продуцирования белка IL-21, предусматривающий:
(а) подготовку посевной колбы с инокулятом, содержащим клетки-хозяева по п.5, и со средой для выращивания, содержащей примерно 5 г/л глицерина;
(b) культивирование инокулята в среде для выращивания в течение 16-20 ч приблизительно при 30°С;
(c) перенос культивированного инокулята в среде для выращивания в ферментер для периодического культивирования в концентрации 0,5-5% (об./об.);
(d) ферментацию периодического культивирования примерно при 37°С и рН около 6,8 в присутствии приблизительно 2% глицерина;
(e) начало подачи на 8 часу фактической продолжительности ферментации глюкозного питания с параметрами, соответствующими примерно 9,5 г/л/ч, и продолжение этой процедуры до истечения времени ферментации;
(f) добавление на 24 часу IPTG до конечной концентрации от 0,5 до 2 мМ;
(g) ферментацию еще примерно в течение 28 ч после добавления IPTG;
(h) слив ферментационной среды из ферментера;
(i) добавление к ферментационной среде примерно равного объема воды;
(j) гомогенизацию и центрифугирование ферментационной среды для сбора осадка или суспензии клеток, содержащих белковый материал;
(k) выделение из клеток белка IL-21.
14. Клетка-хозяин штамма, обозначенного ZGOLD1 и сданного на хранение в АТСС под номером РТА – 5698, которая трансформирована вектором рТАР337, охарактеризованным в п.3, – продуцент IL-21.
Приоритет по пунктам:
13.12.2002 по пп.1-14.
РИСУНКИ
|
|
