Патент на изобретение №2354692

(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ТРАНСГЕННОГО ТАБАКА NICOTIANA TABACUM L., СОДЕРЖАЩЕГО ГЕН ИНТЕРЛЕЙКИНА-18 ЧЕЛОВЕКА

(57) Реферат:

Изобретение может быть использовано в фармакологии для выращивания биомассы клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген интерлейкина-18 человека, а также в исследовательских целях. Семена трансгенных растений Nicotiana tabacum L. стерилизуют, переносят на безгормональную питательную среду и проращивают in vitro на свету в течение 28 суток. Полученные проростки рассекают на сегменты размером 0,2-0,3 см², переносят на модифицированную питательную среду, включающую 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, индолилуксусную кислоту и кинетин. Для стерилизации семян используют раствор, состоящий из 96%-ного этанола, 37%-ной перекиси водорода и воды в объемном соотношении 7,5:1:1. Образовавшийся каллус, содержащий ген интерлейкина-18 человека, культивируют в темноте в течение 21-28 суток и размножают пассированием до требуемого количества. 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармакологической промышленности для выращивания биомассы клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L. и в исследовательских целях при изучении функционирования генов, введенных в растения.

Известно применение трансгенных растений в качестве продуцентов белков медицинского назначения, в частности, в лабораторных условиях созданы трансгенные растения – источник лекарственных вакцин против гепатита-В, малярии, а также вакцины, повышающие иммунитет человека и животных.

На базе института цитологии и генетики СО РАН (г.Новосибирск) методом агробактериального переноса генетических конструкций получены генетически модифицированные растения табака Nicotiana tabacum L., включающие гены интерлейкина человека IL-10 и IL-18 (Дейнеко Е.В., Шумный В.К. и др. Заявка РФ

Одним из путей получения рекомбинантного белка с использованием трансгенных растений является культивирование трансгенных клеток in vitro, что является более технологичным и экологически безопасным процессом. Известно, что изолированная растительная клетка сохраняет генетическую информацию родительского растения (тотипотентность). При определенных условиях, например, при благоприятном температурном и световом режиме, при подборе необходимых фитогормонов, делящаяся клетка in vitro дает аморфное образование – клеточную культуру, или каллус, состоящую, в основном, из недифференцированных клеток. Методы извлечения белковых структур из клеточной биомассы известны и широко используются в фармакологии.

Техническая задача изобретения – получение in vitro клеточной культуры трансгенных растений Nicotiana tabacum L. – продуцента белка интерлейкин-18 человека, в необходимых количествах. Способы получения и культивирования in vitro трансгенных культур, содержащих интерлейкин-18, в доступных патентных и литературных источниках не обнаружены.

Поставленная задача решается тем, что вместо использования интактных растений табака получают экспланты, индуцируют каллусогенез и проводят последующее субкультивирование. В качестве эксплантов используют сегменты проростков, полученных из семян трансгенных растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген интерлейкина-18 человека, для чего упомянутые семена стерилизуют, переносят на безгормональную питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) и проращивают in vitro на свету в течение 28 суток, полученные проростки рассекают на сегменты размером 0,2-0,3 см², переносят их на гормональную питательную среду с добавлением 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в концентрации 0,5-2 мг/л, индолилуксусной кислоты в концентрации 1-2,5 мг/л и кинетина в концентрации 0,1 мг/л и инкубируют в темноте в течение 3-4 недель с образованием каллуса.

Таким образом, в отличие от способа-прототипа, использующего биомассу интактных растений, заявляемый способ включает стерилизацию и проращивание семян трансгенных растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген интерлейкина-18, сегментирование проростков и индукцию каллусогенеза на питательной среде МС с добавлением органических компонентов (агар, сахароза), а также необходимых витаминов и гормонов.

Для упомянутой стерилизации используют раствор, состоящий из 96%-ного этанола, 37%-ной перекиси водорода и воды в объемном соотношении 7,5:1:1 соответственно.

В таблице 1 приведен оптимальный состав питательной среды для получения проростков.

В таблице 2 приведен состав питательной среды для инкубации подготовленных эксплантов (агаризованная среда МС с добавлением ауксинов и цитокинина).

В таблице 3 приведен состав модифицированной питательной среды МС для субкультивирования клеточной культуры.

Способ культивирования in vitro клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген интерлейкина-18 человека, по изобретению осуществляют следующим образом:

В подготовленные стерильные контейнеры для выращивания проростков разливают стерильную агаризованную безгормональную питательную среду 1.

Получение эксплантов. Семена растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген интерлейкина-18 человека после исследования их жизнеспособности подготавливают к посеву на фильтре. Для решения задачи стерилизации семян подбирают компоненты стерилизующего раствора и оптимизируют их количественное содержание. В условиях асептики (ламинарный бокс) помещают бумажные фильтры в чашки Петри, с помощью пипетки-дозатора смачивают фильтр стерилизующим раствором (4-5 мл). Семена помещают на смоченный фильтр. Открытые чашки Петри оставляют под УФ-излучением на 10 мин, после чего фильтры оставляют в ламинарном шкафу на 40-45 мин до высыхания. Семена с подсохшего фильтра высаживают в подготовленные контейнеры на застывшую питательную среду. Закрывают контейнеры парафилмом и помещают в культуральную комнату на белый свет (интенсивность I=1000 лк, фотопериод 16/8, температура t=25-27°С). Примерно через 28 дней полученные стерильные проростки табака сегментируют и используют для получения каллусной культуры.

Индукция каллусогенеза. В условиях ламинарного бокса проростки табака извлекают пинцетом из контейнеров. С помощью скальпеля рассекают проростки на сегменты площадью 0,2-0,3 см². Полученные экспланты помещают на модифицированную гормональную среду МС (таблица 2). Оптимальному составу гормонов соответствует среда 2б. Пробирки или чашки Петри с эксплантами переносят в культуральную комнату, где поддерживают температуру воздуха t=25-27°С при 65-70%-ной влажности.

Образовавшийся каллус, содержащий ген интерлейкина-18 человека, пересаживают на модифицированную питательную среду МС (таблица 3) и субкультивируют в течение 21-28 суток. Оптимальному составу гормонов соответствует среда 3б. Требуемую биомассу клеточной культуры выращивают пассированием. Как получение, так и дальнейшее выращивание клеточной культуры осуществляют в темноте. В лабораторных условиях пассировано несколько поколений клеточной культуры трансгенного табака, в которых не обнаружено явления сайленсинга (“замолкания”) трансгенов интерлейкина-18. Присутствие рекомбинантного белка в каллусе соответствует его содержанию в интактном растении.

Для определения заявленных пределов компонентов испытаны различные варианты питательных сред, приведенные в таблицах 2 и 3: ниже и выше заявленных пределов способ показывает неудовлетворительные результаты. Ниже приведен пример реализации способа. В примере использованы варианты сред 1, 2б, 3б.

Пример.

Заявленным способом культивируют in vitro клеточные культуры трансгенной линии растений табака IL18 7-1 и исходной линии SR1 (дикая линия).

Семена трансгенного табака стерилизуют в растворе заявленного состава: 30 мл 96%-ного этанола+4 мл воды+4 мл 37%-ной перекиси водорода. В контейнеры, чашки Петри или колбы Эрленмейера разливают по 30 мл питательной среды. Производят посев семян на питательную среду МС 1. Через 26 суток образовавшиеся на свету in vitro проростки используют в качестве эксплантов. Из листовых эксплантов трансгенной линии табака IL18 7-1, культивируемых в темноте на заявленной модифицированной среде 2 с гормонами, образуется каллус, пассируемый в дальнейшем на заявленных питательных средах 3. Одновременно в тех же условиях культивируют клеточную культуру линии SR1.

Субкультивирование Nicotiana tabacum L. включает посадку полученной каллусной культуры на среду 3, выращивание биомассы и отбор ее части для дальнейшего культивирования. Для получения значительных объемов биомассы каллусной культуры табака через 10-15 суток после образования каллуса отбирают активно растущую биомассу, пересаживают в количестве 0,5 г в каждую колбу на свежую питательную среду 3, культивирование ведут в течение 3-4 недель.

Морфометрические показатели клеток. По сравнению с исходной линией SR1, которая состоит из клеток правильной округлой или овальной формы, трансгенная линия IL18 7-1 имеет клетки, вытянутые в длину, объемы которых в 1,5-2 раза превышают родительскую линию. Каллусные культуры трансгенной линии IL18 7-1 отличаются от линии SR1 уплотненной структурой и желтой окраской. Подобные различия сохраняются на протяжении последующих трех пассажей.

Жизнеспособность каллусной культуры определяют по стандартной методике, путем окрашивания клеток метиленовым синим (Паушева З.П., 1988; Мигранова И.Г. и др., 2000). Ростовые характеристики каллусной культуры определяют, определяя сухую и сырую биомассу, подсчитывая количество клеток в камере Фукса-Розенталя. Прирост сырой биомассы оценивают по средней начальной и средней конечной массе каллусной культуры по общепринятому показателю – ростовой индекс. Свежую биомассу клеточной культуры используют для выделения растворимого белка.

Промышленная применимость технического решения обусловлена свойством изолированных растительных клеток сохранять генетическую информацию родительского растения и получением на практике клеточной культуры трансгенного табака, содержащего интерлейкин-18 человека, в количествах, достаточных для клинических испытаний и терапевтического использования.

Новизна технического решения определяется тем, что способы культивирования in vitro клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген интерлейкина-18 человека, не известны из уровня техники.

Изобретательский уровень настоящего изобретения заключается в том, что определена последовательность операций и найдены неочевидные условия, обеспечивающие каллусогенез и интенсивный рост клеточной культуры.

Источники информации

3. Дейнеко Е.В., Шумный В.К. и др. Заявка РФ 2005133963 на изобретение «Рекомбинантная плазмидная ДНК pBin101 – IL18, кодирующая синтез интерлейкина-18 человека в трансгенных растениях».

Среда 1 для получения проростков – безгормональная питательная среда МС рН 5,8 Таблица 1
Компоненты	Содержание, мг/л
неорганические
KNO3	1900
КН2PO4	170
NH4NO3	1650
MgSO4×7H2O	370
CaCl2×2H2O	440
FeSO4×7Н2О	37,3
Na2EDTA×2H2O	27,8
KI	0,83
Н3 BO3	6,2
MnSO4×4H2O	22,3
CoCl2×6Н2О	0,025
CuSO4×5Н2O	0,025
ZnSO4×7H2O	8,6
Na2MoO4×2H2O	0,25
органические
сахароза	30000
агар	7500-8500
тиамин-HCl	0,5-1,5
пиридоксин-HCl	0,4-0,6
никотиновая кислота	0,4-0,6
вода дистиллированная	до 1 л

Среда 2 для инкубации подготовленных эксплантов – агаризованная гормональная среда МС с дополнениями, мг/л Таблица 2
Дополнения	2а	2б	2в
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	0,5	1	2
индолилуксусная кислота	1	2	2,5
кинетин	0,1	0,1	0,1
ростовая активность	+	++	+
+умеренный рост
++активный рост

Среда 3 для выращивания клеточной культуры – модифицированная питательная среда МС с дополнениями, мг/л Таблица 3
Дополнения	3а	3б	3в
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	1,0	2,0	3,0
6-бензиламинопурин	0,1	0,2	0,3
ростовая активность	+	++	+
+умеренный рост ++активный рост

Формула изобретения

1. Способ культивирования in vitro клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген интерлейкина-18 человека, включающий получение эксплантов, индукцию каллусогенеза, и последующее субкультивирование, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют сегменты проростков, полученных из семян трансгенных растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген интерлейкина-18 человека, для чего упомянутые семена стерилизуют, переносят на безгормональную питательную среду и проращивают in vitro на свету в течение 28 суток, полученные проростки рассекают на сегменты размером 0,2-0,3 см², переносят их на гормональную питательную среду со следующими дополнениями, мг/л:

и инкубируют в темноте в течение 3-4 недель с образованием каллуса.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутую стерилизацию проводят в растворе следующего состава, объемных долей:

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для субкультивирования используют модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга со следующими дополнениями, мг/л:

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при культивировании поддерживают температуру окружающей среды 25-27°С при влажности 65-70%.