Патент на изобретение №2354401

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии. Способ включает введение исследуемого иммуномодулирующего препарата и оценку иммунного статуса. При этом вводят ППД-туберкулин для млекопитающих подкожно в дозе 1,3-1,8 мл на животное. Затем через 3-5 дней вводят иммуномодулирующее средство в расчете на 1 кг массы животного в 0,2-1 мл физиологического раствора. Через 7-10 дней вводят вакцину БЦЖ внутрикожно. Через 30-35 дней после иммунизации вводят вирулентную культуру М.bovis подкожно в дозе 0,0001 мг, и через 30-35 дней проводят патологоанатомическое исследование убитых животных. Оценку иммунного статуса проводят по индексу защиты: от 100% до 67% – высокая способность иммуномодулирующего средства, 66-43% – средняя, от 42% – низкая. Способ позволяет повысить точность оценки при снижении материальных затрат. 2 табл.

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к технике оценки свойств препаратов на их способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность, и может быть использовано в научных лабораториях для изучения иммуномодулирующих свойств известных и вновь синтезируемых препаратов.

Известно, что иммунная система является первой мишенью при воздействии на организм вредных факторов физического, химического, биологического генеза. В отличие от этого патогенные микроорганизмы, условно-патогенная микрофлора, обладая уникальной способностью к изменчивости и адаптации, могут повышать свою вирулентность, способность преодоления естественных защитных барьеров. Указанные факторы влияют на становление иммунной системы на ранних этапах онтогенеза, обусловливая у плода и новорожденного нарушение в ней, сопровождающееся снижением иммунного ответа, развитием толерантности, иммунодефицитных состояний (Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский. Иммунодефициты домашних животных. М., 1996. – 96 с.).

В научной литературе описаны факторы, вызывающие утрату иммунологической толерантности (ареактивности), которые в основном относятся к двум группам: 1-я группа – неспецифические факторы, стимулирующие иммунный ответ толерантных животных; 2-я группа – специфические по отношению к антигену, вызвавшему толерантность (Л.Н.Фонталин, Л.А.Певницкий. Иммунологическая толерантность. М.: Медицина. – 1978. – С.165-176).

Иммуномодулирующие свойства известных и вновь синтезируемых средств определяют оценкой иммунного статуса как гуморального, так и клеточного у человека или животных до и после их применения: в крови определяют общее количество Т-лимфоцитов и их субпопуляций; количество В-лимфоцитов; количество иммуноглобулинов основных изотипов G, М, А (патент РФ RU 2034542, кл. А61К 31/305, 1995). Определяют относительное содержание Т-лимфоцитов и их субпопуляций; пролиферативную активность Т-лимфоцитов на ФГА в реакции бластной трансформации (РБТ); соотношение Т-хелперов/ Т-супрессоров и другие иммунологические показатели (патент РФ RU 2112543, кл. А61К 39/04, А61К 47/48, 1998); К.А.Лебедев, И.Д.Понякина. Иммунная недостаточность (выявление и лечение). М.: Медицинская книга. Н. Новгород. – 2003. – С.230-347.

Однако составление иммунограммы для определения иммунного статуса и оценки эффективности иммуномодулирующих средств является трудоемким и дорогостоящим исследованием.

Также при оценке иммунного статуса нельзя не учитывать, что одно и то же состояние организма или любой его системы может быть достигнуто множеством вариантов сочетаний параметров отдельных компонентов. Какой вариант будет реализован в каждом конкретном случае, зависит не только от генетических особенностей индивида, но и от набора внешних факторов – закономерных и случайных, благоприятных и неблагоприятных. Это положение также затрудняет более объективную оценку иммуномодулирующей эффективности изучаемых препаратов.

Задачей изобретения является повышение точности оценки иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность, снижение материальных затрат.

Задача достигается путем индуцирования иммунологической толерантности аллергеном (ППД-туберкулин для млекопитающих) у морских свинок подкожно в дозе 1,3-1,8 мл на животное, через 3-5 дней парентерально вводят изучаемый иммуномодулирующий препарат для восстановления утраченной иммунологической реактивности в расчете на 1 кг массы животного в 0,2-1 мл физиологического раствора, через 7-10 дней морских свинок иммунизируют вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора, через 30 дней заражают вирулентной культурой микобактерий M.bovis подкожно в дозе 0,0001 мг, через 30 дней проводят убой морских свинок и по результатам патологоанатомического исследования оценивают иммуномодулирующие свойства изучаемых препаратов по индексу защиты – от 100% до 67% – высокая способность иммуномодулирующего средства, 66-43% – средняя, от 42% – низкая.

Отличительными признаками предложенного способа являются: экспериментальное индуцирование у морских свинок иммунологической толерантности путем введения ППД-туберкулина для млекопитающих в дозе 1,3-1,8 мл на животное и восстановление утраченной реактивности с помощью изучаемых иммуномодулирующих средств в расчете на 1 кг массы животного в 0,2-1 мл физиологического раствора. Оценивают степень восстановления иммунологической реактивности у морских свинок. Иммунизируют вакциной БЦЖ на способность противостоять экспериментальному заражению вирулентной культурой микобактерий. Проводят убой морских свинок и патологоанатомическое исследование убитых животных, по индексу защиты оценивают: от 100% до 67% – высокая способность иммуномодулирующего средства, 66-43% – средняя, от 42% – низкая.

Предложенный способ повышает точность, снижает трудоемкость и материальные затраты. На одно исследование 30 морских свинок предлагаемым способом материальные затраты без учета стоимости лабораторных животных и их содержания составили 1200 рублей, в то время как материальные затраты на изучение иммуномодулирующих свойств препаратов с оценкой иммунного статуса: подсчет общего числа лейкоцитов, выведение лейкоцитарной формулы крови, определение общего количества Т-лимфоцитов и их субпопуляций, определение общего числа В-лимфоцитов составляют в расчете на одно исследование 30 лабораторных животных 12000 руб., что в 10 раз выше предлагаемого способа (по ценам практических лабораторий иммунологических исследований).

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. Опыт проводят на 25 морских свинках. С целью индукции у морских свинок иммунологической толерантности 20-ти животным вводят аллерген – ППД-туберкулин для млекопитающих подкожно в дозе 1,5 мл. Толерагенные свойства туберкулопротеидов (туберкулезных аллергенов) были установлены рядом исследователей (Под ред. М.М.Авербаха / Иммунология и иммунопатология туберкулеза. М.: Медицина. – 1976. – С.73-88). Затем 20 морских свинок разделяют на 5 групп по 4 в каждой. Животных 1-й группы иммунизируют вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора через 3 дня после толерогенной обработки; 2-ой – через 7 дней; 3-ей – через 14 дней; 4-ой – через 21 день; 5-ой – через 28 дней. Морских свинок 6-ой группы (5 животных) иммунизируют вакциной БЦЖ без предварительной толерогенной обработки. Всех морских свинок исследуют ППД-туберкулином через 30 дней после вакцинации.

Результаты кожной аллергической реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих показаны в таблице 1.

Таблица 1
Кожная аллергическая реакция у морских свинок на вакцину БЦЖ после толерогенной обработки
Группы животных	Количество животных	Сроки введения БЦЖ животным после толерогенной обработки	Кожная реакция на ППД-туберкулин через 30 дней после вакцинации, мм
Реагирующих животных	M±m
1	4	через 3	–
2	4	7	–
3	4	14	–
4	4	21	2	6,25±3,66
5	4	28	3	10,0±3,56
6	5	за 30 дней до исследования ППД-туберкулином	5	16,4±3,47

Из таблицы видно, что у морских свинок восстановление утраченной иммунологической реактивности начинается с 21 дня после толерогенной обработки. В течение первых двух недель после толерогенной обработки морские свинки не отвечают на вакцину БЦЖ кожной аллергической реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих. Следовательно, в эти сроки можно испытывать препараты на способность устранять у животных толерантное состояние. Таким образом, оптимальным сроком введения вакцины БЦЖ являются 14-16 дни после введения ППД-туберкулина или 7-10 дни после введения иммуномодулятора.

Пример 2. Испытание иммуномодулирующих средств и их оценка.

Проводят сравнительную оценку иммуномодулирующих препаратов известным способом, оценивая иммунологические реакции, и предлагаемым. Для проведения эксперимента использовали: ронколейкин, полиоксидоний, поливинилпирролидон. Ронколейкин – рекомбинантный интерлейкин-2 человека (ИЛ-2), который способен усиливать пролиферацию Т-лимфоцитов и последующий синтез ИЛ-2, дифференцировку и активацию В-лимфоцитов и макрофагов. Полиоксидоний – иммуномодулятор химического синтеза. Препарат способен взаимодействовать с клеточными структурами на мембране клетки и является эффективным средством при различных формах вторичных иммунодефицитов, стимулирует продукцию цитокинов, усиливает реакции гуморального и клеточного иммунитета. Поливинилпирролидон (ПВП) с молекулярной массой 12600±2700 – синтетический неприродный полиэлектролит, модулирующий иммуногенез, обладает митогенными свойствами, стимулирует миграцию стволовых клеток.

15-ти морским свинкам вводят толероген (как в примере 1) и разделяют на 3 группы: 1-я группа – 5-ти морским свинкам через 3 дня после толерогенной обработки подкожно вводят ронколейкин трижды с интервалом 24 часа в дозе по 3,5 тыс.БД 0,2 мл физиологического раствора (общая доза на животное – 10,5 тыс.ЕД); 2-ая – 5 животным вводят внутримышечно полиоксидоний трижды по 0,06 мг 0,2 мл физиологического раствора (общая доза на животное 0,18 мг); 3-я – 5-ти животным вводят поливинилпирролидон (ПВП) по 5 мг на животное в 1 мл физиологического раствора (кратность и дозы препаратов соответствуют инструкции по их применению). Через 10 дней после введения иммуномодуляторов морских свинок иммунизируют вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг 0,1 мл физиологического раствора; 4-я группа – 5 здоровых интактных морских свинок также были привиты вакциной БЦЖ; 5-я – 4 интактные морские свинки, которых инфицируют вирулентной культурой М.bovis подкожно в дозе 0,0001 мг в 1 мл физиологического раствора. Одновременно инфицируют морских свинок всех опытных групп.

Иммуномодулирующие свойства препаратов изучают с помощью оценки иммунного статуса по определению в крови морских свинок наиболее активных иммунокомпетентных клеток: определение количества в тесте Е-рок – Т-лимфоцитов; ЕАС-рок – В-лимфоцитов; ЕА-рок – лимфоцитов-киллеров; ЕТ-рок (туберкулиновые) – антигенреактивных лимфоцитов и нейтрофилов. Отбор проб крови проводят через 30 дней после иммунизации и 30 дней после экспериментального заражения. Число иммунокомпетентных клеток определяют в абсолютном содержании (тыс./мкл). Результаты по изучению числа иммунокомпетентных клеток у морских свинок после вакцинации и заражения вирулентной культуры микобактерий показаны в таблице 2.

Иммунологическая перестройка в организме морских свинок через 30 дней после вакцинации сопровождается увеличением числа иммунокомпетентных клеток, при этом высокой степени достоверности достигает увеличение числа Т-лимфоцитов у животных всех групп, кроме 4-й группы.

Через 30 дней после инфицирования также отмечают увеличение у морских свинок числа Т-лимфоцитов, однако достоверных различий оно достигает у животных, которым вводили ронколейкин и вакцину БЦЖ.

Таблица 2
Результаты оценки иммуномодулирующих свойств препаратов на толерантных морских свинках
группы	Сроки исследования	Препарат	Символы статистики	Иммунокомпетентные клетки
Е-рок	ЕАС-рок	ЕА-рок	ЕТ-рок	нейтрофилы
1	через 30 дней после иммунизации	Ронколейкин	М=	2,95	2,60	1,83	1,61	1,98
m±	0,62	0,30	0,28	0,28	0,77
Р	0,04	0,22	0,57	0,68	0,18
2	Полиоксидоний	М=	4,55	3,66	2,49	1,73	2,05
m±	0,81	0,79	0,38	0,29	0,55
Р	0,008	0,09	0,09	0,54	0,07
3	ПВП	М=	2,61	2,70	1,67	1,94	1,94
m±	0,40	0,38	0,22	0,49	0.84
Р	0,03	0,21	0,88	0,44	0,23
4	БЦЖ	М=	1,91	2,95	2,58	1,68	3,81
m±	0,36	0,92	0,69	0,34	1,06
Р	0,19	0,36	0,23	0,61	0,02
5	контроль	М=	1,33	1,99	1,62	1,38	0,82
m±	0,17	0,32	0,22	0,45	0,08
1	через 30 дней после инфицирования	Ронколейкин	М=	4,39	3,41	3,49	1,46	1,17
m±	0,82	0,22	0,80	0,28	0,28
Р	0,04	0,43	0,97	0,09	0,06
2	Полиоксидоний	М=	3,45	3,73	4,55	1,23	1,26
m±	0,66	1,39	0,97	0,20	0,41
Р	0,13	0,73	0,41	0,15	0,10
3	ПВП	М=	2,39	3,15	2,46	0,94	1,23
m±	0,40	0,39	0,39	0,16	0.23
Р	0,64	0,34	0,28	0,72	0,07
4	БЦЖ	М=	3,77	3,49	2,62	1,99	2,02
m±	0,30	1,09	0,30	0,38	0,76
Р	0,01	0,59	0,34	0,02	0,44
5	контроль	М=	2,12	4,38	3,45	0,87	2,87
m±	0,38	1,13	0,76	0,09	0.73

Из таблицы видно, что оценку иммуномодулирующих препаратов возможно провести, определяя наиболее активные в иммунном ответе иммунокомпетентные клетки, это затрудняет проводить оценку эффективности каждого иммуномодулирующего средства в сравнительном аспекте. Затраты на одно исследование 30 морских свинок составили 12000 руб., что в 10 раз дороже предлагаемого нами способа.

2. – С.80-84.): сначала определяли в количественных показателях интенсивность распространения поражения туберкулезного характера каждой опытной и контрольной морской свинки. Показатель поражений оценивали от 0 до 9. Так, показатель поражений в 1-й группе составил: 3, 0, 0, 3, 0; во 2-й – 3, 3, 3, 4; в 3-й группе – 4, 4, 4, 3, 0; в 4-й группе – 0, 0, 5, 3, 3 и в 5-й группе – 4, 4, 8, 7.

Затем устанавливали средний показатель поражения для каждой опытной группы животных путем вычисления средних арифметических величин из индивидуальных показателей по формуле:

где В – показатель интенсивности поражений группы животных;

А – показатель поражения каждой морской свинки в группе;

n – количество животных в группе.

Например, показатель интенсивности поражений 1-й группы составил:

Подставив значения исследуемых групп в формулу, аналогично определили показатель интенсивности поражений остальных опытных групп (соответственно: 3,25; 3,0; 2,2; 5,75).

Для оценки напряженности иммунитета применяли индекс защиты, предложенный А.И.Тогуновой (1948). Из среднего показателя интенсивности поражения контрольной группы вычитали такой же показатель, установленный для опытной группы. Затем полученный остаток, взятый в процентах, делили на средний показатель интенсивности поражения контрольной группы по формуле:

где С – индекс защиты;

В_К – показатель интенсивности поражений в контрольной группе;

В_О – показатель интенсивности поражений в опытной группе.

Например, индекс защиты в 1-й группе составил:

индекс защиты в во 2-й группе составил:

Из таблицы 3 видно, что ронколейкин является наиболее эффективным препаратом для восстановления иммунологической реактивности (индекс защиты 79%), ПВП и полиоксидоний (соответственно: 48 и 43%).

Результаты показывают, что предлагаемый способ оценки иммуномодулирующих свойств препаратов предпочтительно использовать как экономически выгодный и более точный.

Формула изобретения

Способ оценки иммуномодулирующих препаратов, включающий введение исследуемого иммуномодулирующего препарата, оценку иммунного статуса, отличающийся тем, что вводят ППД-туберкулин для млекопитающих подкожно в дозе 1,3-1,8 мл на животное, затем через 3-5 дней вводят иммуномодулирующее средство в расчете на 1 кг массы животного в 0,2-1 мл физиологического раствора, через 7-10 дней вводят вакцину БЦЖ внутрикожно, через 30-35 дней после иммунизации вводят вирулентную культуру М.bovis подкожно в дозе 0,0001 мг и через 30-35 дней проводят патологоанатомическое исследование убитых животных, по индексу защиты оценивают: от 100 до 67% – высокая способность иммуномодулирующего средства, 66-43% – средняя, от 42% – низкая.