Патент на изобретение №2353387

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ПАСТЕРЕЛЛЕЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической диагностики. Способ по изобретению касается получения антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума путем экстракции пастереллезного капсульного антигена из культур пастерелл раствором хлористого натрия, центрифугирования экстракта и отделения супернатанта. Полученный супернатант подвергают стерилизующей фильтрации и используют его для сенсибилизации формалинизированных танинизированных эритроцитов животных. Экстракцию пастереллезного капсульного антигена проводят 2,0-2,5%-ным раствором хлористого натрия при 40-42°С в течение 30-40 мин, а супернатант перед стерилизующей фильтрацией прогревают при 65-70°С в течение 15-30 мин. Использование способа позволяет повысить качество целевого продукта за счет увеличения его чувствительности и специфичности.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической диагностики, в частности для получения пастереллезного эритроцитарного диагностикума.

Известен способ получения антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума путем экстракции пастереллезного капсульного антигена из культур пастерелл раствором хлористого натрия, центрифугированием экстракта, отделением супернатанта с последующей стерилизующей фильтрацией его и сенсибилизацией им формалинизированных танинизированных эритроцитов животных (ж. Ветеринария, 7, 2001, стр.25-28).

Недостатками известного диагностикума является низкое качество целевого продукта, характеризующееся его низкой чувствительностью и специфичностью.

Задачей заявленного технического решения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения его чувствительности и специфичности.

Поставленная задача решается в способе получения антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума путем экстракции пастереллезного капсульного антигена из культур пастерелл раствором хлористого натрия, центрифугированием экстракта, отделением супернатанта с последующей стерилизующей фильтрацией его и сенсибилизацией им формалинизированных танинизированных эритроцитов животных тем, что экстракцию пастереллезного капсульного антигена проводят 2,0-2,5%-ным раствором хлористого натрия при 40-42°С в течение 30-40 мин, а супернатант перед стерилизующей фильтрацией прогревают при 65-70°С в течение 15-30 мин.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».

Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

При разработке эритроцитарных антигенных диагностикумов первостепенное значение имеет получение высокоактивных антигенов, содержащих наиболее важные компоненты бактериальной клетки и обладающих наиболее выраженной иммуногенной активностью. В связи с этим разработка стабильных и специфичных пастереллезных эритроцитарных диагностикумов на основе растворимых капсульных антигенов пастерелл является важнейшей задачей для изучения закономерности формирования иммунного ответа к капсульным компонентам пастерелл и выявления степени напряженности иммунитета у привитых противопастереллезными вакцинами животных. Нами впервые установлено, что экстракция пастереллезного капсульного антигена из культур пастерелл раствором хлористого натрия определенной концентрации при 40-42°С в течение 30-40 мин с последующим прогреванием его при 60-70°С в течение 15-30 мин позволяет получить неочевидный положительный эффект – повышение качества целевого продукта за счет, по-видимому, снижения степени присутствия серологически родственных компонентов различных серотипов пастерелл в составе капсульных антигенов, что приводит к увеличению выхода растворимых капсульных компонентов в экстракт и повышению чувствительности и специфичности антигенного диагностикума, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1.

Селекционированную 16 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A,B,D 1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в матровые колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу с помощью шпателя смывают с поверхности агара 2,0%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,3), доводят 2,0%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,3) концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т. (по оптическому стандарту мутности) и проводят экстракцию пастереллезного капсульного антигена при 40°С в течение 30 мин, затем центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 70°С в течение 15 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22. Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов /для приготовления антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума известным способом/ путем сенсибилизации ими формализированных танинизированных эритроцитов лошади по методу М.И.Леви с соавт. (ЖМЭИ, 1967, 1, с.133). Активность полученного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных гипериммунных сывороток, полученных на капсульные антигены пастерелл. Специфичность антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо-и гетерологичными антисыворотками. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica составила 1:2400, 1:3200, 1:2400, 1:1800 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica равен 1:2, 1:4, 1:4 и 1:40 соответственно.

Пример 2.

Селекционированную 17 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A,B,D 1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу с помощью шпателя смывают с поверхности агара 2,3%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,2), доводят 2,3%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,2) концентрацию полученной суспензии до 45 млрд м.т. (по оптическому стандарту мутности) и проводят экстракцию пастереллезного капсульного антигена при 41°С в течение 35 мин, затем центрифугируют при 13000 об/мин в течение 20 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 65°С в течение 30 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 25 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22. Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов /для приготовления антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума известным способом/ путем сенсибилизации им формализированных эритроцитов лошади по методу М.И.Леви с соавт. (ЖМЭИ, 1967, 1, с.133). Активность полученного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных гипериммунных сывороток, полученных на капсульные антигены пастерелл. Специфичность антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными антисыворотками. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica составила 1:2400, 1:3200, 1:2400, 1:1600 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica равен 1:4, 1:8, 1:8 и 1:80 соответственно.

Пример 3.

Селекционированную 18 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A,B,D 1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу с помощью шпателя смывают с поверхности агара 2,5%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,4), доводят 2,5%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,4) концентрацию полученной суспензии до 50 млрд м.т. (по оптическому стандарту мутности) и проводят экстракцию пастереллезного капсульного антигена при 42°С в течение 40 мин, затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 67,5°С в течение 22,5 мин, центрифугируют при 13000 об/мин в течение 20 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22. Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов /для приготовления антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума известным способом/ путем сенсибилизации им формализированных эритроцитов лошади по методу М.И.Леви с соавт. (ЖМЭИ, 1967, 1, с.133). Активность полученного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных гипериммунных сывороток, полученных на капсульные антигены пастерелл. Специфичность антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными антисыворотками. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica составила 1:2800, 1:3200, 1:3200, 1:1800 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica равен 1:4, 1:8, 1:8 и 1:60 соответственно.

Активность диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica, полученных известным способом, составила 1:1200, 1:1200, 1:1600, 1:800 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica равен 1:32, 1:32, 1:32 и 1:64 соответственно.

Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемые антигенные пастереллезные эритроцитарные диагностикумы к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica позволяют повысить качество целевого продукта путем повышения его активности в 1,7-2 раза, а также увеличить специфичность ее в 2-8 раз.

Формула изобретения

Способ получения антигенного пастереллезного эритроцитарного диагностикума путем экстракции пастереллезного капсульного антигена из культур пастерелл раствором хлористого натрия, центрифугированием экстракта, отделением супернатанта с последующей стерилизующей фильтрацией его и сенсибилизацией им формалинизированных танинизированных эритроцитов животных, отличающийся тем, что экстракцию пастереллезного капсульного антигена проводят 2,0-2,5%-ным раствором хлористого натрия при 40-42°С в течение 30-40 мин, а супернатант перед стерилизующей фильтрацией прогревают при 65-70°С в течение 15-30 мин.