Патент на изобретение №2352938
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНОГО К ТУБЕРКУЛЕЗУ
(57) Реферат:
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при оценке устойчивых и восприимчивых к туберкулезу лабораторных и сельскохозяйственных животных. Способ осуществляется следующим образом: формируют группу клинически здоровых животных одного вида, исследуют активность креатинкиназы и лактатдегидрогеназы, определяют среднее значение каждого из этих показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение показателя каждого животного со средней величиной этого же показателя для конкретной группы животных, при повышении активности креатинкиназы и одновременном понижении активности лактатдегидрогеназы относительно среднего значения каждого показателя для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу. Дополнительно исследуют активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, определяют среднее значение каждого из показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы только у животных с повышенной активностью креатинкиназы и пониженной активностью лактатдегидрогеназы со средней величиной аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы соответственно для конкретной группы животных, при понижении активности аланинаминотрансферазы и/или повышении активности аспартатаминотрансферазы относительно среднего значения каждого из этих показателей для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу. Изобретение обеспечивает снижение временных и материальных затрат. 1 з.п. ф-лы, 7 табл.
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при оценке устойчивых и восприимчивых к туберкулезу лабораторных и сельскохозяйственных животных. Известно широкое использование биохимических тестов в медицине, в частности для диагностики и прогнозирования состояния больных в послеоперационный период и при развитии острого воспалительного процесса. Так, известен способ оценки состояния больного, основанный на определении активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы (патент РФ Однако способ предназначен только для человека и используется для прогнозирования течения заболевания у больных. Известны способы определения активности туберкулеза по биохимическим показателям крови (например, а.с. СССР Известен также способ оценки тяжести туберкулезной инфекции путем определения концентрации в плазме крови таурина и глутаминовой кислоты (патент РФ Однако все вышеуказанные способы, как и предыдущий аналог, используются только в медицине и предназначены для оценки состояния уже больных людей. Известен способ прогнозирования продуктивности коров по биохимическому анализу крови (патент РФ Данный способ позволяет в раннем возрасте прогнозировать пожизненную продуктивность и срок хозяйственного использования здоровых животных. Однако он не предназначен для оценки устойчивости организма животных к заболеванию туберкулезом. Наиболее близким к заявляемому является способ отбора крупного рогатого скота на устойчивость к туберкулезу здоровых животных (см. патент РФ Однако способ длителен и сложен в исполнении, требует большого количества ингредиентов. Кроме этого, способ не позволяет определять устойчивость к туберкулезу других видов животных (свиней, овец), включая и лабораторных (морских свинок, мышей, крыс, кроликов). Изобретение направлено на решение задачи создания способа оценки восприимчивости организма здорового животного к туберкулезу на основе изучения его биохимических показателей крови. Техническим результатом изобретения является быстрота и простота исполнения способа при снижении затрат и расширении области применения за счет возможности использования как для сельскохозяйственных, так и лабораторных животных. Для решения поставленной задачи в способе оценки устойчивости организма животного к туберкулезу путем исследования крови согласно изобретению формируют группу клинически здоровых животных одного вида, исследуют активность креатинкиназы и лактатдегидрогеназы, определяют среднее значение каждого из этих показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение показателя каждого животного со средней величиной этого же показателя для конкретной группы животных, при повышении активности креатинкиназы и одновременном понижении активности лактатдегидрогеназы относительно среднего значения каждого показателя для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу. Для повышения точности оценки устойчивости организма животного к туберкулезу дополнительно исследуют активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, определяют среднее значение каждого из показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы только у животных с повышенной активностью креатинкиназы и пониженной активностью лактатдегидрогеназы со средней величиной аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы соответственно для конкретной группы животных, при понижении активности аланинаминотрансферазы и/или повышении активности аспартатаминотрансферазы относительно среднего значения каждого из этих показателей для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу. В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа оценки устойчивости организма животного к туберкулезу, позволяющего проводить дифференциацию здоровых животных на восприимчивых и устойчивых к заболеванию туберкулезом по некоторым биохимическими показателям крови. При этом при повышении активности креатинкиназы (КК) и одновременном понижении активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) относительно среднего значения каждого показателя для конкретной группы животных одного вида судят об устойчивости организма животного к туберкулезу. ЛДГ – фермент, катализирующий реакцию превращения пирувата в лактат, которая является конечной реакцией анаэробного пути окисления глюкозы. Поэтому повышение активности ЛДГ свидетельствует о повышении активности гликолиза, т.е. о повышении анаэробной доли окислительного процесса. КК – фермент, катализирующий реакцию фосфорилирования креатина, протекающую в аэробных условиях с использованием энергии связи АТФ в тканях и органах с высокой активностью анаэробного окисления. Поэтому увеличение значения КК говорит о возрастании аэробного окисления. Следовательно, низкие значения ЛДГ и высокие КК свидетельствуют о возрастании доли аэробного окисления. Возрастание доли аэробного окисления, в свою очередь, говорит об увеличении кислородзависимой килинговой активности нейтрофилов в отношении микобактерий, что приводит, в конечном итоге, к устойчивости животных к заражению туберкулезом. Для повышения точности оценки устойчивости организма здорового животного к туберкулезу дополнительно исследуют активность аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ). ACT – фермент, катализирующий перенос аминогруппы с аспарагиновой кислоты на АЛТ – фермент, катализирующий перенос аминогруппы с аланина на Следовательно, у животных с высоким относительно среднего значением ACT, низким значением АЛТ и повышенным содержанием холестерина преобладает высокая доля аэробного окисления, что также свидетельствует об устойчивости животных к заражению туберкулезом. Таким образом, авторами впервые выявлено, что увеличение доли аэробного процесса окисления в организме и снижение доли анаэробного процесса окисления способствуют формированию защитных сил организма и, как следствие – повышению устойчивости животных к заражению туберкулезом. Все известные на сегодняшний день методы связаны с исследованиями уже инфицированного организма. Авторами выявлен лишь один источник информации, являющийся прототипом данного изобретения (см. патент РФ Кроме этого, авторами запатентованы методы оценки устойчивости здорового организма животных к туберкулезу. В одном случае – путем определения поглотительной способности нейтрофилов и наличия микобактерий на лимфоцитах (патент РФ Задачу выявления устойчивого к заражению туберкулезом здорового организма животного на основе изучения его биохимических показателей крови, никто не ставил. Сказанное позволяет нам сделать вывод о наличии в заявляемом способе критерия «изобретательский уровень». Все ферменты (КК, ЛДГ, ACT, АЛТ) определялись кинетическими методами. КК – методом Оливера и Розальского (Recommendation of the German Society for Clinical Chemistry. Standartization of methods for the estimation of enzyme activities in biological fluids: Standard method for the determination of creatine kinase activity. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1977; 15: 255-260; Stein W. Creatine kinase (total activity), creatine kinase isoenzymes and variants, In: Tomas L., ed. Clinical laboratory diagnostics. Frankfurt: TH-Books Verlagsgesellschaft; 1998., p.71-80), основанным на способности КК катализировать разрушение креатин-фосфата с одновременным превращением АДФ в АТФ, которое далее участвует в ферментативном фосфорилировании глюкозы. ЛДГ – методом Врублевского и Ля Дью (Wilkinson J., Qureshi A. Catabolism of plasma enzymes, as Studied I-125 labeled lactate dehydrogenase-I in the rabbit. – Clin. chem., 1976, v.22, p.1269-1276), основанным на оптическом тесте Варбурга. ACT – методом без применения фосфопиридоксаля Кармен (Moss D.W., Henderson A.R. Clinical enzymology. In: Burtis C.A., Ashwood E.R., editors. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 3rd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company; 1999), основанным на способности ACT катализировать перенос аминогруппы с аспарагиновой кислоты на АЛТ – методом без применения фосфопиридоксаля Генлей, Врублевского и Ля Дью (Bergmeyer H.U., Horder M., Rej R. International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) Scientific Committee. Analitical section: approved recommendation (1985) on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part 3. IFCC methods for alanine aminotransferase (L-alanine:2-oxoglutarate aminotransferase, EC 2.6.1.2; J. Clin. Biochem. 1986; 24: 481-495), основанным на способности АЛТ катализировать перенос аминогруппы с аланина на Для проверки устойчивости к заражению туберкулезом проводили контрольное заражение лабораторных животных. Морским свинкам, крысам, кроликам вводили 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis. За телятами вели наблюдения в течение 4 лет. Способ осуществляется следующим образом. 1. Формируют группу клинически здоровых животных одного вида (кролики, крысы, морские свинки, телята, цыплята-бройлеры) в количестве до 100 животных в группе. 2. У этих животных берут кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность КК и ЛДГ. 3. По каждому показателю в каждой группе животных находят среднее арифметические значение. 4. Выявляют животных, у которых активность ЛДГ ниже найденного среднего арифметического значения для конкретной группы, а активность КК – выше. Этих животных считают устойчивыми к заражению туберкулезом. 5. При необходимости более точной оценки, в этой группе животных дополнительно определяют значения ACT и АЛТ. При понижении активности АЛТ и/или повышении активности ACT относительно среднего значения каждого из этих показателей для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу. Пример 1. Формируют группу морских свинок в количестве 7 голов. Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность ЛДГ, КК. Для повышения точности оценки устойчивости определяют ACT и АЛТ. Результаты представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, из 7 животных показатель КК выше среднего наблюдался у животных В данной группе животных только одна морская свинка ( Дополнительные критерии оценки по значениям АЛТ и ACT выявили уровень активности АЛТ у животного При экспериментальном заражении животных туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis, животное Всего было обследовано в опытах 25 морских свинок. Пример 2. Формируют 2 группы телят в возрасте до одного месяца и в возрасте 3-4 месяца из неблагополучных по туберкулезу хозяйств. Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность ЛДГ, КК, ACT и АЛТ. Результаты исследований представлены в таблицах 2 и 3.
В первой группе (см. таблицу 2) у 4 животных ( У отобранных телят ( Уровень АЛТ у обоих животных оказался ниже среднего. Концентрация холестерина у животного Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод о высокой устойчивости к туберкулезу животных Таким образом, 22% животных будут устойчивы к туберкулезу. Из таблицы 3 следует, что показатели ЛДГ ниже среднего значения наблюдались у животных Поскольку ни одно животное не удовлетворяло требуемому условию (одновременно превышения КК и понижения ЛДГ относительно среднего значения), делаем вывод об отсутствии устойчивых к туберкулезу животных в этой группе. Всего в опытах было использовано 40 телят. В дальнейшем, за этими телятами вели наблюдения в течение 4 лет. Животные Все животные, указанные в таблице 3, в дальнейшем также заразились. Пример 3. Исследования проводились на крысах. Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность ЛДГ, КК. Для повышения точности оценки устойчивости определяют ACT и АЛТ. Результаты представлены в таблице 4.
Как видно из таблицы 4, у 15 из 26 крыс (57,6%) значения КК и ЛДГ соответствуют условиям отбора: одновременно показатель КК выше среднего и показатель ЛДГ ниже среднего значения ( Дополнительные критерии оценки по значениям АЛТ и ACT выявили, что у одних животных отобранной группы уровень активности АЛТ ниже среднего ( Все крысы были также подвергнуты экспериментальному заражению туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis. Отобранные 15 крыс, кровь которых удовлетворяла критерию устойчивости, не заболели, остальные заболели. Из 100 крыс, всего использованных в эксперименте, 75 удовлетворяли необходимому условию, из них при экспериментальном заражении животных 68 крыс не заболели (90%). Из оставшихся 25 при экспериментальном заражении заболели все животные. Пример 5. Исследования проводились на кроликах. Определяли активность ЛДГ, КК, ACT и АЛТ. Результат представлен в таблице 5.
Как видно из таблицы 5, у 5 кроликов из 14 (35,7%) одновременно показатель КК выше среднего и показатель ЛДГ ниже среднего значения – животные Из 30 кроликов, использованных в эксперименте, только 10 удовлетворяли критерию отбора на устойчивость. Кролики также подвергались экспериментальному заражению туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis. Животные, кровь которых удовлетворяла критерию отбора, не заболели, а остальные 20 кроликов заболели. Пример 6. Исследования проводились на цыплятах – кросса «Родонит-2» в возрасте до 110 дней (яйценоские) и кросса «Иза» (бройлеры) в возрасте до 45 дней. Из 100 цыплят кросса «Родонит-2» и 50 цыплят-бройлеров кросса «Иза» необходимому условию не удовлетворял никто. Все цыплята при экспериментальном заражении туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.avium, заболели. В таблицах 6 и 7 представлены результаты исследований.
Таким образом, заявляемый метод позволяет эффективно выявлять среди здоровых животных (как лабораторных, так и сельскохозяйственных) устойчивых к заболеванию туберкулезом.
Формула изобретения
1. Способ оценки устойчивости организма животного к туберкулезу путем исследования крови, отличающийся тем, что формируют группу клинически здоровых животных одного вида, исследуют активность креатинкиназы и лактатдегидрогеназы, определяют среднее значение каждого из этих показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение показателя каждого животного со средней величиной этого же показателя для конкретной группы животных, при повышении активности креатинкиназы и одновременном понижении активности лактатдегидрогеназы относительно среднего значения каждого показателя для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу. 2. Способ оценки устойчивости организма животного к туберкулезу по п.1, отличающийся тем, что дополнительно исследуют активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, определяют среднее значение каждого из показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы только у животных с повышенной активностью креатинкиназы и пониженной активностью лактатдегидрогеназы со средней величиной аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы соответственно для конкретной группы животных, при понижении активности аланинаминотрансферазы и/или повышении активности аспартатаминотрансферазы относительно среднего значения каждого из этих показателей для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||