Патент на изобретение №2352640

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ КУР К ВИРУСНЫМ ИНФЕКЦИЯМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к молекулярной биологии и ветеринарной медицине. Способ предусматривает определение полиморфизма гена Mx1. Проводят выделение ДНК, которую затем подвергают амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПНР) с использованием двух праймеров. Далее проводят рестрикцию амплификата рестриктазой Rsa I и детекцией продуктов рестрикции. При этом о генетической предрасположенности кур к вирусным инфекциям судят по появлению в геле после электрофореза амплифицированных фрагментов ДНК размером 76 н.п. Изобретение обеспечивает возможность высокоточного, простого и дешевого анализа генетической предрасположенности кур к вирусным инфекциям. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Изобретение относится к молекулярной биологии и ветеринарной медицине и может быть использовано для быстрого и массового определения генетической предрасположенности кур к вирусным инфекциям.

Протеин, продукт Мх1 гена играет важнейшую роль в интерферон-индуцированном противовирусном ответе (1) у различных позвоночных, начиная от рыб, заканчивая человеком (2). Мх1 протеин – это интерферон-индуцируемая ГТФ-аза, ингибирующая мультипликацию вирусов, генетическая информация которых хранится в минус цепи РНК (3). Результатом действия Мх1 белка является снижение пролиферативной активности ряда вирусов, в том числе и вируса гриппа (4). Молекулярный механизм действия данного протеина заключается в ингибировании репликации нуклеиновых кислот вирусов, для которых свойственно проникновение в клеточное ядро (5). Мх1 белок связывается с ВР2 субъединицей вирусной полимеразы (6), блокируя, таким образом, увеличение копийности генетического материала вируса. Противовирусное действие Мх1 белка, дислоцированного внутри ядра, на примере вируса гриппа показано для мышей и крыс (7). На примере уток было показано, что данный белок может обладать противовирусным действием, локализуясь не только внутри ядра, но и в цитоплазме (8). У кур наибольшей значимостью в противовирусном иммунитете обладает цитоплазматическая форма Мх1 белка (9, 10).

Известно, что полиморфизм одного нуклеотида в регуляторной или кодирующей последовательности гена может приводить к его значимым функциональным изменениям. Полиморфизм A/G в 2032 позиции кодирующей последовательности Мх1 гена приводит к возможности включения в аминокислотную последовательность белка разных аминокислот Asn/Ser в 631 позиции. Для случая данного полиморфизма в геноме домашних кур доказано протективное действие аллеля А, вызывающего включение Asn в 631 позиции аминокислотной последовательности белка.

Известен способ выявления противовирусной активности различных форм Мх1 гена у человека и мыши, основанный на геномном секвенировании предварительно клонированных полиморфных вариантов Мх1 гена, трансфекции культур клеток плазмидным вектором, экспрессирующим ту или иную форму Мх1 гена, изучением экспрессии белков интерферонового пути в сочетании с контролем активности репликации вируса гриппа (11)

Однако данный способ предназначен для изучения противовирусной активности полиморфных вариантов Мх1 гена мышей и человека и непригоден для птиц.

Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является способ детекции полиморфизма и противовирусной активности Мх1 гена кур, включающий отбор проб биоматериала от различных кур, выделение РНК, синтез кДНК, клонирование полноразмерного транскрипта гена Мх1 в плазмидный вектор и секвенирование подготовленного образца. (12)

Недостатками данного способа являются его сложность и длительность (не менее 6 дней на анализ), в связи с чем он не может быть использован в практической ветеринарной медицине и селекции.

Технической задачей заявляемого способа является упрощение и удешевление анализа для массового использования в клинических лабораториях.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в генотипировании полиморфизма в гене Мх1, приводящего к замене Ser631Asn в гене Мх1 кур, вызывающей снижение его активности, и оценке на этой основе риска возникновения вирусной инфекции у поголовья птиц.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Пробы биоматериала птиц (например, крови) выделяют любым пригодным для последующей постановки ПЦР способом. Например, геномную ДНК из крови птиц выделяют из подкрыльцовой вены с использованием методики ISOCODE (13).

ПЦР проводят в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис.-HCl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl₂; 0,01% Твин 20; 0,2 мМ дНТФ; 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, прямой 5′-AATCTGATTGCTCAGGCGTGTA-3′ мутагенный, для введения сайта рестрикции фермента Rsa I, обратный 5′-CCTTGGGTTTAGTTCACTGAAGA-3′ и l ед. Taq-полимеразы. Реакцию проводят на амплификаторе «Терцик» с начальной денатурацией при 95°С в течение 3 мин, далее в течение 45 циклов с денатурацией при 95°С в течение 10 сек, отжигом при температуре 62°С в течение 10 сек и синтезом при 72°С в течение 10 сек. Финальную элонгацию проводят при 72°С 3 мин.

Аликвоты ПЦР реакционной смеси используют для ПДРФ анализа. Рестрикцию амплификата проводят в течение 24 часов при темпераруре 37°С, 2 ед. рестриктазы Rsa I. Аликвоты реакционной смеси фракционируют в 6% полиакриламидном геле. Наличие сайта рестрикции позволяет выявить дефектную форму гена Мх1 как в гомозиготном, так и гетерозиготном состоянии (наличие фрагмента рестрикции размером 98 п.н. свидетельствует о наличии аллеля А, а наличие фрагмента рестрикции размером 76 п.н. свидетельствует о наличии аллеля G).

Определяющими отличиями заявляемого способа по сравнению с прототипом являются: изучение Мх1 гена производят непосредственно в геномной ДНК кур, минуя этап синтеза кДНК, а для синтеза фрагмента гена Мх1, содержащего функционально-значимый полиморфный участок, в ПЦР используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: прямой 5′-AATCTGATTGCTCAGGCGTGTA-3′ мутагенный, обратный 5′-CCTTGGGTTTAGTTCACTGAAGA-3′, а для выявления замены Ser631Asn проводят рестрикцию амплификата рестриктазой Rsa I с последующей детекцией продуктов рестрикции, что позволяет существенно упростить и удешевить известный способ, а также сделать его доступным для массового использования в клинических лабораториях.

Для создания в ампликоне сайта узнавания фермента рестрикции использовали мутагенный праймер, содержащий однонуклеотидную замену. При амплификации с праймера, несущего однонуклеотидную замену, сайт рестрикции Rsa I возникал только в случае аллеля G, что позволило в дальнейшем различать аллельные варианты гена в исследуемых образцах.

Сайт рестрикции Rsa I располагается в функционально-значимом участке гена Мх1 и замена аденина на гуанин в этом сайте сопровождается заменой серина на аспарагин в 631 позиции гена Мх1, при этом аллель G является дефектной формой гена Мх1, а аллель А не содержит упомянутого дефекта.

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.

Пример.

Для анализа были использованы ДНК, выделенные на ISOCODE (13) из образцов крови промышленных кроссов и линий, собранных в Новосибирском регионе и Красноярском крае. Были исследованы образцы ДНК кросса «gibra PN», кросса «Hubbard Isa brayn», кросса «Hubbard Isa JV», линии породы «Hubbard Isa white» fl5, линии породы «Hubbard Isa white» M-99, «Hubbard Isa» кросс f-15, кросса “highsex white” несушка, линии породы АВ кросс “highsex white”. Всего было исследовано 169 образцов ДНК домашней птицы.

Для исследования однонуклеотидной замены в Мх1 гене кур был использован метод детекции полиморфизма гена Мх1 с использованием ПЦР в сочетании с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Для создания в ампликоне сайта узнавания фермента рестрикции использовался мутагенный праймер, содержащий однонуклеотидную замену. При амплификации с праймера, несущего однонуклеотидную замену, сайт рестрикции Rsa I возникал только в случае аллеля G, что позволило в дальнейшем различать аллельные варианты гена в исследуемых образцах. Так как контроль прохождения ферментативного гидролиза является важным элементом для правильной интерпретации результатов, был использован «внутренний» контроль рестрикции, который заключался в дополнительном сайте гидролиза, расположенном в незначимой зоне амплифицированного фрагмента.

ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис. – HCl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl₂; 0,01% Твин 20; 0,2 мМ дНТФ; 0,3 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, прямой 5′-AATCTGATTGCTCAGGCGTGTA-3′ мутагенный, для введения сайта рестрикции фермента Rsa I, обратный 5′ -CCTTGGGTTTAGTTCACTGAAGA-3′ и 1ед. Taq-полимеразы. Реакцию проводили на амплификаторе «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Россия) с начальной денатурацией при 95°С 3 мин, далее в течение 36 циклов с денатурацией при 95°С 10 сек, отжигом при температуре 62°С в течение 10 сек и синтезом при 72°С в течение 10 сек. Финальная элонгация проводилась при 72°С 3 мин.

Аликвоты ПЦР реакционной смеси объемом 10 мкл использовали для ПДРФ анализа. Рестрикцию продукта амплификации проводили в течение 24 часов при температуре 37°С, 2 ед. эндонуклеазы рестрикции Rsa I.

Пробы после рестрикции подвергали электрофорезу в 6% полиакриламидном геле. Образцы визуализировали в ультрафиолетовых лучах после предварительной окраски бромистым этидием. При гидролизе ферментом рестрикции образцов с генотипом АА детектировались фрагменты 186 н.п., 98 н.п., с генотипом GG – фрагменты 186 н.п., 76 н.п., 21 н.п., с генотипом AG-фрагменты 186 н.п., 98 н.п., 76 н.п., 21 н.п. (см. чертеж).

Для подтверждения результатов, полученных методом ПЦР-ПДРФ, было проведено секвенирование ряда исследуемых образцов. В таблице 1 представлены результаты, полученные с использованием секвенирования и заявляемого способа, где: «+» – наличие замены Ser631Asn в гене Мх1, «-» – отсутствие замены Ser631Asn в гене Мх1.

Таблица 1
п/п	Метод секвенирования	Метод ПЦР-ПДРФ анализа
1	+	+
2	+	+
3	+	+
4	+	+
5	–	–
6	–	–
7	–	–
8	–	–
9	–	–
10	–	–

Из таблицы 1 видно, что результаты исследования методом секвенирования совпали с результатами, полученными с использованием предложенного способа. Сравнение результатов генотипирования методом ПЦР – ПДРФ с данными секвенирования продемонстрировало высокий уровень совпадения результатов как для гетерозиготных, так и для гомозиготных образцов (10 из 10 образцов).

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ферментом Rsa I продуктов амплификации образцов ДНК с генотипами: 1 – АА; 3 – AG; 4 – GG; 2 – Маркер молекулярных весов (pBluescript ll KS(+), гидролизованный MspI).

Из чертежа видно, что предложенный способ позволяет различать как гомозиготные, так и гетерозиготные по гену Мх1 варианты генотипов кур.

В таблице 2 представлено распределение генотипов в исследованных линиях, кроссах птиц.

Из таблицы 2 видно, что дефектные формы гена Мх1 (генотип AG и GG) достаточно широко распространены в различных популяциях домашних кур. Например, кросс «gibra PN» и линия породы «Hubbard Isa white» f-15 гомогенны и несут генотип GG. Кросс «highsex white» несушка, линия породы АВ, кросс «highsex white» – также гомогенен и несет генотип АА. Кроссы «Hubbard Isa brawn», «Hubbard Isa JV», линия породы «Hubbard Isa white» М-99 гетерогенны и несут различные аллельные варианты Мх1 гена. Кросс «gibra PN» и «Hubbard Isa white» линия f-15 гомогенны, несут непротективный генотип GG и являются менее предпочтительными, как наименее устойчивые к вирусным инфекциям. Для кросса «Hubbard Isa JV» распределение генотипов соответствует закону Харди-Вайнберга, что говорит о том, что для получения данного кросса использовались две гомогенные линии.

Таким образом, заявляемый способ позволяет быстро, точно и надежно выявлять генетическую предрасположенность кур к вирусным инфекциям, а также контролировать распространенность дефектных форм гена Мх1, содержащих функционально значимую аминокислотную замену Ser631Asn.

Формула изобретения

1. Способ выявления генетической предрасположенности кур к вирусным инфекциям, включающий отбор проб, выделение нуклеиновой кислоты и генотипирование полиморфизма в гене Mx1, приводящего к замене Ser631Asn в гене Mx1 кур, отличающийся тем, что генотипирование полиморфизма в гене Mx1 осуществляют с помощью ПЦР с использованием двух праймеров: прямого 5′-AATCTGATTGCTCAGGCGTGTA-3′ мутагенного и обратного 5′-CCTTGGGTTTAGTTCACTGAAGA-3′ с последующим расщеплением амплицированного фрагмента рестриктазой Rsa I и детекцией продуктов рестрикции, и при выявлении фрагмента ДНК размером 76 н.п. судят о генетической предрасположенности кур к вирусным инфекциям.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что продукты рестрикции анализируют с помощью электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

РИСУНКИ