Патент на изобретение №2352633

(54) ШТАММ ТУЛЯРЕМИЙНОГО БАКТЕРИОФАГА ГАЛ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации возбудителя туляремии, выделяемого из организма больного и инфицированных объектов внешней среды. Штамм туляремийного бактериофага ГАЛ предназначен для идентификации основных подвидов Francisella tularensis и лизирует возбудителей туляремии трех подвидов (среднеазиатский, неарктический и голарктический) и основных видов болезни легионеров, а также для лабораторной диагностики туляремии. Штамм выделен из органов лабораторных животных, инфицированных живой культурой туляремийного вакцинного штамма 15 линии НИИЭГ. Штамм бактериофага депонирован в коллекции фагов ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» под обозначением ГАЛ. Использование бактериофага позволяет повысить специфичность идентификации возбудителя туляремии от других возбудителей. 2 ил.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к средствам лабораторной диагностики туляремии, и может быть использовано в научных и практических лабораториях, занимающихся индикацией и идентификацией туляремийных бактерий, выделяемых из организма больного и инфицированных объектов внешней среды.

Известны многие бактериофаги, используемые для идентификации и фаготипирования бактерий различного систематического положения (Медицинская микробиология. / Гл. ред. В.И.Покровский, O.K.Поздеев. – М.: ГЭОТАР, Медицина, 1999). Общими по отношению к заявляемым фагам являются этапы их получения, состоящие в выделении и накоплении фаговых частиц, проверки специфичности свойств и использования в целях лабораторной диагностики. Однако известные бактериофаги не могут быть использованы для идентификации и фаготипирования Francisella tularensis в связи с высокой специфичностью механизмов взаимодействия бактерий и паразитирующих в них вирусов. По этой причине они не способны адсорбироваться на поверхности клеток Francisella tularensis, репродуцироваться в них и вызывать их лизис.

О существовании феномена бактерофагии у туляремийного микроба известно из данных, приведенных в литературе (Н.Г.Олсуфьев Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. – М., Медицина, 1975. – С.115-116). Там же отмечено, что обнаруженный литический агент относится к умеренным фагам, однако выделить бактериофаг не удалось.

Штаммы специфических туляремийных бактериофагов в патентной литературе не описаны.

Задачей изобретения является получение специфического штамма туляремийного бактериофага, предназначенного для идентификации основных подвидов Francisella tularensis и лабораторной диагностики туляремии.

Решение задачи достигается путем выделения бактериофага из органов лабораторных животных, инфицированных живой культурой туляремийного вакцинного штамма 15 линии НИИЭГ.

С целью выделения однородной популяции фага проведена селекция негативных колоний. Чистая линия фага ГАЛ была получена путем десятикратного пассирования отдельных негативных колоний на штамме 15 линии НИИЭГ Francisella tularensis.

Штамм бактериофага ГАЛ хранится в коллекции фагов ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г.Киров) и характеризуется следующими морфологическими и физиологическими свойствами.

Фаг ГАЛ относится к первой морфологической группе вирусов бактерий по А.С.Тихоненко (1968 г.). Бактериофаг представляет собой корпускулы нитевидной формы толщиной 20±4 нм и длиной до 400 нм.

Негативные колонии формируются на двухслойном FT-агаре, приготовленном по методу Грациа, с типовой индикаторной культурой Francisella tularensis штамма 501. Через 36-72 часов инкубации при температуре 36-38°С образуются мутные колонии, а также – с прозрачным центром и зоной неполного лизиса по периферии, диаметр которых не превышает 1-2 мм. Мутные негативные колонии имеют следы роста индикаторной культуры. Нанесение фаговой суспензии на газон индикаторной культуры по методу Отто вызывает через 36-72 часа термостатирования при температуре 36-38°С образование зоны специфического лизиса в виде «стерильного» пятна или четко контурируемого мутного пятна, или группы мелких негативных пятен.

Адсорбция фага индикаторными бактериями в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса, разведенного дистиллированной водой до содержания аминного азота 145-155 мг%·дм^-3 и с добавлением NaCl – 0,5 г; Na₂HPO₄·12H₂O – 1,0 г; KCl – 0,2 г; дрожжевого экстракта – 0,25 г;, L-цистеина – 0,4 г; остальное – дистиллированная вода, составляет не менее 90 процентов, латентный период – 4 часа, урожайность – 10-12 корпускул на инфицированную клетку.

При посевной дозе n·10⁶ микробных клеток 1-суточной агаровой культуры в 1 см³ указанной среды и множественности инфекции 0,01-0,001 в течение 24-36 часов инкубирования при температуре 36-38°С накапливаются до n·10⁴ БОЕ·см^-3.

Фаг термолабилен. Инактивация начинается при температуре 50°С, а полное разрушение происходит после инкубации при температуре 55°С в течение 30 минут.

Антигенные свойства

При иммунизации кроликов суспензией фага с адъювантом Фрейнда образуются специфические антитела. Полученная антисыворотка нейтрализует фаг с константой нейтрализации 51. Бактериофаг туляремийный ГАЛ относится к ДНК-содержащим фагам.

Специфичность

Бактериофаг лизирует бактерии возбудителей туляремии трех подвидов (среднеазиатский, неарктический и голарктический) и основных видов болезни легионеров (Legionella pneumophila, Legionella, micdadei, Legionella dumoffii и Legionella bozemanii). Фаг ГАЛ не оказывает литического действия на близкородственный вид Francisella novicida, а также на Pasteurella multocida, Yersinia pestis (5 штаммов), Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, Brucella abortus, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli (4 штамма), Salmonella choleraesuis, Streptococcus faecium, equi, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris и Proteus mirabilis, Shigella son-nei и Shigella flexneri, Serratia marcescens, Pseudomonas aeroginosa, Burkcholderia mallei, Burkcholderia pseudomallei, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii.

На фиг 1 показаны частицы туляремийного бактериофага ГАЛ. Контрастирование уранилацетатом X 30000.

На фиг.2 показана адсорбция частиц бактериофага ГАЛ на поверхности Francisella tularensis. Контрастирование уранилацетатом X 30000.

Пример. Фаг ГАЛ репродуцируется на клетках Francisella tularensis штамма 501 в среде на основе ферментативного гидролизата мяса с содержанием аминного азота 145-155 мг%·дм^-3 и с добавлением NaCl – 0,5 г; Na₂HPO₄·12H₂O – 1,0 г; KCl – 0,2 г; дрожжевого экстракта – 0,25 г; L-цистеина – 0,4 г; остальное – дистиллированная вода.

При посевной дозе 2·10⁶ клеток возбудителя туляремии на 1 см³ среды и множественности инфекции 0,01-0,001 при инкубации в течение 24-36 часов при температуре 36-38°С накапливается до n·10⁴ фаговых частиц на 1 см³.

Для получения препарата фага ГАЛ 24-часовую культуру туляремийного микроба штамма 501, выращенную на FT-агаре, вносят в жидкую питательную среду до конечной концентрации 5·10⁶ клеток на 1 см³, добавляют фаг ГАЛ (множественность инфекции 0,01-0,001). Через 24 часа инкубации при температуре 36-38°С к фаголизату добавляют хлороформ по объему (1/35 часть хлороформа по объему), выдерживают 1,5-2 часа при комнатной температуре (18-22°С) и 12 часов в холодильнике (2-8°С). Затем фаголизат фильтруют через стерильные фильтры с размером пор 0,2 мкм. Полученный фильтрат разливают по ампулам и контролируют на специфическую, общую стерильность и активность.

Фаг ГАЛ, подобно типовым фагам других видов, используют для фаготипирования основных подвидов возбудителя туляремии в дифференцирующем рабочем титре (ДРТ).

ДРТ фага определяется следующим образом: 48-часовую туляремийного микроба штамма 501, выращенную на FT-агаре, в объеме 0,1 см³ с концентрацией 1,0 млрд бактериальных клеток по отраслевому стандарту мутности ГКИ, вносят в 10 пробирок с 4,5 см³ расплавленного и остуженного до 47°С 0,7% FT-агара (рН 6,95). Затем в пробирки последовательно добавляют в объеме 0,1 см³ десятикратные разведения фага ГАЛ. Содержимое пробирок перемешивают и выливают на поверхность агаровых пластинок (1,5% FT-агар, рН 6,95). После застывания второго слоя посевы инкубируют при 36-38°С в течение 2-4 суток. За ДРТ принимают то разведение, в котором фаг ГАЛ образует не менее 10 негативных колоний.

Изучение чувствительности исследуемых культур к фагу ГАЛ проводится так же, как и определение дифференцирующего рабочего титра.

Формула изобретения

Штамм туляремийного бактериофага ГАЛ-КСМ 17-4 (Коллекция стандартизированных микроорганизмов для проверки эффективности средств разведки, профилактики и защиты от возбудителей инфекционных заболеваний ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России»), обладающий специфической литической активностью в отношении культур штаммов Francisella tularensis и возбудителей основных видов болезни легионеров.

РИСУНКИ