Патент на изобретение №2163141

(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РОЗ БЕНГАЛ ПРОБЫ (РБП)

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве препаратов для диагностики бруцеллеза. Способ включает получение посевного материала и производственное культивирование штамма Brucella abortus 19 в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, NaCl, дрожжевой аутолизат и воду. Культивирование проводят в глубинных условиях в течение 19 – 21 ч с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования. После внесения посевного материала с 1 по 6 ч культивирования устанавливают уровень 20 – 25 рО2, с 6 по 16 – 18 ч культивирования – 40 – 45 рО2 и затем с 16 – 18 по 19 – 21 ч – 30 – 35 рО2. Выросшие бактериальные клетки отделяют и концентрируют ультрафильтрацией на волокнах с пределом задержания 15 – 50 кД. Инактивируют нагреванием. Окрашивают роз-бенгалом, ресуспендируют в буферном разбавителе и стандартизируют целевой продукт. Изобретение позволяет упростить технологию и значительно сократить время получения бруцеллезного цветного антигена для РБР, а также повысить качество.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве антигена для диагностики бруцеллеза.

Известен способ промышленного получения бруцеллезного антигена для реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК) путем получения посевного материала штамма Brucella abortus 19 на плотной питательной среде, глубинного производственного культивирования в биореакторах в течение 24 ч в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, NaCl, дрожжевой экстракт и воду с дальнейшей очисткой и концентрированием культуры на ультрафильтрационных колонках, отмывкой и ресуспендированием микробных клеток 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором (RU 2085212 C, опубл. 27.07.97).

Однако используемая питательная среда и режимы глубинного культивирования не являются оптимальными для активного накопления бруцелл – концентрация микробных клеток на конец культивирования (24 ч) составляет 35 – 45 млрд. м.к./см³, операция получения посевного материала на плотной питательной среде трудоемка, а концентрирование проводится в два приема, что усложняет производство.

Наиболее близким аналогом по решаемой задаче является способ получения бруцеллезного цветного антигена для роз бенгал пробы (РБП), заключающийся в том, что чистую культуру штамма Brucella abortus 19 выращивают в течение трех суток в четвертях на плотной питательной среде – печеночно-мартеновском агаре с добавлением перевара Хоттингера. Выросшую культуру бруцелл смывают стерильным 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором и инактивируют в водяной бане при 80^oC в течение 1 ч. Суспензию инактивированных клеток окрашивают 1%-ным водным раствором краски бенгальской розовой и ресуспендируют в буферном разбавителе, включающем едкий натр, фенолизированный физиологический раствор и молочную кислоту (“Ветеринарные препараты”. Справочник, под ред. Д.Ф.Осидзе, М., Колос, 1981, с. 185 -188).

Однако известный способ изготовления не технологичен: культивирование ведется на дорогостоящей, сложной в изготовлении плотной питательной среде; время культивирования составляет 72 ч; требует использования большого количества стеклянной посуды; площадей и оборудования; не исключает опасности возможного контакта персонала с возбудителем бруцелл. Кроме того, по существующей технологии в антиген могут попадать белки питательной среды, что сказывается на появлении неспецифических реакций при постановке РА.

Задачей изобретения является разработка промышленной технологии получения бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы с более высокими качественными характеристиками.

Технический результат изобретения заключается в упрощении способа на всех стадиях технологического процесса: получения посевного материала, производственного культивирования, очистки и концентрирования, инактивации, окрашивания, снижения производственных потерь, себестоимости антигена, контакта персонала с возбудителем бруцеллеза, а также повышении специфичности, чувствительности и стандартности получаемого диагностикума.

Сущность изобретения заключается в следующем: при изготовлении бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы получают посевной материал штамма Brucella abortus 19 и осуществляют производственное культивирование в жидкой питательной среде следующего состава (об.%):
Перевар Хоттингера – 20 – 25
Глицерин – 1 – 2
Глюкоза – 1 – 1,5
NaCl – 0,5
Дрожжевой аутолизат нативный с сухим остатком 15-17% – 3,0-3,5
Вода водопроводная – до 100,
культивирование проводят в глубинных условиях в течение 19-21 ч с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования: после внесения посевного материала с 1 по 6 ч культивирования устанавливают уровень 20 – 25 pO2, с 6 по 16-18 ч – 40-45 pO2 и затем с 16-18 по 19-21 ч – 30-35 pO2, выросшие бактериальные клетки отделяют и концентрируют ультрафильтрацией на волокнах с пределом задержания 15-50 кД, инактивируют нагреванием, окрашивают роз-бенгалом, ресуспендируют в буферном разбавителе и стандартизируют целевой продукт.

Усовершенствование производственной питательной среды, используемой при изготовлении единого бруцеллезного антигена, и режимов глубинного культивирования обеспечивает увеличение накопления микробных клеток до 55-65 млрд. м. к. /см³ и сокращает время культивирования до 19-21 ч. Полученная культура бруцелл обладает наиболее полноценными антигенными свойствами, что приводит к получению биологически активного и специфичного диагностикума. Применение для ультрафильтрации волокон с пределом задержания 15-50 кД обеспечивает эффективное концентрирование бактериальной суспензии в одну стадию и исключает операцию отмывки микробных клеток от остатков питательной среды.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют оптимизированную питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи (об.%): перевар Хоттингера – 25, глицерин – 2, глюкоза – 1,5, NaCl – 0,5, дрожжевой аутолизат нативный – 3,4, водопроводная вода до 100,0.

В готовой питательной среде содержание аминного азота составляет 150-160 мг %, pH среды 6,8-7,1. Среду стерилизуют фильтрацией через пластины типа СФ.

Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus 19 засевают в микроферментер с оптимизированной питательной средой и культивируют 24-26 ч до накопления 35-45 млрд. м.к./см³. Бактериальную суспензию сливают в стерильные бутыли и хранят в холодильнике до 5 недель.

Производственное культивирование проводят глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. Засев осуществляют полученной бактериальной суспензией с концентрацией 1,5 млрд. м.к./см³. При культивировании концентрацию водородных ионов (pH) поддерживают в пределах 6,8-7,1. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода с 1 по 6 ч культивирования составляет 20-25 pO2; с 6 по 18 ч – 40-45 рO2 и с 18 по 21 ч – 30-35 рO2. По окончании культивирования бактериальную суспензию Brucella abortus шт. 19 с концентрацией 65 млрд. м.к./см² концентрируют в 10-11 раз ультрафильтрацией на волокнах ВЛУ-15-50 ПА с пределом задержания 15-50 кД. К концентрату в биореакторе добавляют 1% фенолизированный физиологический раствор и ресуспендируют до концентрации 180 – 220 млрд. м. к. /см². Инактивацию бактериальной суспензии проводят в биореакторе при температуре 80^oC в течение 60 мин при постоянном перемешивании.

После охлаждения бактериальной суспензии берут пробу и определяют необходимое количество краски бенгальской розовой. Объем краски закачивают в биореактор, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре до следующего дня.

Окрашенную суспензию бруцелл из биореактора подают на центрифугу ОТР 101 К, отделяют бакмассу от краски, фенолизированного физиологического раствора и остатков питательной среды и ресуспендируют ее буферным разбавителем при перемешивании в течение 1 часа.

Полученный антиген стандартизируют по активности с национальной агглютинирующей бруцеллезной сывороткой, содержащей в 1 мл 1000 международных единиц (ME) антител. Разводят буферным разбавителем до концентрации 90-95 млрд. м.к./см³ и расфасовывают.

Пример 2. Антиген изготовляют аналогично примеру 1, но для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют оптимизированную питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи (об.%): перевар Хоттингера – 20, глицерин – 1, глюкоза – 1,0, NaCl – 0,5, дрожжевой аутолизат нативный – 3,0, водопроводная вода до 100,0.

При производственном культивировании засев осуществляют бактериальной суспензией с концентрацией 3 млрд. м.к./см³. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода с 1 по 6 ч культивирования поддерживают в режиме 20 – 25 рO2; с 6 по 16 ч – 40-45 рO2 и с 16 по 19 ч – 30-35 рO2. По окончании культивирования получают бактериальную суспензию Brucella abortus шт. 19 с концентрацией 55 млрд. м.к./см³. Далее технологический процесс проводят аналогично примеру 1.

Пример 3. Активность и специфичность полученного по примерам 1 и 2 антигена устанавливают при его титровании в РА с национальной бруцеллезной агглютинирующей сывороткой против Brucella abortus, содержащей в 1 мл 1000 ME антител в сравнении с известным антигеном для РБП, содержащем 115 млрд. м.к. /см³.

Предлагаемый антиген, содержащий меньшее количество клеток (90-95 млрд. м. к. /см³) дает реакцию интенсивностью в 4 креста с сывороткой в разведении 1: 10, содержащей 50 ME, 1,5-2 креста с сывороткой в разведении 1:20 (35 ME) и отрицательную реакцию с сывороткой в разведении 1:35 (28,5 ME), что свидетельствует о ее более высокой активности по сравнению с известным диагностикумома

Формула изобретения

Способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы, включающий приготовление посевного материала штамма Brucella abortus 19, его производственное культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток, их инактивирование нагреванием, окрашивание роз-бенгалом с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацией целевого продукта, отличающийся тем, что для приготовления посевного материала и производственного культивирования используют жидкую питательную среду следующего состава об.%:
Перевар Хоттингера – 20 – 25
Глицерин – 1 – 2
Глюкоза – 1 – 1,5
NaCl – 0,5
Дрожжевой аутолизат нативный с сухим остатком 15 – 17% – 3,0 – 3,5
Вода водопроводная – До 100
культивирование проводят в глубинных условиях в течение 19 – 21 ч с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования: после внесения посевного материала с 1 по 6 ч культивирования устанавливают уровень 20 – 25 рО2, с 6 по 16 – 18 ч – 40 – 45 рО2 и затем с 16 – 18 по 19 – 21 ч – 30 – 35 рО2, а отделение и концентрирование проводят ультрафильтрацией на волокнах с пределом задержания 15 – 50 кД.