Патент на изобретение №2352357

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УНИВЕРСАЛЬНОГО ИНАКТИВИРОВАННОГО АНТИГЕНА ВИРУСА БЛЮТАНГА ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает заражение перевиваемой культуры клеток, культивирование инфицированной культуры, осаждение клеток и клеточного детрита центрифугированием, приготовление лизата клеток, замораживание-оттаивание. При этом лизат клеток обрабатывают 2 раза ультразвуком по 12 мкм в течение 1 мин с интервалом 1 мин. Оставшиеся после центрифугирования осадки дебриса повторно заливают дистиллированной водой, обрабатывают ультразвуком в том же режиме. Надосадочные жидкости, содержащие антиген, объединяют. Затем антиген дважды инактивируют -пропиолактоном в соотношении 1:1000, при этом сначала при 37° при постоянном перемешивании, затем снова вносят -пропиолактон в том же соотношении при экспозиции 18 часов и температуре +4°С. Полученный инактивированный антиген блютанга обладает высокой специфичностью и активностью (табл.) и может быть использован для серодиагностики в реакциях РСК, РДП и ИФА. 1 табл.

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к серодиагностике блютанга. По определению МЭБ, вирус блютанга отнесен к особо опасным болезням животных списка А. Согласно классификации Государственного Комитета по эпидемиологическому надзору, возбудитель блютанга относится ко 2-й группе патогенности для человека.

В XX столетии блютанг нанес овцеводству многих стран мира огромный экономический ущерб, больше, чем все другие инфекционные заболевания овец вместе взятые. Особенно проблема блютанга стала актуальной для России после эпизоотии болезни в Республике Бурятия в 1993 году. Учитывая, что в последние годы в странах, имеющих тесные экономические контакты с Россией (Турция, Болгария, Югославия, Голландия и др.) отмечали обширные эпизоотии, вызванные вирусом блютанга, одним из наиболее достоверных способов прижизненного выявления этого возбудителя является серодиагностика, основывающаяся на определении наличия специфических антител в сыворотках крови при их взаимодействии с антигеном вируса блютанга в реакциях связывания комплемента (РСК), реакции диффузионной приципитации (РДП) и при постановке иммуноферментного анализа (ИФА).

Ранее для постановки РСК антиген готовили из ткани мозга хомячков и мышей (Clark D. and Casals J.,1958, B.H.Сюрин, 1966 г.). Впоследствии был разработан способ получения культурального антигена (А.А.Стрижаков, 1997 г.). Культуру клеток ПСГК заражали вирусом блютанга и культивировали в течение 60-62 ч. Затем культуральную жидкость сливали, а инфицированные клетки дважды замораживали-оттаивали, центрифугировали при 3000 об/мин 30 мин и надосадочную жидкость использовали в качестве антигена.

Главным недостатком такого антигена является то, что он содержит инфекционный вирус и использовать его можно только при получении разрешения на работу с микроорганизмами 2 группы патогенности и требует наличия специальных средств защиты, оборудования и соблюдения особой осторожности.

Поэтому целью изобретения является получение инактивированного универсального антигена для серодиагностики, не уступающего по антигенной активности и пригодного к использованию в любых диагностических лабораториях.

Указанная цель достигается тем, что способ получения универсального инактивированного антигена вируса блютанга включает заражение перевиваемой культуры клеток, культивирование инфицированной культуры, осаждение клеток и клеточного дебриса центрифугированием, приготовление лизата клеток, замораживание-оттаивание, при этом лизат клеток обрабатывают 2 раза ультразвуком по 12 мкм в течение 1 мин с интервалом 1 мин, а оставшиеся после центрифугирования осадок дебриса повторно заливают дистиллированной водой, обрабатывают ультразвуком в том же режиме, надосадочные жидкости с антигеном объединяют, затем антиген дважды инактивируют -пропиолактоном в соотношении 1:1000, при этом сначала при 37° при постоянном перемешивании, затем снова вносят -пропиолактон в том же соотношении при экспозиции 18 часов +4°С.

Предлагаемый способ приготовления антигена отличается тем, что:

1) для большей деструкции клеток используют ультразвуковую обработку, позволяющую увеличить выход вирусного антигена, связанного с дебрисом клеток;

2) повторная обработка клеточного дебриса, оставшегося в осадке после центрифугирования, позволяет увеличить в 2 раза выход получаемого антигена при использовании того же количества вирусного сырья;

3) применение инактиванта -пропиолактона позволяет получить инактивированный экологически безопасный антиген, который может широко использоваться в ветеринарной практике для серодиагностики блютанга.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Суспензионную культуру клеток ПСГК-60 в количестве 10 л с концентрацией клеток 0,7-1,0 млн кл/мл заражали вирусом блютанга с множественностью заражения 0, 01 ТЦД₅₀/кл. Поддерживающая среда – 0,25% ФГМ с 2% сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Вирус культивировали при 37°С, поддерживая рН среды в пределах 7,0-7,4 в течение 40-60 часов до появления в суспензии 30% мертвых клеток. После этого клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 30 мин и готовили лизат инфицированных клеток. С этой целью к осадку добавляли дистиллированную воду до 100 мл, ресуспендировали и замораживали при минус 20°С. После оттаивания обрабатывали ультразвуком 2 раза по 12 мкм в течение 1 минуты с интервалом 1 мин и снова суспензию с клеточным дебрисом замораживали и оттаивали, затем центрифугировали при 4000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую антиген блютанга, отбирали, а к осадку добавляли такое же количество дистиллированной воды, ресуспедировали его и с ним проводили те же операции. Полученный вторичный осветленный лизат объединяли с первым и инактивировали -пропиолактоном. С этой целью к 200 мл объединенного надосадка лизированных клеток, содержащего антиген вируса блютанга, прогретого до 37°С, вносили 0,2 мл -пропиолактона и выдерживали при этой температуре 2 ч при постоянном перемешивании. Затем снова вносили -пропиолактон в том же количестве и выдерживали 18 часов при +4°С. Полноту инактивации антигена проверяли в 3-х последовательных пассажах в чувствительной культуре клеток ПСГК. Полученный антиген не содержал остаточной инфекционности, обладал высокой специфичностью и активностью в реакциях РСК (1:32-1:64), РДП (1:2-1:4), ИФА (1:729-1:2187, табл.).

Пример 2. Суспензионную культуру клеток ВНК-21/13 в количестве 12 л с концентрацией клеток 0,7-1,0 млн кл/мл заражали вирусом блютанга с множественностью заражения 0, 001 ТЦД₅₀/кл. Поддерживающая среда – 0,25% ФГМ с 2% сыворотки КРС. Вирус культивировали в биореакторе емкостью 30 л при 37°С, поддерживая рН среды в пределах 7,0-7,4 в течение 45-55 часов до появления в суспензии 40% мертвых клеток. После чего клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 30 мин и готовили лизат инфицированных клеток. С этой целью к осадку добавляли дистиллированную воду до 120 мл, ресуспендировали и замораживали при минус 20°С. После оттаивания обрабатывали ультразвуком 2 раза по 12 мкм в течение 1 минуты с интервалом 1 мин и снова суспензию с клеточным дебрисом замораживали и оттаивали, затем центрифугировали при 4000 об/ мин 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую антиген блютанга, отбирали, а к осадку добавляли такое же количество дистиллированной воды, ресуспедировали его и с ним проводили те же операции. Полученный вторичный осветленный лизат объединяли с первым и инактивировали -пропиолактоном. С этой целью к 240 мл объединенного надосадка лизированных клеток, содержащего антиген вируса блютанга, прогретого до 37°С, вносили 0,24 мл р-пропиолактона и выдерживали при этой температуре 2 ч при постоянном перемешивании. Затем снова вносили -пропиолактон в том же количестве и выдерживали 18 часов при +4°С. Полноту инактивации антигена проверяли в 3-х последовательных пассажах в элективной культуре клеток ПСГК. Полученный антиген не содержал остаточной инфекционности, обладал высокой специфичностью и активностью в реакциях РСК (1:64-1:128), РДП (1:2-1:4), ИФА (1:2187-1:6561, табл.).

Пример 3. Монослойную культуру клеток CV-1, выращенную в круговом монослое в 20 культуральных сосудах емкостью 3 л, объем заполнения 0,5 л заражали вирусом блютанга с множественностью заражения 0,004 ТЦД₅₀/кл. Поддерживающая среда – Игла (MEM) с 2% КРС. Вирус культивировали при 37°С и 8-12 об/час, поддерживая рН среды в пределах 7,0-7,4 в течение 60 часов до развития 30-35% ЦПД вируса. Затем культуральную среду сливали, монослой клеток замораживали с последующим оттаиванием и после этого из всех бутылей собирали лизат с разрушенными инфицированными клетками. Затем добавляли дистиллированную воду до 100 мл, ресуспендировали и обрабатывали ультразвуком 2 раза по 12 мкм в течение 1 минуты с интервалом 1 мин и снова суспензию с клеточным дебрисом замораживали и оттаивали, затем центрифугировали при 4000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую антиген блютанга, отбирали, а к осадку добавляли такое же количество дистиллированной воды, ресуспендировали его и с ним проводили те же операции. Полученный вторичный осветленный лизат объединяли с первым и инактивировали -пропиолактоном. С этой целью к 200 мл объединенного надосадка лизированных клеток, содержащего антиген вируса блютанга, прогретого до 37°С, вносили 0,2 мл -пропиолактона и выдерживали при этой температуре 2 ч при постоянном перемешивании. Затем снова вносили -пропиолактон в том же количестве и выдерживали 18 ч при +4°С. Полноту инактивации антигена проверяли в 3-х последовательных пассажах в элективной культуре клеток ПСГК. Полученный антиген не содержал остаточной инфекционности, обладал высокой специфичностью и активностью в реакциях РСК (1:64-1:128), РДП (1:2-1:4), ИФА (1:2187-1:6561, табл.).

Таблица
Биологическая активность культурального инактивированного антигена
п/п	Культура клеток	Полнота инактивации в 3 пассаже в культуре клеток	Активность антигена в реакциях
РДП	РСК	ИФА
1	ПСГК-60	-*	1:2-1:4	1:32-1:64	1:729-1:2187
	ВНК-21	–	1:2-1:4	1:64-1:128	1:2187-1:6561
	CV-1	–	1:2-1:4	1:64-1:128	1:2187-1:6561
Примечание: *- – инфекционность не выявлена

Формула изобретения

Способ получения универсального инактивированного антигена вируса блютанга, включающий заражение перевиваемой культуры клеток, культивирование инфицированной культуры, осаждение клеток и клеточного дебриса центрифугированием, приготовление лизата клеток, замораживание-оттаивание, отличающийся тем, что лизат клеток обрабатывают 2 раза ультразвуком по 12 мкм в течение 1 мин с интервалом 1 мин, а оставшиеся после центрифугирования осадки дебриса повторно заливают дистиллированной водой, обрабатывают ультразвуком в том же режиме, надосадочные жидкости, содержащие антиген, объединяют, затем антиген дважды инактивируют -пропиолактоном в соотношении 1:1000, при этом сначала при 37° при постоянном перемешивании, затем снова вносят -пропиолактон в том же соотношении при экспозиции 18 ч и температуре +4°С.