Патент на изобретение №2352355

(54) АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ МИКОЗОВ КРОЛИКОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Вакцина содержит растворимый антиген из штамма гриба Mucor racemosus 195 в виде эндотоксина его клеточной стенки и цитоплазмы. Дополнительно вакцина содержит растворимый антиген из штамма гриба Candida albicans 253 в виде его клеточной стенки и цитоплазмы со сроком культивирования 28-36 часов и концентрацией клеток гриба 3·10⁸-4·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды. При этом вакцина содержит эндотоксин клеточной стенки и цитоплазму гриба Mucor racemosus 195 со сроком культивирования 48-56 часов и концентрацией клеток гриба 7·10⁶-13·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды при следующем соотношении компонентов (мас.%): антиген из штамма гриба Mucor racemosus 195 в виде эндотоксина его клеточной стенки и цитоплазмы с концентрацией клеток гриба 7·10⁶-13·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды – 55-65, антиген из штамма гриба Candida albicans 253 в виде клеточной стенки и цитоплазмы с концентрацией клеток гриба 3·10⁸-4·10⁸ в 1 см дистиллированной воды 35-45. Вакцина эффективна одновременно в отношении кандидоза и мукороза, иммуногена, не аллергена. 2 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для получения вакцин против висцеральных микозов кроликов, в частности одновременно против кандидоза и мукороза.

Кандидоз (кандидамикоз, молочница) – инфекционное заболевание сельскохозяйственных животных, преимущественно молодняка 2-месячного возраста, вызываемое патогенными грибами из рода Candida, характеризующееся поражением слизистых оболочек (преимущественно пищеварительного тракта) в виде появления на них рыхлых или уплотненных наложений. Поражения локализуются у телят и ягнят в ротовой полости, пищеводе, преджелудках, у поросят – в желудке, кишечнике и реже в других органах. Болеют также птицы всех видов и человек.

Мукороз (мукоромикоз, фикомикоз) – инфекционное заболевание сельскохозяйственных животных, характеризующееся развитием гранулематозного процесса в мезентериальных и подчелюстных лимфатических узлах, а также в печени, почках, легких. У молодняка заболевание протекает с образованием язв, инфарктов и инфильтратов в слизистых оболочках желудка и кишечника. Болеет и человек.

Известна вакцина против дерматомикозов (дерматофитозов) (см. а.с. СССР 1734762, опуб. 23.05.92 г.), содержащая инактивированные микроконидии вирулентных грибов T.mentagrophytes, M.canis и М.mentagrophytes в соотношении 600 млн – 1 млрд в 1 см³ (1:1:1) – 25-26%, 0,5-0,6% раствор формалина – 25-26%, 0,8-0,9% раствор нуклеината натрия – 48-50%. Вакцину вводят внутримышечно двукратно с интервалом 10-14 дней в дозе 0,9-1,2 см³.

Однако данная вакцина предназначена для профилактики только дерматомикозов (трихофитии и микроспории). Кроме того, вакцина имеет в своем составе иммуномодулятор – нуклеинат натрия, воздействие которого на иммунокомпетентные клетки может быть негативным.

Известна вакцина Поливак-ТМ для профилактики и лечения дерматофитозов животных (см. патент РФ 2020959, опуб. 15.10.94 г.), содержащая 8 различных штаммов возбудителей трихофитии и микроспории, с концентрацией микроконидий 40-120 млн/см³ и инактивированная тиомерсалом.

Однако вакцина создает иммунитет только к возбудителям дерматомикозов. Кроме того, инактиватор тиомерсал обладает токсическими свойствами для животных.

Наиболее близкой к заявляемой является вакцина против висцеральных микозов сельскохозяйственных животных (см. патент РФ 2270694 по кл. МПК А61К 39/00, опуб. 27.02.2006), содержащая антиген в виде комплекса цитоплазматической фракции и эндотоксина клеточной стенки штамма гриба Mucor racemosus 195 с активностью спор 5·10⁵-6·10⁵ в 1 см³.

Данная вакцина предназначена только для формирования противомукорозного иммунитета и не может быть использована для профилактики других висцеральных микозов.

Изобретение направлено на решение задачи создания эффективной вакцины с универсальным набором липидов, полипептидов и углеводов против висцеральных микозов, обладающей высокоиммуногенными свойствами и действующей одновременно в отношении нескольких грибковых заболеваний.

Для решения поставленной задачи вакцина против висцеральных микозов кроликов, содержащая растворимый антиген из штамма гриба Mucor racemosus 195 в виде эндотоксина его клеточной стенки и цитоплазмы, согласно изобретению, дополнительно содержит растворимый антиген из штамма гриба Candida albicans 253 в виде его клеточной стенки и цитоплазмы со сроком культивирования 28-36 часов и концентрацией клеток гриба 3·10⁸-4·10⁸ в 1 см дистиллированной воды, вакцина содержит эндотоксин клеточной стенки и цитоплазму гриба Mucor racemosus 195 со сроком культивирования 48-56 часов и концентрацией клеток гриба 7·10⁶-13·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Антиген из штамма гриба
Mucor racemosus 195 в виде
эндотоксина его клеточной стенки
и цитоплазмы с концентрацией клеток
гриба 7·106-13·106 в 1 см3
дистиллированной воды	55-65
Антиген из штамма гриба
Candida albicans 253 в виде
клеточной стенки и цитоплазмы
с концентрацией клеток
гриба 3·108-4·108 в 1 см3
дистиллированной воды	35-45

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано высокоэффективной ассоциированной вакцины против висцеральных микозов, обладающей необходимым и достаточным набором липидов, полипептидов и углеводов, которая была бы высокоиммуногенна одновременно в отношении кандидоза и мукороза кроликов.

Авторами эспериментально были подобраны два вида антигенов штаммов грибов С.albicans и М.racemosus, отличающихся по содержанию липидов, полипептидов и углеводов.

В основу подбора компонентов был взят принцип неразделимого взаимовыгодного влияния двух микроорганизмов друг на друга.

В частности, небольшое количество липидов у антигена С.albicans компенсируется количеством липидов антигена М.racemosus.

Значение дисахаридов преобладает также у антигена из штамма М.racemosus (практически в 100 раз). Полисахариды в достаточном количестве выявлены у С.albicans, в отличие от антигена М.racemosus, в котором они даже не обнаружены.

Количество полипептидов с молекулярной массой до 10 кД и содержание общего азота везде превалирует в 7-9 раз у антигена М.racemosus. И только количество полипептидов с молекулярной массой более 10 кД больше у антигена С.albicans (практически также в 7 раз).

Характеристика антигенов по липидному составу, составу углеводов и общему содержанию азота, а также полипептидному составу представлена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика антигенов грибов по липидному составу, составу углеводов, по полипептидному составу
п.п.	Наименование и состав компонентов	Антигены
М.racemosus 195	C.albicans 253
Содержание липидов, %
1.	Общее содержание липидов, %	2,05	0,22
Содержание углеводов, мг %
2.	Моносахариды	49,1	49,5
3.	Дисахариды	1379	14,0
4.	Полисахариды	н/о	76,0
Полипептидный состав, мг %
5.	Общий азот	28,8	3,7
6.	Полипептиды с М.м.>10 кД	12,4	86,4
7.	Полипептиды с М.м. 5,0-10 кД	7,1	1,1
8.	Полипептиды с М.м. 1,5-5,0 кД	21,4	2,5
9.	Полипептиды с М.м.<1,5 кД	128,5	17,1

Известны отдельно: вакцина против кандидоза (см. патент РФ 2217163 по кл. МПК А61К 39/00, опуб. 27.11.2003 г.) и вакцина против мукороза, которая является прототипом к данному изобретению. Однако в данных вакцинах присутствуют антигены, полученные после 6 суток культивирования (для C.albicans) и после 12 суток (для М.racemosus). Концентрация клеток гриба (активность спор) в данных антигенах различна: 4,5·10⁸-5,5·10⁸ в 1 см³ для C.albicans и 5·10⁶-6·10⁶ в 1 см³ для М.racemosus. При этом культивирование штамма гриба C.albicans производилось на твердой питательной среде (агаре с использованием солевого раствора Хенкса по патенту РФ 2111245), а гриба М.racemosus – на жидкой питательной среде (бульоне Хенкса).

В заявляемой вакцине культивирование клеток грибов (С.albicans и М.racemosus) проводилось на твердых питательных средах (агаре Сабуро). Существенным является и концентрация спор, полученная на ранней стадии культивирования, при которой вакцина будет обладать иммуногенностью.

Для антигена гриба C.albicans – это 3·10⁸-4·10⁸ в 1 см дистиллированной воды через 28-36 часов культивирования, а для М.racemosus – 7·10⁶-3·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды через 48-56 часов.

Экспериментальным путем подобраны соотношения компонентов – антигенов, а именно – только при соотношении антигенов: 35%-45% штамма гриба C.albicans и 55%-65% антигена штамма гриба М.racemosus достигается эффективность действия вакцины.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».

Штамм Candida albicans 253, предназначенный для изготовления вакцины, характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки. Овальные (2:1) или почти круглые клетки с хорошо заметными вакуолями с небольшими ядрами.

Культуральные признаки. На агаре Сабуро через 48 часов культивирования при температуре 28°С образуются выпуклые белые колонии с небольшим кремовым оттенком сметанообразной консистенции, с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями.

Ферментативная активность проявляется на полужидкой среде Гисса: с глюкозой – образованием кислоты и газа; с мальтозой – также кислоты и газа; с сахарозой – только кислоты; с лактозой активность не проявляется.

Активность штамма – начало спорообразования на 2 сутки культивирования.

Антигены штамма – комплекс специфических белков, полисахаридов и липидов.

Штамм M.racemosus 195, предназначенный для изготовления вакцины, характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Рост гриба после инкубирования при 37°С на пластинчатом агаре Сабуро появляется через 24 часа в виде беловатого пушистого налета. Через 72 часа формируется объемная пушистая колония с мощным, хорошо развитым мицелием сероватого цвета. В бульоне Сабуро к 3 суткам культивирования в пробирках отмечается поверхностный рост культуры в виде плотных «войлочных» дисков с развитым мицелием и с одновременным образованием ватоподобного осадка.

При микроскопировании (с фиксацией в 10% КОН или в 50% глицерине) гриб представлен несептированным мицелием, имеющим различную ширину (до 20 мкм) на протяжении нити, древовидно ветвящийся. Обнаруживается при увеличении микроскопа (х7). Спорангиеносцы прямолинейные, спорангии шаровидные, не имеющие апофизы.

Продукт, синтезируемый штаммом, – в основном комплекс белков, полисахаридов, пептидогликанов, обладающих антигенными свойствами

Штамм относится к III группе патогенности – условно патогенный.

Штамм Mucor racemosus 195 поддерживается методом периодических пересевов на искусственных питательных средах по признаку спорообразования и культурально-морфологическим свойствам. В работе со штаммом мутагены не использовались.

Пассажирования на животных не требуется.

Штамм Mucor racemosus 195 хранят на агаре Сабуро в течение не более 20-30 суток, с последующим пересевом вначале на бульон Сабуро, а затем на агар Сабуро. Оптимальный способ хранения штамма – в ампулах в лиофилизированном состоянии при температуре 4°С до 1 года.

Для получения антигенов штамма Candida albicans 253, представляющих собой цитоплазматическую фракцию гриба, и антигенов штамма Mucor racemosus 195, представляющих собой клеточные мембраны (эндотоксин и цитоплазматическую фракцию гриба), используют метод разрушения клеточных мембран микроорганизмов с помощью ультразвуковой дезинтеграции аппаратами типа У.Ф.А. – 11 (Польша), «Solana» (Erian industries) или малогабаритным лабораторным дезинтегратором (МЛ – 1) производства НПО «Биоприбор» АН СССР.

Освобождение от разрушенных и неразрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор» МФА – МА 3.

Отбор иммуногенной стадии антигенов проводят с использованием реакции агломерации лейкоцитов (РАЛ) по способу, описанному в патенте РФ 2176392, в соответствии с которым антигены смешивают с комплементом морской свинки, добавляют стабилизированную кровь кролика, смесь инкубируют, готовят мазки, подсчитывают фиксированное количество лейкоцитов и отмечают число агломерированных клеток белой крови. По величине индекса агломерации оценивают пригодность полученных антигенов для создания вакцины. Экспериментальным путем была подобрана величина индекса агломерации лейкоцитов, при которой антиген считается иммуногенным. Для антигена штамма Candida albicans 253 в виде цитоплазматической фракции величина индекса агломерации составляет 6-10%, а для антигенов штамма Mucor racemosus 195 – 6-15%.

К выявленным вышеописанным методом растворимым антигенам добавляют для обезвреживания и повышения иммуногенных свойств формалин 0,3-0,4%-ной концентрации.

Антиген из штамма Candida albicans 253 в виде клеточной стенки и цитоплазмы с концентрацией клеток гриба 3·10⁸-4·10⁸ в 1 см дистиллированной воды готовят следующим образом.

1. Штамм Candida albicans 253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 28°С в течение 3 суток. Количество спор должно составлять 6·10⁸-9·10⁸ спор в 1 см³ физиологического раствора.

2. Выросшую культуру смывают и засевают в бактериологические матрасы с питательным агаром, культивируют в течение 28-36 часов при 28°С.

3. Отбирают культуру с урожайностью спор 3·10⁸-4·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды.

4. Получают цитоплазматическую фракцию в виде клеточных стенок и цитоплазмы гриба методом разрушения клеточных мембран: воздействуют ультразвуковым дезинтегратором в течение 60 минут и получают фильтрат с помощью мембраны «Владипор» в виде растворимого белково-полисахаридного комплекса.

5. Производят оценку иммуногенной стадии полученного антигена методом агломерации лейкоцитов. Отбирают антиген из штамма Candida albicans 253, у которого индекс агломерации лейкоцитов составляет 6-10%.

Антиген из штамма Mucor racemosus 195 в виде эндотоксина его клеточной стенки и цитоплазмы с концентрацией клеток гриба 7·10⁶-13·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды готовят следующими образом.

1. Штамм Mucor racemosus 195 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 28°С в течение 3 суток.

2. Выросшую культуру смывают и засевают в бактериологические матрасы с питательным агаром, культивируют в течение 48-56 часов при 28°С.

3. Отбирают культуру с урожайностью спор 7·10⁶-13·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды.

4. Получают цитоплазматическую фракцию и эндотоксин полученной суспензии клеток методом разрушения клеточных мембран: воздействуют ультразвуковым дезинтегратором в течение 10 минут и получают фильтрат с помощью мембраны «Владипор» в виде растворимого белково-полисахаридного комплекса.

5. Производят оценку иммуногенной стадии полученного антигена методом агломерации лейкоцитов. Отбирают антиген из штамма Mucor racemosus 195, у которого индекс агломерации лейкоцитов составляет 6-15%.

Вакцину готовят следующим образом.

1. Берут антиген из штамма Candida albicans 253 в виде клеточной стенки и цитоплазмы с концентрацией клеток гриба 3·10⁸-4·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды.

2. Берут антиген из штамма Mucor racemosus 195 в виде эндотоксина его клеточной стенки и цитоплазмы с концентрацией клеток гриба 7·10⁶-13·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды.

3. Смешивают два антигена в соотношении: 35%-45% антигена Candida albicans и 55-65% антигена Mucor racemosus.

Процентное соотношение компонентов вакцины было подобрано экспериментальным путем.

4. Оценивают иммуногенность полученной вакцины по индексу агломерации лейкоцитов. Вакцину считают иммуногенной при индексе агломерации лейкоцитов 6-12%.

Для оценки эффективности действия вакцины формировали группы животных (кролики) по 6 голов в каждой.

Вакцину вводили внутримышечно в дозе 3 мл на голову дважды с интервалом 7-10 дней. Группе контрольных животных вводили физиологический раствор.

Через 14 дней после ревакцинации проводили заражение кроликов культурами, содержащими мицелий и споры грибов из штаммов Mucor racemosus 195 и Candida albicans 253, полученных после 3 суток культивирования на твердой питательной среде с содержанием спор:

– 6·10⁹ 1 см³ дистиллированной воды для Candida albicans 253;

– 2·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды для Mucor racemosus 195.

Заражение проводили внутривенно в краевую ушную вену в дозе 0,5 мл каждой культуры.

За животными вели наблюдения в течение 30 дней. Гибель животных контрольных групп составляла 100%.

Варианты использования различных концентраций компонентов вакцины и их влияние на эффективность представлены в таблице 2.

Пример 1.

Готовят вакцину со следующим содержанием компонентов:

– антиген из штамма Candida albicans 253 (с концентрацией спор 3·10⁸-4·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды через 28-36 часов культивирования) в количестве 40%,

– антиген из штамма Mucor racemosus (с концентрацией спор 7·10⁶-13·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды через 48-56 часов) в количестве 60%.

Вакцину вводили кроликам (6 голов) внутримышечно в дозе 3 мл на голову дважды с интервалом 7 дней. Группе контрольных животных вводили физиологический раствор.

Через 14 дней после ревакцинации проводили экспериментальное заражение животных путем введения культур грибов из штаммов Mucor racemosus 195 и Candida albicans 253 с содержанием спор: 6·10⁹ в 1 см³ дистиллированной воды для Candida albicans 253 и 2·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды для Mucor racemosus 195.

Другая группа кроликов в количестве 6 голов, которым вводили физиологический раствор, была контрольной.

Через 5 дней все животные контрольной группы погибли, а в опытной группе выжило 4 кролика. Эффективность составила 66,7%.

Вакцина с различным содержанием компонентов была приготовлена аналогично описанному в примере 1.

Таким образом, заявляемая вакцина эффективна, иммуногенна, не обладает аллергогенностью, действует одновременно в отношении кандидоза и мукороза.

Таблица 2. Эффективность действия ассоциированной вакцины
группы жив-х	Состав комплексной вакцины	Содержание компонентов %	Эффективность введения вакцины
Пало	Выжило
голов	%	голов	%
1.	– антиген на основе штамма Candida albicans 253; – антиген на основе штамма Mucor racemosus 195	50 50	4	66,7	2	33,3
2.	– антиген на основе штамма Candida albicans 253; – антиген на основе штамма Mucor racemosus 195	45 55	3	50,0	3	50,0
3.	– антиген на основе штамма Candida albicans 253; – антиген на основе штамма Mucor racemosus 195	40 60	2	33,3	4	66,7
4.	– антиген на основе штамма Candida albicans 253; – антиген на основе штамма Mucor racemosus 195	55 45	4	66,7	2	33,3
5.	– антиген на основе штамма Candida albicans 253; – антиген на основе штамма Mucor racemosus 195	35 65	3	50,0	3	50,0

Формула изобретения

Вакцина против висцеральных микозов кроликов, содержащая растворимый антиген из штамма гриба Mucor racemosus 195 в виде эндотоксина его клеточной стенки и цитоплазмы, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит растворимый антиген из штамма гриба Candida albicans 253 в виде его клеточной стенки и цитоплазмы со сроком культивирования 28-36 ч и концентрацией клеток гриба 3·10⁸-4·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды, при этом вакцина содержит эндотоксин клеточной стенки и цитоплазму гриба Mucor racemosus 195 со сроком культивирования 48-56 ч и концентрацией клеток гриба 7·10⁶-13·10⁶ в 1 см³ дистиллированной воды при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Антиген из штамма гриба
Mucor racemosus 195 в виде
эндотоксина его клеточной стенки
и цитоплазмы с концентрацией клеток
гриба 7·106-13·106 в 1 см3 дистиллированной воды	55-65
Антиген из штамма гриба
Candida albicans 253 в виде
клеточной стенки и цитоплазмы
с концентрацией клеток
гриба 3·108-4·108 в 1 см3
дистиллированной воды	35-45