Патент на изобретение №2352327

(54) СПОСОБ КОРРЕКЦИИ СУБКЛИНИЧЕСКОЙ ВАЗОПАТИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ ПОРОСЯТ С АНЕМИЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ заключается в том, что вводят ферроглюкин по 150 мг (2 мл) внутримышечно двукратно с интервалом 10 дней и фоспренил внутримышечно. Фоспренил вводят троекратно в разных шприцах в разные точки. Первый раз фоспренил вводят 0,06 мл/кг одновременно с ферроглюкином. Второй раз – в дозе 0,05 мл/кг через пять дней после первой инъекции ферроглюкина. Третий раз фоспренил вводят в дозе 0,04 мл/кг одновременно со второй инъекцией ферроглюкина и гамавитом, который вводят в дозе 0,010 мл/кг внутримышечно, один раз в день в течение шести дней, начиная с первой инъекции ферроглюкина. Способ позволяет избежать нарушений трофики тканей за счет сосудистых осложнений у новорожденных поросят с анемией, уменьшить у них падеж, оздоровить стадо, увеличить количество и качество получаемой мясной продукции и здоровое потомство. 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, а именно к гематологии и ангиологии.

Аналогов предлагаемого способа коррекции субклинической вазопатии у новорожденных поросят с анемией не существует.

В литературе имеются сведения о применении при анемии у поросят ферроглюкина (Внутренние незаразные болезни сельскохозяйственных животных. Под ред. В.М.Данилевского. М.: Агропромиздат, 1991. – 576 с.).

4. – с.13-15).

Однако никогда ранее лечебный комплекс, состоящий ферроглюкина, фоспренила и гамавита, не применялся у новорожденных поросят с анемией с целью коррекции у них субклинической вазопатии.

Целью изобретения является коррекция субклинической вазопатии у новорожденных поросят с анемией.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для коррекции субклинической вазопатии новорожденным поросятам с анемией в зависимости от степени начальных нарушений назначается ферроглюкин по 150 мг (2 мл) внутримышечно, двоекратно с интервалом 10 дней, фоспренил внутримышечно, троекратно в разных шприцах в разные точки, первый раз 0,06 мл/кг одновременно с препаратом железа, второй раз в дозе 0,05 мл/кг через пять дней после первой инъекции ферроглюкина, третий раз в дозе 0,04 мл/кг одновременно со второй инъекцией ферроглюкина и гамавит 0,010 мл/кг внутримышечно один раз в день, шесть дней, начиная с первой инъекции ферроглюкина.

Способ позволяет корректировать субклиническую вазопатию у новорожденных поросят с анемией к концу курса лечения. При соблюдении рекомендаций заявляемого способа возможно поддержание в последующем на нормальном уровне состояния функций сосудистой стенки, что позволит существенно оздоровить стадо, сократить падеж, увеличить привесы и получать от этих животных здоровое потомство.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Для диагностики субклинической вазопатии новорожденным поросятам проводится следующее обследование.

6. – с.17-20). В основе этого метода лежит вычисление степени торможения агрегации тромбоцитов в плазме, полученной из крови после временной венозной окклюзии.

На сосуд, из которого еще не производился забор крови, накладывается манжетка сфигмоманометра и создается давление на 10 мм рт.ст. выше систолического. Через 3 минуты производится взятие 9 мл крови в 1 мл 3,8% раствора цитрата натрия. Ее немедленно центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин для получения богатой тромбоцитами плазмы (БТП). Плазму отсасывают пипеткой и сразу же помещают в тающий лед, где хранят до начала исследований. Повторно пробу центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин для получения бестромбоцитной плазмы. После подсчета количества тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме, полученной до венозного застоя (подробно описано ниже), ее разводят бедной тромбоцитами плазмой (БеТП), взятой до (1 проба) и после (2 проба) венозного застоя, до концентрации 200000 тромбоцитов/мкл. Полученную смесь встряхивают и инкубируют 10 минут при 20-22°С. Затем проводят агрегацию тромбоцитов (AT) с коллагеном (разведение 1:2 основной суспензии) на стекле следующим способом (Шитикова А.С. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СПб.: 1999. С.49-52).

Кровь забирают с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин, для получения богатой тромбоцитами плазмы. Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, получая БеТП. БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (полученной до венозного застоя – 1-я проба или после него – 2-я проба) до 200·10⁹/л. Концентрация кровяных пластинок в исходной БТП подсчитывается в камере Горяева (в 50 больших квадратах). Объемы смешиваемых БТП и БеТП определяют по формуле:

,

V_БеТП – объем бедной тромбоцитами плазмы,

V_БТП – объем богатой тромбоцитами плазмы,

N – счетная концентрация тромбоцитов в исходной БТП (клеток/мкл).

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и другой пипеткой 0,02 мл р-ра индуктора коллагена в стандартной концентрации (разведение 1:2 основной суспензии). Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см.

Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Реакцию повторяют по 2-3 раза в 1-й и 2-й пробе, находя для каждой из них среднее арифметическое значение.

По степени торможения агрегации тромбоцитов после венозного застоя судят об антиагрегационной активности плазмы крови, обусловленной поступлением в кровоток простациклина из сосудистой стенки. Индекс антиагрегационной активности сосудистой стенки (ИААСС) при исследовании AT на стекле рассчитывали по формуле:

Нормальными значениями для коллагена можно считать ИААСС 1,45-1,50.

Определение антитромбогенных свойств сосудистой стенки, зависящих от продукции веществ, активирующих антитромбин III, оценивая его базальный уровнь до и после временной дозированной ишемии стенки вены, приведено ниже (Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М. 1999 – 214 с.).

Принцип метода основан на выявлении снижения активности (в отсутствие гепарина) в плазме антитромбина III (AT III), которую определяют по способности исследуемой плазмы инактивировать тромбин, для чего ее предварительно обрабатывают сорбентом гепарина, затем подвергают тепловой дефибринации и смешивают со стандартным количеством тромбина. После инкубации смеси в ней определяют остаточную коагуляционную активность тромбина. По уровню снижения активности тромбина в процентах от нормы оценивают активность AT III в исследуемой плазме.

Используются следующие реактивы. 1. Трис-HCl буфер 0,05 М, рН 7,4. 2. Раствор тромбина в буфере: 0,2 мл раствора должны свертывать 0,3 мл 0,4% раствора фибриногена за 15-16 с. Рабочий раствор тромбина готовят в пластиковой или силиконированной пробирке, хранят при комнатной температуре и используют в тесте в день исследования. 3. Сорбент гепарина Гепасорб-1 (фирма “Технология-Стандарт”). 4. Свежеприготовленный раствор фибриногена в концентрации 3,5-4,0 г/л, который применяют для тестирования остаточной активности тромбина. Допускается замена раствора фибриногена нормальной бедной тромбоцитами цитратной плазмой, разведенной буфером в 2 раза. 5. Свежая цитратная бедная тромбоцитами плазма, полученная от 6-8 здоровых поросят, или лиофилизированная фирменная, с известной активностью AT III, которую используют для построения калибровочного графика.

Материалом для исследования служит цитратная бедная тромбоцитами плазма.

Для приготовления сорбированной и дефибринированной плазмы в пробирке смешивают 10 мг сорбента гепарина с 1,0 мл исследуемой плазмы. Постоянно встряхивая пробирку, перемешивают ее содержимое при комнатной температуре в течение 8 мин, исключая образование пены и осадка на ее дне. После этого смесь центрифугируют в течение 2 мин при 1000-1500 об/мин. Плазму в надосадке переносят в чистую пробирку и дефибринируют на водяной бане при +56°С в течение 6 мин, после чего вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, снимают надосадочную часть и исследуют в течение первых 2 ч.

Ход определения. В пробирку вносят 0,4 мл рабочего раствора тромбина и прогревают его на водяной бане при +37°С в течение 2 мин. Затем добавляют 0,1 мл исследуемой адсорбированной и дефибринированной плазмы, включают секундомер. Через 2 мин (точно!) 0,2 мл смеси переносят в пробирку с 0,3 мл раствора фибриногена (или разведенной нормальной плазмы), предварительно подогретой до +37°С. Немедленно включают секундомер и регистрируют время свертывания.

По калибровочной кривой находят активность AT III в процентах.

Построение калибровочной кривой проводят следующим образом. Плазму здоровых людей подвергают дефибринированию, как указано выше. Затем из нее готовят разведения для построения калибровочной кривой в соответствии с таблицей.

С каждым из разведений определяют время свертывания по указанной выше методике. Все измерения проводят трижды, рассчитывают средний результат. При построении калибровочной кривой по логарифмической оси ординат откладывают время свертывания в секундах, по оси абсцисс – активность AT III в % в соответствии с указанными выше разведениями. Примерная калибровочная кривая приведена на чертеже.

Калибровочную кривую для одного типа и одной серии тромбина и буфера строят однократно. Периодически контролируют лишь активность рабочего раствора тромбина.

В норме без венозной окклюзии активность AT III составляет 85-115%. При взятии крови после временной венозной окклюзии, как описано в методе по оценке антиагрегационной активности сосудов, и определении в ней AT III возможно косвенно оценить уровень синтеза в стенке сосуда тканевых активаторов AT III. На фоне временной венозной окклюзии активность AT III повышается и находится в границах 120-143%. Рассчитывается индекс синтеза активаторов AT III в сосудах (ИСААС) путем деления величины активности AT III на фоне венозной окклюзии на величину AT III без нее. В норме он равен 1,20-1,40.

Активность синтеза тканевых активаторов плазминогена по времени лизиса эуглобулинового сгустка до- и после временной венозной окклюзии оценивали следующим образом.

Принцип метода заключается в осаждении эуглобулиновой фракции плазмы, при этом основные ингибиторы фибринолиза, в частности ₂-антиплазмином, остаются в надосадочной части и удаляются. Поэтому эуглобулиновый лизис отражает активность фибринолиза в условиях исключения ингибирующего действия антиплазминов. Его скорость отражает, в основном, количество плазминогена в плазме и степень его активации. Определяют время спонтанного лизиса сгустка, получаемого из эуглобулиновой фракции плазмы при добавлении к ней раствора хлорида кальция.

Используются следующие реактивы 1. 1% раствор уксусной кислоты. 2. 0,277% раствор хлорида кальция. 3. Буфер Михаэлиса или трис-НС буфер, 0.05М, рН 7,3-7,4.

Материалом для исследования служит цитратная бедная тромбоцитами плазма до и после временной венозной окклюзии.

Ход определения. Для получения эуглобулиновой фракции к 8,0 мл дистиллированной воды добавляют 0,15 мл 1% уксусной кислоты и 0,5 мл исследуемой плазмы. После 30-минутного охлаждения смеси в холодильнике при +2-8°С эуглобулины осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 7 мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку осушают опрокидыванием на фильтровальную бумагу. Осадок эуглобулинов разводят в 0,5 мл буфера и помещают на водяную баню (+37°С). Затем, не вынимая пробирку из бани, добавляют 0,5 мл раствора хлорида кальция, осторожно перемешивают покачиванием пробирки (не встряхивая!), включают секундомер и инкубируют на водяной бане при +37°С. Регистрируют время с момента добавления хлорида кальция до полного растворения сгустка.

Результат выражают в минутах. В норме время спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка составляет 175-230 мин. После временной венозной окклюзии время лизиса снижается, находясь в границах 126-170 мин. При делении величины длительности спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка до окклюзии на величину после рассчитан индекс фибринолитической активности сосудистой стенки (ИФАСС), в норме равный 1,35-1,45.

Для каждой лаборатории необходимо обследование группы здоровых новорожденных поросят, чтобы найти средние нормативные значения с расчетом S² по всем трем методикам для последующих расчетов.

По каждой методике у каждого больного поросенка для большей точности диагностики проводят тест 3-4 раза с вычислением среднеарифметических значений, которые используют в последующих расчетах и вычислении S².

Для определения весомости отдельных исследуемых параметров у сосудистых больных поросят и вычисления у них общего антитромботического потенциала сосудов применялся системный многофакторный анализ, позволяющий переводить многомерные количественные характеристики исследуемого процесса с несопоставимыми абсолютными значениями в сопоставимые относительные величины (Применение методов морфометрии и статистического анализа в морфологических исследованиях. Сост. М.В.Углова, Б.А.Углов, В.В.Архипов и др., Куйбышев, 1982. – 47 с.). Расчет производился по формулам:

– исследуемый параметр, – нормативный параметр, X_j – относительная разность.

Pi – весовой коэффициент (коэффициент влияния), а – постоянный множитель (в наших исследованиях а=0,1), _j – среднеквадратическое отклонение значения X_j в относительных единицах.

S_i² – дисперсия исследуемого параметра X_i, n_i – количество наблюдений при определении X_i, S₀² – дисперсия нормативного параметра Х₀, n₀ – количество наблюдений при определении Х₀.

X_{Bi ОАПС} – величина, интегрально характеризующая исследуемый процесс в заданный срок (в относительных единицах), является общим антитромботическим потенциалом сосудов (ОАПС).

Сочетанное применение описанных методов с последующей обработкой полученных значений ИААСС, ИСААС и ИФАСС системным многофакторным анализом с определением общего антитромботического потенциала сосудов (X_{Bi ОАПС}) – норма 0,180 и выше, позволяет выявлять у животных риск развития ослабления антитромботической активности сосудов (Х_{Bi ОАПС} от 0,179 до 0,060), что является по сути дела субклинической вазопатией и требует проведения соответствующих мероприятий, нормализующих функции стенки сосуда и не позволяющих развиться клинически проявляющейся тромбофиллии (Х_{Bi ОАПС} от 0,059 и ниже), требующей немедленного проведения серьезных лечебных мероприятий.

Субклиническая вазопатия может корректироваться лечебным комплексом из ферроглюкина по 150 мг (2 мл) внутримышечно, двоекратно с интервалом 10 дней, фоспренила внутримышечно, троекратно в разных шприцах в разные точки, первый раз 0,06 мл/кг одновременно с препаратом железа, второй раз в дозе 0,05 мл/кг через пять дней после первой инъекции ферроглюкина, третий раз в дозе 0,04 мл/кг одновременно со второй инъекцией ферроглюкина и гамавита 0,010 мл/кг внутримышечно один раз в день, шесть дней, начиная с первой инъекции ферроглюкина.

Внедрение данного способа коррекции субклинического ослабления антитромботической активности сосудов у новорожденных поросят с анемией в практику ветеринарных учреждений позволит решить ряд насущных биологических, ветеринарных и экономических проблем современного свиноводства. Эффективная коррекция у новорожденных поросят с анемией позволит оздоровить стадо, получать высокие привесы, а в последующем здоровое потомство.

Пример. У новорожденного поросенка 24 с анемией было выявлено нарушение эритропоэза с признаками снижения уровня содержания железа в его организме (сывороточное железо 12,9 мкмоль/л, сидероциты 1,1%, при количестве гемоглобина у него 85,2 г/л, эритроцитов – 4,06×10¹²/л.

Поросенок обследован в условиях свинарника по поводу клиники анемии. У поросенка была взята кровь и исследована троекратно по изложенной выше схеме с оценкой ИААСС, ИСААС и ИФАСС и вычислением общего антитромботического потенциала сосудов.

У поросенка были выявлены выраженные признаки угнетения антитромботической функции сосудистой стенки. ИААСС составлял – 1,45, ИСААС 1,22 и ИФАСС 1,37. Общий антитромботический потенциал сосудов у него составил Х_{Bi ОАПС}=0,122.

Поросенку было назначено лечение: ферроглюкин по 150 мг (2 мл) внутримышечно, двоекратно с интервалом 10 дней, фоспренил внутримышечно, троекратно в разных шприцах в разные точки, первый раз 0,06 мл/кг одновременно с препаратом железа, второй раз в дозе 0,05 мл/кг через пять дней после первой инъекции ферроглюкина, третий раз в дозе 0,04 мл/кг одновременно со второй инъекцией ферроглюкина и гамавит 0,010 мл/кг внутримышечно один раз в день, шесть дней, начиная с первой инъекции ферроглюкина.

После завершения лечения признаки анемии купировались – сывороточное железо 19,7 мкмоль/л, сидероциты 7,9%, при количестве гемоглобина у него 119,2 г/л, эритроцитов – 4,98×10¹²/л), ИААСС составлял – 1,49, ИСААС 1,35 и ИФАСС 1,39, отмечена нормализация значения общего антитромботического потенциала сосудов (X_{Bi ОАПС}=0,181). Дальнейшее наблюдение за данным поросенком не выявило в последующем нарушений параметров антитромботической активности сосудов.

Использование предлагаемого способа коррекции субклинической вазопатии в ветеринарии поможет избежать нарушений трофики тканей за счет сосудистых осложнений у новорожденных поросят с анемией, уменьшить у них падеж, оздоровить стадо, увеличить количество и качество получаемой мясной продукции и здоровое потомство.

Формула изобретения

Способ коррекции субклинической вазопатии у новорожденных поросят с анемией, отличающийся тем, что вводят ферроглюкин по 150 мг (2 мл) внутримышечно двукратно с интервалом 10 дней и фоспренил внутримышечно, троекратно в разных шприцах в разные точки, первый раз 0,06 мл/кг одновременно с ферроглюкином, второй раз в дозе 0,05 мл/кг через пять дней после первой инъекции ферроглюкина, а третий раз в дозе 0,04 мл/кг одновременно со второй инъекцией ферроглюкина, и дополнительно вводят гамавит в дозе 0,010 мл/кг внутримышечно один раз в день в течение шести дней, начиная с первой инъекции ферроглюкина.

РИСУНКИ