Патент на изобретение №2351649

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУР МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЛИПОАСПИРАТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении культур стволовых клеток для различных целей. Проводят выделение клеток-предшественников, дополнительную отмывку буфером с помощью двух последовательных центрифугирований, ферментативную обработку ткани коллагеназой, несколько последовательных отмывок центрифугированием, адгезию полученного клеточного материала на пластике и последующее культивирование от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5% до получения целевой клеточной культуры. Используют клетки от 1-го до 2-го пассажей. Определяют количество живых, некротических и апоптотических клеток и проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора моноклональных антител гематопоэтическим и эндотелиальным маркерам CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR, а также к маркерам, характерным для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментин. Изобретение позволяет получить мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при повышении их выхода с сохранением их фенотипа и высокой жизнеспособности. 2 ил., 11 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при получении культур стволовых клеток для различных целей.

С учетом возрастания области применения стволовых клеток перед цитологами достаточно остро стоит проблема получения в короткий временной период требуемого количества мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью, поскольку именно такие клетки необходимы для решения практических задач.

Стромальные костно-мозговые клетки-предшественники, называемые также мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), могут быть выделены из различных тканей. Они представляют собой малочисленную популяцию клеток, характеризующихся большим пролиферативным потенциалом, способных к самоподдержанию с сохранением недифференцированного состояния, а также обладающих возможностью дифференцироваться в различные клеточные типы под действием определенных стимулов. Способность МСК дифференцироваться, по крайней мере, в клетки тканей мезенхимального происхождения лежит в основе их репаративного потенциала.

До настоящего времени костный мозг рассматривался как главный источник стволовых клеток взрослого организма. Костный мозг содержит гемопоэтические стволовые клетки и их более коммитированные потомки, строму, а также так называемые мезенхимальные стромальные клетки или клетки-предшественники взрослого организма (МСК) (Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 1991 #9 Vol.5, p.641-650; Friedenstein AJ. Precursor cells of mechanocytes. Int. Rev. Cytol. 1976 #47, p.327-359).

Известен, например, способ выращивания человеческих мезенхимальных стволовых клеток, взятых из крови, в котором одним из условий является повышенное количество СО₂ (патент US 7060494 от 13.06.2006, класс 435/366, C12N 5/00).

Авторами данного изобретения была решена задача получения лМСК в условиях действия пониженного (до 5%) содержания кислорода на пролиферацию, жизнеспособность и экспрессию маркеров клеток-предшественников, выделенных из липоаспирата человека, при постоянном культивировании.

Техническим результатом является создание нового способа, расширяющего арсенал средств получения мезенхимальных стромальных клеток при повышении их выхода с сохранением их фенотипа и высокой жизнеспособности.

Поставленная задача решена с помощью способа получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата, включающего выделение клеток-предшественников путем измельчения ткани, обработки ее коллагеназой, нескольких последовательных центрифугирований и адгезии полученного клеточного осадка на пластике и последующее культивирование до получения целевой клеточной культуры, культивирование от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, при этом используют клетки от 1-го до 2-го пассажей, после чего определяют количество живых, некротических и апоптотических клеток и проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора моноклональных гематопоэтических и эндотелиальных антител CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR, CD9, CD54, CD71, CD90, CD 105, HLA-ABC, виментин, которые являются маркерами, характерными для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников.

В процессе проведенных исследований авторами было установлено, что на ранних этапах культивирования МСК, выделенных из липоаспирата, также как и из костного мозга, в условиях пониженного содержания кислорода (5% O₂) происходит значительная стимуляция пролиферации клеток-предшественников.

Кроме того, неожиданно авторами было обнаружено, что культивирование стромальных клеток-предшественников, выделенных из липоаспирата, от 4 до 10 суток при использовании 1-2 пассажей в условиях гипоксии не только ускоряет пролиферацию клеток, но и приводит к снижению гетерогенности культуры, уменьшению количества апоптотических и некротических клеток при повышении ее пролиферативной активности и жизнеспособности клеток и при сохранении фенотипа и дифференцировочного потенциала, т.е. по сути нами была решена проблема ускоренного получения культур лМСК с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью.

Способ осуществляют следующим образом.

Липоаспират получали после процедуры липосакции у пациентов, обратившихся в специализированную клинику. Материал до выделения хранили в холодильнике при 4°С.

Выделение лМСК из липоаспирата и получение первичной культуры проводили с помощью следующих средств.

Материалы:

Пробирки стерильные, 50 мл (Nunc, Дания)

Пипетки стерильные, 10 и 25 мл (Nunc, Дания)

Клеточный фильтр, стерильный, 100 нм (Nunc, Дания)

Чашки Петри, 60 и 90 мм, стерильные, (Nunc, Дания)

Флаконы культуральные, 25 см² и 75 см², (Nunc, Дания)

Пробирки нестерильные для проточного цитофлуориметра

Наконечники стерильные на 200-1000 мкл (Eppendorf, Германия)

Ростовая среда: DMEM с низким содержанием глюкозы, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл

Амфотерицин В 50 мкг/мл, L-глютамин 2 мМ, натрия бикарбонат 1 г/л

Сыворотка фетальная телячья (FBS) (Hyclone, США)

Трипсин-EDTA 0,25-0,04% (Gibco, UK)

D-PBS (Gibco, UK)

Коллагеназа IА (Sigma-Aldrich, США)

Полная среда: ростовая среда+10% FBS

Оборудование

Центрифуга Eppendorf 5804R

Ламинарный шкаф (Сампо, Россия)

Водяная баня (Elmi, Латвия)

Весы (Ohaus, Германия)

Электрическая пипетка

Пипетки автоматические, набор (Eppendorf, Германия)

Микроскоп инвертированный, фазово-контрастный (Leica, Германия)

Проточный цитофлуориметр BeckmanCoulter Epix XL (BeckmanCoulter, США)

CO₂-инкубатор (Sanyo, Япония)

Стандартные условия культивирования: 5% CO₂ + 95% воздуха, 37°С, 100% влажность.

В 50 мл пробирку помещали липоаспират (примерно 1/3 от объема пробирки) и долить до 50 мл D-PBS, аккуратно встряхивали 5 раз.

Центрифугировали 5 минут при 1500 оборотов в минуту, при 18°С. На дне пробирки находится осадок из эритроцитов, над осадком – слой буфера и затем липоаспират. Липоаспират сверху покрыт слоем жира из разрушенных адипоцитов.

Осторожно перенесли липоаспират в чистую стерильную пробирку (50 мл) и повторно отмыли ткань при следующих условиях – 10 минут, 1000 об/мин, 18°С.

Осторожно перенесли липоаспират в предварительно взвешенную стерильную пробирку (50 мл), взвесили и добавили раствор коллагеназы IA. Приготовили 0,15% раствор коллагеназы.

В пробирку с предварительно взвешенным липоаспиратом добавили раствор фермента до конечной концентрации 0,075%.

Инкубировали на водяной бане при 37°С, 30 минут, периодически встряхивали – 1 раз в 5 минут.

Инактивировали коллагеназу IA добавлением полной среды до 50 мл.

Центрифугировали 5 минут, 1500 об/мин, 18°С.

Супернатант слили и осадок ресуспендировали в 10 мл полной среды, довести до 50 мл ростовой средой

Центрифугировали 5 минут, 1500 об/мин, 18°С.

Супернатант слили и осадок ресуспендировали в 10 мл полной среды.

Клеточный фильтр поместили на 50 мл пробирку и суспензию клеток и остатков ткани пропустили через него. В пробирку добавили ростовую среду до 50 мл.

Центрифугировали 10 минут, 1000 об/мин, 18°С.

Супернатант слили, осадок ресуспендировали в 10 мл ростовой среды.

Отобрали аликвоту среды с клетками и подсчитали количество ядросодержащих клеток в гемацитометре.

Развели клеточную суспензию из расчета, чтобы плотность посадки составляла 2×105-300×105 см².

Посадили клетки в культуральные флаконы, оставили в СО₂-инкубаторе на 24 часа.

Отобрали надосадочную жидкость с неприкрепившимися клетками и 2 раза промыть D-PBS.

Добавили нужное количество полной среды.

Меняли среду через 2 дня на 3.

Контролировали рост клеток под микроскопом.

Пассировали клетки при достижении 70-80% конфлуентности.

Моделирование гипоксии in vitro проводили следующим образом. Часть клеток сразу после выделения помещали в мультигазовый инкубатор Sanyo (Япония), где поддерживалась концентрация кислорода 5%. Культура клеток постоянно находилась в условиях пониженного содержания кислорода, и период нормоксии составлял не более 30 минут при замене среды.

После чего была изучена пролиферативная активность лМСК, выделенных из липоаспирата человека.

Для анализа пролиферации клеток в культуре использовали метод видеомикроскопии. С помощью микроскопа Leica DM IL (Leica, Германия), снабженного цветной видеокамерой, изображение передавалось на компьютер и впоследствии анализировалось. Оцифровка лМСК, культивируемых в газовой среде при стандартном (21% O₂) и пониженном (5% O₂) содержании кислорода, проводили через каждые 24 часа, начиная с первого дня после посадки и до момента следующего пассирования и используя объектив ×10. На дно каждого флакона снаружи были нанесены маркерные точки, для того чтобы проводить фотографирование одних и тех же полей зрения на разных сроках культивирования. В каждом флаконе фотографировали по 10 стационарных полей зрения, площадью 1,0 мм². На полученных изображениях клетки подсчитывали с помощью программы анализа изображения SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США).

Оценку эффективности прикрепления культивируемых клеток проводили следующим образом: при пассировании клеток плотность посадки составляла в среднем 3000 клеток на см². Эффективность прикрепления оценивали по количеству прикрепленных клеток на 1 см² через 24 часа после посадки.

Была проведена оценка жизнеспособности лМСК человека.

Жизнеспособность лМСК оценивали с помощью набора ANNEXIN V-FITC-PI (Immunotech, Франция) – по стандартной методике на проточном цитофлуориметре. Метод основан на одновременном использовании пропидия йодида (PI), проникающего в поврежденные клетки и взаимодействующего с ДНК, и аннексина V (Annexin V меченый FITC), аффинного к фосфатидилсерину, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфичных сигналов для распознавания апоптотических клеток. Использование пары AnnexinV-FITC – PI позволяет идентифицировать живые, некротические и апоптотические клетки.

Для анализа отбирали 2×105 клеток, ресуспендировали в фосфатном буфере и повторно центрифугировали при 1000 оборотов в минуту, в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в ледяном связывающем буфере, добавляли растворы Annexin V-FITC и PI, и инкубировали в течение 10 минут при t=+4°С, после чего объем пробы доводили до 500 мкл связывающим буфером и проводили анализ на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). Анализировали не менее 10000 событий.

Жизнеспособность клеток оценивали в конце пассажа в суспензии клеток, приготовленных для субкультивирования.

Анализ фенотипа культивируемых лМСК проведен следующим образом.

Для идентификации выделенных и культивируемых клеток, подтверждения статуса лМСК использовали набор моноклональных антител фирмы Beckman Coulter – гематопоэтические и эндотелиальные (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR) и также антитела к CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментину, которые являются маркерами, характерными для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников. В качестве изотипического контроля к антителам использовались FITC- и РЕ-меченые IgG соответствующего класса. Для анализа выбранных маркеров клетки после отбора среды культивирования промывали фосфатным буфером, снимали раствором трипсин-ЭДТА и ингибировали фермент избытком DMEM с 10% FBS. Полученную суспензию центрифугировали (1000 об/мин, 5 минут), после чего супернатант сливали, ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера с 1% FBS, после чего проводили подсчет клеток в гемацитометре и готовили пробы с концентрацией клеток не менее 105 в пробе. Клетки перемешивали и инкубировали с антиген-специфичными антителами или изотипического контроля в течение 20 минут при t=+4°C. После чего объем пробы доводили до 800 мкл фосфатным буфером и проводили фенотипирование на проточном цитофлуориметре EPIX XL (Beckman Coulter, США). При двойном окрашивании первичными антителами окрашивали по приведенной ранее схеме, затем отмывали от несвязавшейся метки (центрифугирование в избытке фосфатного буфера с 1% FBS, 1000 rpm, 5 минут), добавляли вторичные FITC- или РЕ-антитела и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, после чего доводили объем пробы до 800 мкл и проводили фенотипирование. Иммунофенотипирование проводили в нескольких повторах, для каждого маркера анализировали не менее 10000 клеток.

Таблицы 1-11 поясняют предлагаемое изобретение

Пример 1.

Выделение и культивирование лМСК

Вес липоаспирата – 49 г.

Время после липосакции – 72 часа.

Количество ядросодержащих клеток – 4,2х106.

Сразу после выделения все клетки были разделены на 2 части и помещены в условия нормоксии (95% воздуха, 5% СО₂, N-клетки) или гипоксии (5% О₂, 5% CO₂, 90% N₂, Нур-клетки).

Время до первой отмывки – 24 часа.

Первое пассирование – через 4 дня.

Количество пассажей – 2.

Пролиферативная активность лМСК.

Определение плотности посадки на 1 пассаже было затруднено в связи с тем, что при пересевании клеток из первичной культуры образуется большое количество клеточных агрегатов и трудно получить равномерное распределение клеток на подложке. Эффективность прикрепления на 2 пассаже составляла 80-90% от плотности посадки и практически не различалась в N- и Нур-клетках.

На втором пассаже проводили определение пролиферативной активности лМСК, как описано выше. На основании полученных данных были построены кривые пролиферации, характеризующие рост лМСК в течение всего пассажа.

В табл. 1 приведены данные по клеточному приросту за все время культивирования во 2 пассаже. Мы не обнаружили увеличения количества клеток, культивируемых в условиях нормоксии, в то время как в условиях гипоксии прирост количества клеток был весьма значительным (табл. 1).

Характер роста клеток в Нур-культурах описывался типичной кривой пролиферации: лаг-фаза в течение 48-72 часов, которая сменялась фазой роста (фиг.1).

Количество удвоений популяции Нур-клеток значительно превышало аналогичные показатели N-клеток, а время удвоения Нур-клеток было существенно меньше (табл.2).

Пример 2.

Вес липоаспирата – 77 г.

Время после липосакции – 20 часов.

Количество ядросодержащих клеток – 18,8×106.

Время до первой отмывки – 24 часа.

Первое пассирование – через 7 дней.

После трипсинизации клеток первичной культуры в суспензии образовывалось большое количество клеточных конгломератов, которые трудно поддавались ресуспендированию, в связи с этим плотность посева 1 пассажа была выше, чем при последующем субкультивировании. Эффективность прикрепления N- и Нур-клеток достоверно не отличалась и составляла около 70%.

В 1-3 день культивирования как в N-, так и Нур-культурах не обнаружено достоверного увеличения количества клеток. После 3 дней культивирования мы наблюдали увеличение количества клеток в обеих культурах, причем количество клеток в гипоксии было значительно больше, чем в нормоксии. Прирост N-клеток составил 540% за 8 дней культивирования, а Нур-клеток – 1290% за то же время (табл.3).

Характер кривой клеточной пролиферации был сходным в N- и Нур-культурах. Лаг-фаза наблюдалась в течение 72-96 часов, после чего начиналась фаза роста (фиг.2).

Оценка жизнеспособности лМСК, культивируемых в условиях гипоксии (5% O₂) и нормоксии (20% O₂), показала, что различия в содержании O₂ не влияют на жизнеспособность клеток, которая остается высокой (90+3%) вне зависимости от выбранной модели культивирования (табл.5).

Пример 3.

Вес липоаспирата – 30 г.

Время после липосакции – 24 часа.

Количество ядросодержащих клеток – 4,0×10⁶.

Время до первой отмывки – 24 часа.

Первое пассирование – через 7 дней.

Пролиферативную активность и жизнеспособность лМСК оценивали на 2 пассаже. Показано, что культивирование клеток в условиях гипоксии стимулировало их пролиферативную активность (табл.6). Количество клеточных удвоений в культуре, постоянно находившейся в условиях пониженного содержания кислорода, было в 2 раза выше, а время удвоения – в 2 раза меньше по сравнению с лМСК в стандартных условиях культивирования (табл.7).

Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5% Oz) не влияло на жизнеспособность лМСК и составляло 95±0,1% как в нормоксических, так и в гипоксических условиях (табл.8).

Приведенные результаты позволяют сделать вывод о том, что во всех исследованных культурах лМСК снижение содержания кислорода в среде приводило к увеличению пролиферативной активности. Время удвоения клеток в Нур-культурах было значительно ниже, а количество клеточных удвоений за то же время больше, чем в N-культурах во всех трех выделениях.

Кривая клеточной пролиферации как для N-, так и для Нур-клеток имела стандартный вид: лаг-фаза в течение 1-4 дней, которая сменялась фазой роста.

Жизнеспособность N- и Нур-клеток не отличалась в трех независимых сериях и составляла около 90%. Следует отметить, что пролиферативная активность культивируемых в стандартных условиях лМСК, выделенных из липоаспиратов различных доноров, варьирует в очень широких пределах.

Таким образом, культивируемые в газовой среде с пониженным содержанием кислорода (5% O₂) лМСК имеют более высокую пролиферативную активность по сравнению с лМСК, находящимися в стандартных условиях (95% воздуха + 5% СО₂). Характер роста N- и Нур-клеток не отличается и описывается стандартной кривой пролиферации. Различия в значениях клеточного прироста могут быть связаны с индивидуальными особенностями доноров лМСК. Изменение содержания кислорода в газовой среде не снижает жизнеспособность культивируемых клеток.

Результаты иммунофенотипирования в выделениях лМСК на втором пассаже приведены в табл. 9-11.

Во всех трех экспериментах, как в N-, так и в Нур-культурах не было обнаружено клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндотелия и гематопоэтических клеток-предшественников (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR). Наличие таких антигенов как CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, CD106, HLA-ABC, виментин свидетельствовало о том, что исследуемые клетки можно охарактеризовать как лМСК. Количество клеток, несущих исследуемые маркеры – CD9, CD54, CD71, CD105, CD106, HLA-ABC, виментин не отличалось в N- и в Нур-культурах во всех трех сериях исследований. Доля CD90-положительных клеток варьировала от 75 до 96%. Проведенный иммунофенотипический анализ позволил подтвердить, что клетки, выделенные согласно используемому протоколу, являются стромальными мезенхимальными клетками-предшественниками. Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода не влияет на экспрессию антигенов, характерных для МСК, и сохраняет их высокую жизнеспособность клеток в культуре и способность к направленной дифференцировке.

Таким образом, было показано, что культивирование клеток в условиях пониженного (5%) содержания кислорода не влияет на фенотип и жизнеспособность культивируемых клеток и оказывает стимулирующее действие на пролиферативную активность лМСК, что позволяет получить большую клеточную массу за тот же период культивирования по сравнению со стандартными условиями.

Формула изобретения

Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата, включающий выделение клеток-предшественников, дополнительную отмывку буфером с помощью двух последовательных центрифугирований, обработку ткани коллагеназой, несколько последовательных отмывок центрифугированием, адгезию полученного клеточного осадка на пластике и последующее культивирование до получения целевой клеточной культуры, отличающийся тем, что культивирование ведут от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, при этом используют клетки от 1-го до 2-го пассажей, после чего определяют количество живых, некротических и апоптотических клеток и проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора моноклональных гематопоэтических и эндотелиальных антител CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), а также к маркерам, характерным для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников: HLA-DR, CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментин.

РИСУНКИ