Патент на изобретение №2351647

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании тканей и клеток моллюсков и других беспозвоночных животных, для оптимизации процессов биокристаллизации in vitro, проведении диагностических исследований функциональной активности и процессов биокристаллизации арагонита с использованием тканей пресноводных моллюсков. Питательная среда содержит стандартную питательную среду DMEM/F-12, эмбриональную телячью сыворотку, стрептомицина сульфат, бензенициллина натриевую соль, гентамицина сульфат, канамицина сульфат, флуконазол. Изобретение позволяет увеличить сроки культивирования тканей и клеток моллюсков и сократить риск появления в культуре плесневых грибов.

Изобретение относится к биологии, в частности к клеточной биологии, и может быть использовано при культивировании тканей и клеток моллюсков и других беспозвоночных животных, для оптимизации процессов биокристаллизации in vitro, проведении диагностических исследований функциональной активности и процессов биокристаллизации арагонита с использованием тканей пресноводных моллюсков.

Известны различные стандартные питательные среды культивирования клеток млекопитающих и беспозвоночных животных [1]. Однако такие среды не обеспечивают длительное культивирование с отсутствием контаминации плесневыми грибами рода Aspergillus, Mucor и др. и процессы биокристаллизации, которые могут протекать при длительном культивировании тканей.

Известно использование стандартных питательных сред F-12 [3], L-15 [4, 5] для культивирования тканей пресноводных или морских моллюсков. Однако такие питательные среды не обеспечивают отсутствие плесневых грибов и полноценный процесс биокристаллизации арагонита in vitro, а предназначены для культивирования не контаминированных бактериями и грибами культур клеток или тканей в основном млекопитающих животных.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому составу питательной среды для культивирования клеток и тканей пресноводных моллюсков относится стандартная питательная среда DMEM/ F-12 [2].

Питательная среде DMEM/F-12 представляет собой смесь 1:1 питательной среды DMEM и F-12, рН 7.0-7.4, осмолярность 260-320 мосмоль/кг. Препарат – прозрачная жидкость, красновато-оранжевого цвета, без опалесценции и осадка. Не содержит антибиотиков. Стандартная питательная среда содержит солевой состав, приближающийся к составу естественной среды ткани при соответствующем рН, заменимые и незаменимые аминокислоты, витамины, производные нуклеиновых кислот, углеводы, жиры и их производные. Питательная среда содержит все ионы, обнаруженные в мантийных тканях моллюсков при наличии у них биологической активности. Среда DMEM/F-12 содержит феноловый красный, как индикатор концентрации гидроксильных ионов.

Применяемые в известной питательной среде растворы аминокислот заменимых – аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, глицин, пролин, серии, и незаменимых – аргинин, лейцин, цистин, изолейцин, изолейцин, метионин, тирозин, фенилаланин, лизин, гистидин, треонин, триптофан, валин.

Питательная среде DMEM/F-12 также может содержать эмбриональную телячью сыворотку.

Эмбриональная телячья сыворотка без консерванта, нативная, лишена форменных элементов крови. Представляет собой слегка опалесцирующую жидкость желтоватого цвета. Допускается осадок серо-белого цвета, который разбивается при встряхивании в равномерную муть. Является источником ростовых факторов, гормонов и других стимулирующих компонентов. Осмолярность 280-340 мосмоль/кг, рН 7.0 -7.5, альбумин 1.7-3.4 г/дцл, белки 3.0-4.5 г/дцл. Используется в конечной концентрации 10%. Инактивацию факторов комплемента проводят нагреванием при 56°С в течение 30 минут.

Питательная среде DMEM/F-12 также может содержать антибиотики – стрептомицина сульфат, бензпенициллина натриевая соль, канамицина сульфат, гентамицин сульфат.Стрептомицин и бензпенициллина натриевая соль являются антибиотиками широкого спектра антимикробного действия. Активность стрептомицина сульфата проявляется в отношении большинства грамотрицательных микроорганизмов. Активность бензпенициллина натриевой соли проявляется в отношении большинства грамположительных микроорганизмов.

Канамицина сульфат и гентамицин – бактерицидные антибиотики широкого спектра действия. Канамицина сульфат активен преимущественно к грамотрицательным организмам, устойчивым к другим антибиотикам. Гентамицина сульфат активен по отношению к грамотрицательным микроорганизмам, и устойчивость к нему развивается крайне медленно.

Общим недостатком известных питательных сред является то, что такие среды не обеспечивают длительное культивирование с отсутствием контаминации плесневыми грибами рода Aspergillus, Mucor и др. и процессы биокристаллизации, которые могут протекать при длительном культивировании тканей.

Задача изобретения – обеспечить удлинение сроков культивирования тканей и клеток моллюсков для нормального протекания процесса биокристаллизации в условиях отсутствия роста плесневых грибов.

Для решения поставленной задачи используют питательную среду для культивирования клеток и тканей пресноводных моллюсков, включающую стандартную питательную среду DMEM/F-12, содержащую эмбриональную телячью сыворотку 100 мл/л, антибиотики 1090 мг/л, при этом среда дополнительно содержит флуконазол в количестве 100-130 мг/л.

Флуконазол – 2-(2,4-дифторфенил)-1,3-бис(1,2,4-триазол-1-ил)-пропан-2-ол. Представитель нового класса триазольных противогрибковых средств является селективным ингибитором синтеза стеролов в клетке грибов. Препарат активен при микозах, вызванных Candida spp., Micosporum spp., Trichoptiton spp. и другими грибами (Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., 2001, стр 356).

На предлагаемой питательной среде сроки культивирования тканей и клеток моллюсков увеличиваются в 4 раза и более по сравнению со стандартными средами. В известных источниках патентной и научно-технической информации не описано питательных сред для длительного культивирования тканей пресноводных моллюсков с полной элиминацией образования и роста плесневых грибов.

Пример 1. Приготовление питательной среды

Процесс приготовления питательной среды заключается в дополнении к основной среде DMEM/F-12 эмбриональной телячьей сыворотки 100 мл/л, антибиотиков 1090 мг/л и раствора флуконазола в количествах, соответствующих изобретению.

Растворение компонентов питательной среды проводили в стерильных условиях, в ламинаре, при комнатной температуре. Порядок и приоритет добавления компонентов в питательную среду не существенен.

Эмбриональную телячью сыворотку, термически инактивированную, добавляли в питательную среду до 10% содержания. После механического перемешивания питательного раствора при покачивании бутыли добавляли растворы антибиотиков и флуконазол в необходимых концентрациях.

Состав питательной среды оптимального количественного соотношения компонентов представлен ниже, мг/л.

Стандартная питательная среда DMEM/F-12 содержит тотальное количество компонентов: неорганические соли 10066 мг/л, аминокислоты 1100 мг/л, витамины 33,6 мг/л и прочие компоненты, а именно (мг/л) неорганические соли:

CaCl2	116,6
Fe(NO3)*9H2O	0,05
FeSO4*7Н2О	0,417
MgCl2	28,64
MgSO4	48,84
KCl	311,8
NaHCO3	2438
NaCl	6995,5
Na2HPO4	71,02
NaH2PO4	54,35
ZnSO4*7H2O	0,432
CuSO4*5H2O	0,0012
Аминокислоты:
Глицин	18,75
Алании	4,45
Аргинин * HCl	147,5
Аспарагин * Н2О	7,5
Аспарагиновая кислота	6,65
Цистеин гидрохлорид * Н2О	17,56
Цистеин * HCl	22,24
Глютаминовая кислота	7,35
Глютамин	365
Гистидин гидрохлорид * Н2О	31,48
Изолейцин	54,47
Лейцин	59,05
Лизин гидрохлорид	91,25
Метионин	17,24
Фенилаланин	35,48
Пролин	17,25
Серин	26,25
Треонин	53,45
Триптофан	9,02
Тирозин 2Na * 2Н2О	55,79
Валин	52,85
Витамины:
Биотин	0,0035
Холин хлорид	8,98
D-пантотенат кальция	2,24
Фолиевая кислота	2,65
И-инозитол	12,6
Ниациамид	2,02
Пиридоксин гидрохлорид	2,031
Рибофлавид	0,219
Тиамин гидрохлорид	2,17
Витамин В12	0,68
Прочие:
D-глюкоза	3151
Гипоксантин натрия	2,04
Линолевая кислота	0,042
Липоевая кислота	0,105
Феноловый красный	8,1
Путресцин 2HCl	0,081
Пируват натрия	55
Тимидин	0,365
К стандартной питательной среде добавили антибиотики – 1090 мг/л, а именно:
Стрептомицина сульфат	500 мг/л
Бензенициллина, натриевая соль	500 мг/л
Гентамицин сульфат	40 мг/л
Канамицина сульфат	50 мг/л
10% эмбриональную телячью сыворотку и Флуконазол 120 мг/л.

Аналогично была приготовлена питательная среда с добавлением 100 мг/л и 130 мг/л Флуконазола.

Пример 2. Использование питательной среды для получения первичной культуры ткани мантии пресноводного моллюска.

После извлечения из раковины моллюска ткани мантии ее промывают и стерилизуют стандартным способом.

Образцы тканей мантии моллюска переносят в стерильные чашки Петри 6 см в диаметре для дальнейшего культивирования и добавляют по 3-5 мл стерильной, питательной среды, приготовленной по примеру 1.

В контрольную группу ткани мантии моллюска добавляли известную питательную среду по прототипу (без флуконазола). Культивирование ткани мантии проводят в 5% СО₂ при температуре 22-25°С. Уже в первые сутки после инициации культуры ткани мантии моллюска происходила миграция разных типов клеток: эпителиальных, клеток Лейдига, фибробластов. Цвет ткани мантии моллюска в норме светло-кремовый и при культивировании in vitro является показателем жизнеспособности. При отмирании ткани мантии приобретают темно-коричневый или серый цвета. Таким образом, экспланты ткани мантии в количестве 20 штук культивировали в течение 21 дня.

За время культивирования опытной группы не было отмечено ни бактериальная, ни особенно грибковая контаминации, в 8 образцах была обнаружена начальная стадия процесса биокристаллизации арагонита.

В отличие контрольная группа эксплантов ткани мантии моллюска в количестве 20 штук, за время культивирования в течение 3-8 дня была поражена плесневыми грибами в 14 из 20 вариантов эксплантов ткани мантии. В образцах не была обнаружена начальная стадия процесса биокристаллизации арагонита.

Затем использовали питательную среду для получения первичной культуры ткани мантии пресноводного моллюска при добавлении 100 мг/л и 130 мг/л флуконазола. Были плучены аналогичные результаты.

Таким образом, заявляемая питательная среда, используемая для культивирования тканей и клеток мантии пресноводного моллюска, позволяет значительно сократить риск появления в культуре плесневых грибов и тем самым увеличить продолжительность культивирования тканевых эксплантов, что является необходимым условием для процесса биокристаллизации арагонита in vitro при получении полиморфов карбоната кальция.

Технический результат достигнут введением в состав питательной среды оптимального количественного соотношения компонентов, представленных в формуле.

Источники информации

1. Методы культивирования клеток. Сборник научных трудов. Под ред. Пинаева Г.П. Ленинград. «Наука», 1988, с.44-62.

2. Bank S.K., Jena J.K., and Janaki Ram. СаСО₃ crystallization in primary culture of mantle epithelial cells of freshwater pearl mussel. Science, vol.86, NO.5, 2004, p.730-733.

3. Gardner D.В., Turner F.S., Myers J.M., Dietz T.H., and Silveiman H. Long-term culture of freshwater mussel gill strips: use of serotonin to affect aseptic condition. Biol. Bull., 1991, vol.181, p.-175-180.

4. Chen S.N., Wen C.M. Establishment of cell lines derived from oyster, Crassostrea gigas Thunberg and hard clam, Meretrix lusoria Roding. Methods Cell Sci. 1999; 21:183-192.

5. Endon M., Hasegawa Y. Culture of mantle epithelial cells expressing shell matrix proteins from scallop Patinopecten yessoensis. Fisheries Science 2006; 72, p.1277-1285.

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования клеток и тканей пресноводных моллюсков, включающая стандартную среду DMEM/F-12, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, стрептомицина сульфата 500 мг/л, бензенициллина натриевую соль 500 мг/л, гентамицина сульфата 40 мг/л, канамицина сульфата 50 мг/л и флуконазол в количестве 100-130 мг/л.