Патент на изобретение №2163022

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике туберкулеза, и касается способа диагностики туберкулеза. Сущность изобретения в диагностике туберкулеза посредством полимеразной цепной реакции (Н-ПЦР) с использованием внешних и внутренних праймеров с применением в качестве внешних праймеров: 5′ ggt ttg cgg tgg ggt gtc g 3′ и 5′ ggt gga tgc ctg cct cgg 3′, при этом амплификацию проводят в два этапа, с помощью электрофореза разделяют продукты амплификации и идентифицируют ДНК. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 2 табл.

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике туберкулеза.

Туберкулез в данное время является одним из основных инфекционных заболеваний человека. В течение последних лет отмечается рост заболевания и смертности от туберкулеза во всем мире.

Эпидемиологическая ситуация осложняется еще и тем, что в последнее время отмечается резкое увеличение частоты выявления микобактерий туберкулезного комплекса (МТБ), устойчивых к антибиотикам. В этих условиях для осуществления эффективного контроля над туберкулезной инфекцией возникает потребность в быстрых, чувствительных и специфических методах индикации возбудителя.

Одним из общепринятых методов выявления возбудителя считается бактериоскопический, когда окраска по Циль-Нильсену позволяет выявить 10000 кл/мл. Более результативной является люминесцентная микроскопия, позволяющая выявить кислотно-устойчивые микобактерии в концентрации на порядок меньше бактериоскопического метода. Традиционная микробиологическая диагностика туберкулеза с помощью посева на твердые среды дает визуальный результат через 6-10 недель при наличии в посадочном материале не менее 100 жизнеспособных клеток. Автоматизированная система для выделения микобактерий на жидких средах дает возможность получить результаты, начиная с 4-го дня после поступления диагностического материала, в 81% случаев. Автоматизированные системы BACTEC MGIT (Becton Dickenson) и MB/BacT (Organon Teknika) импортного производства и дорогостоящие.

В последние годы в практику фтизиомикробиологических лабораторий все больше внедряются молекулярно-биологические методы исследования (2), в частноcти полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая существенно снижает время детекции возбудителя и существенно повышает чувствительность анализа. Этот метод приобрел достаточно широкое распространение в диагностике инфекционных заболеваний.

В основе этого метода лежит многократная репликация (амплификация) cпецифического участка ДНК, осуществляемая термостабильной ДНК полимеразой в присутствии соответствующего буфера, дезоксинуклеотидтрифосфатов и олигонуклеотидных затравок-праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка и представляют собой олигонуклеотиды (6). Полимеразная цепная реакция состоит из трех стадий (денатурация, отжиг, синтез), каждая из которых происходит при определенных температурных режимах. На стадии денатурации, протекающей при 94-95^oC, происходит разделение цепей ДНК мишени. На стадии отжига, которую, как правило, проводят при 50-60^oC, происходит присоединение праймеров к комплиментарным участкам денатурированной ДНК мишени, обеспечивая таким образом затравку репликации ДНК. На стадии синтеза (при 72^oС) происходит синтез новых цепей ДНК путем ферментативного достраивания праймеров, связывающихся с ДНК матрицей. Циклическое воспроизведение этого процесса позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК мишени в количестве, достаточном для его обнаружения с помощью электрофореза. Однако в известной реакции из-за ряда факторов, связанных с особенностями анализируемого клинического материала, могут влиять на результаты определения. В этой связи стандартная техника постановки – одностадийной ПЦР не всегда обеспечивает чувствительность и надежность, необходимую при клинической диагностике. Кроме того, интерпретация результатов после одностадийной амплификации требует определенной подготовки сотрудника, поэтому применяют нестед-ПЦР (H-ПЦР) – полимеразную цепную реакцию с проведением амплификации в два этапа с использованием внешних и внутренних праймеров.

В известной реакции для выявления возбудителя подбираются определенные праймеры и отрабатываются условия амплификации для каждого из этапов. Предложенный способ отличается тем, что ДНК выделяют в TE-буфере с 1% тритоном, амплификацию проводят с использованием внутренних праймеров, представляющих собой: 5′ cgt gag ggc atc gag gtg gc 3′ и 5’gcg tag gcg tcg tgt aca aa 3′ и внешних праймеров, представляющих собой: 5’ggt ttg cgg tgg ggt gtc g 3′ и 5′ gtt gga tgc ctg cct cgg 3′ с использованием температуры отжига для первого цикла 60^oС, 20 циклов и температуры отжига для второго этапа 72^oС, 25 циклов в ТРИС-HCl буфера, с KCl, формамидом и твином и продукты амплификации разделяют электрофорезом с выявлением под ультрафиолетовой лампой ярко-оранжевой полоски ДНК образца на уровне ярко-оранжевой полоски – ДНК Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis.

Используемые в настоящей работе внешние праймеры исключают недостатки одноэтапной полимеразной цепной реакции. Одновременно, во избежание ложноположительных результатов, в связи с возможным присутствием в клинических пробах возбудителей других инфекций была проанализирована комплементарность праймеров к геномным последовательностям следующих микроорганизмов: Pseudomonas aeruqinosa, Staphylococcus aureus, Steptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes. Кроме того, была выяснена возможность неспецифического связывания праймеров с геномом Mycobacterium tuberculosis в целом. В предложенном способе диагностики туберкулеза Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis отработку условий амплификации проводят на музейных штаммах микобактерий и включает в себя: отработку времени денатурации при 95^o 30 секунд – 1 минута, температуру отжига праймеров 60^o, 63^o, 66^o, 69^o, 72^oC, концентрацию ионов Mg⁺⁺ от 0,8 до 2,5 мМ, время циклов каждой стадии амплификации от 1 минуты до 30 секунд и, наконец, количество циклов для каждой стадии от 20 до 35. Критерием правильности выбранного режима для каждого этапа проводимой реакции служит показательность результата – наличие или отсутствие фрагмента ДНК определенного размера на электрофореграмме. После подбора условий амплификации с внутренними праймерами для тех же составляющих реакции подбирают условия для работы с внешними праймерами. То есть для этого последовательно снижают температуру отжига праймеров для первого этапа амплификации (с первыми праймерами с 69^oC до 60^oC) и затем также последовательно повышали температуру отжига для второго этапа амплификации (для второй пары праймеров от 69^o до 72^oC). Понизить неспецифичность реакции удалось уменьшением количества циклов до 25 на втором этапе реакции.

Отработанные режимы амплификации представляли из себя следующее (см. табл.1).

В дальнейшем выявление микобактерий туберкулезного комплекса (2 этапа амплификации) мы проводили согласно предлагаемым режимам, результаты см. в табл.2.

Важным этапом в ПЦР-диагностике является подготовка образца. В качестве исходного материала для диагностики туберкулеза используют: мокроту, смывы, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), эксудат, спинно-мозговую жидкость (ликвор), кровь, плазму крови, мочу, биоптаты, кал применяют реже. Для каждого типа биологических образцов есть своя специфика обработки. Для мокроты, смыва, БАЛ первый этап включает обработку мокроты 0,5% ацетилцистеином с 20% NaOH. Следующий этап – этап выделения ДНК. Сущность способа выделения ДНК состоит в следующем. Осадок отмывают в TE-буфере и прогревают 10 мин в том же буфере с 1% тритоном при 95^oС. Таким образом, способ диагностики туберкулеза Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis, включающий применение полимеразной цепной реакции (H-ПЦР) с проведением амплификации в два этапа с использованием внешних и внутренних праймеров, отличающийся тем, что ДНК выделяют в TE-буфере с 1% тритоном, амплификацию проводят с использованием внешних праймеров, представляющих собой: 5′ ggt ttg cgg tgg ggt gtc g 3′ и 5′ gtt gga tgc ctg cct cgg 3′, с использованием температуры отжига для первого этапа 60^oС, 20 циклов и температуры отжига для второго этапа 72^oС, 25 циклов в ТРИС-HCl буфере, с KCl, формамидом и твином и продукты амплификации разделяют электрофорезом с выявлением под ультрафиолетовой лампой ярко-оранжевой полоски – ДНК образца на уровне ярко-оранжевой полоски – ДНК Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis.

Проверку специфичности проводили на музейных штаммах. Для этого использовали микобактерии: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. fortuitum, M. kansassi, terrae, M. mycroti, M. avium, M. gordonae. Кроме того, специфичность H-ПЦР оценивалась по выявлению следующих бактерий и вирусов, многие из которых являются частью нормальной или патогенной флоры дыхательных путей: Bacillus subtilis, Gemella haemolijsans, Streptococcus pneumoniae, Neisseria flava, Moraxella locunata, Klebsiella pneumoniae, Nesseria meningitias. Neisseria perflava, Branhamella cotarrhalis, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Micrococcus leuteus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Staphylococcus aureus, Bordetella bronchiseptica, Staphylococcus epidermidis, Haemophilus influenzae, Proteus vulgaris., Bordetella parapertussis, Chlamidia pneumoniae и др. Все изоляты исследовались в пределах 100 кл/в образце. Ни один из изолятов не показал реактивности в H-ПЦР.

В качестве примера своевременного выявления микобактерии приводим выписку из карты больного Матвиенко В.М.; 1945 года рождения, поступил в МНПЦ борьбы с туберкулезом в мае 1999 г. Предположительный диагноз: пневмония/туберкулез легких?
У больного из вены берут три мл крови (с 3,5% цитратом натрия), отбирают плазму и центрифугируют при 10000 об/мин, 10 мин осадок промывают TE буфером, pH 6,8 (уже готовый, хранится в холодильнике). Затем к осадку добавляют лизирующий буфер 1 мМ Трис HCl, 1 мМ ЭДТА, 1% тритон pH 8,0 (готовый, хранится в холодильнике) и прогревают при 95^oC 15 мин. Затем отбирают из пробирки 3 мкл образца и добавляют в амплификационную среду собранную за время центрифугирования образца. (Состав амплификационной среды: 10 мМ Трис HCl, pH 8,8, 50 мМ KCl, 5% формамид, 0,5% твин 20, 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкм праймеров, 1-2U Taq полимеразы и 4 мкл образца. В первую пробирку добавляют 4 мкл образца от больного, а в другую вместо образца взят тот же объем дистиллированной воды. Затем образцы ставят в амплификатор, где включена нужная программа (95^oС – 4 мин, 60^oС – 1 мин, 72^oС – 1 мин – это один цикл, 95^oС – 40 с, 60^oС – 1 мин – это 20 циклов и 72^oС – 10 мин. Через 1 час 20 мин образцы вынимают из амплификатора, отбирают из пробирок по 4 мкл и добавляют в новые пробирки с инкубационной средой (состав амплификационной среды тот же) как исследуемый образец, так и контрольный, и ставят в амплификатор с заданной программой для второго этапа амплификации (95^o – 4 мин, 72^o – 1 мин, один цикл, 95^o – 40 с, 72^o – 1 мин – это 25 циклов, 72^o – 10 мин – это один цикл. В это время расплавляют 1,5% агазору, приготовленную на ТБЕ буфере (0,045 М Трис HCl, 0,045 М борная кислота, 1 мМ ЭДТА с бромистым этидиумом (1 мг/мл) и заливают ее в электрофорезную камеру. После того как прошла 2-ая стадия амплификации (1 час 30 мин) в образцы добавляют 3 мкл краски (0,25% бромфеноловый синий, 40% глицерин, 0,5 М ЭТДА) и 30 мкл насыщенного хлороформа, встряхивают и 10 мкл каждого образца помещают в кармашки уже застывшего геля. Затем включают ток (напряжение должно составлять 25 Вт/см²). Через 25 мин гель вынимают из камеры и помещают под УФ-лампу. Если у больного есть возбудитель (Mycobacterium tuberculosis), то под УФ мы видим в определенном месте ярко-оранжевую полоску, контрольный образец (когда вместо образца была внесена вода) светиться не должен. Таким образом, через 5 часов у больного выявлена туберкулезная палочка и был поставлен диагноз – туберкулез.

Для характеристики чувствительности предлагаемой тест-системы было проведено сравнение выявляемости микобактрий туберкулезного комплекса H-ПЦР и ПЦР на Cobas Amplicor (фирма La Roche, Швейцария). Результаты представлены в табл.2.

Полученные результаты говорят о том, что предлагаемый способ диагностики туберкулеза прост в исполнении, дешевле импортных тест-систем и отличается повышенной чувствительностью.

Формула изобретения

Способ диагностики туберкулеза (Mycobactrium tuberculosis и Mycobactrium bovis), включающий применение полимеразной цепной реакции (Н-ПЦР) с проведением амплификации в два этапа с использованием внешних и внутренних праймеров, отличающийся тем, что ДНК выделяют в ТЕ-буфере с 1%-ным тритоном, амплификацию проводят с использованием внешних праймеров, представляющих собой 5′ ggt ttg cgg tgg ggt gtc g 3′ и 5′ ggt gga tgc ctg cct cgg 3′, с использованием температуры отжига для первого этапа 60^o, 20 циклов и температуры отжига для второго этапа 72^o, 25 циклов в ТРИС-НС1 буфере с КС1, формамидом и твином, и продукты амплификации разделяют электрофорезом с выявлением под ультрафиолетовой лампой ярко-оранжевой полоски – ДНК образца на уровне ярко-оранжевой полоски – ДНК Mycobactrium tuberculosis и Mycobactrium bovis.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 29.05.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 34-2002

Извещение опубликовано: 10.12.2002