Патент на изобретение №2163021

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской технологии и фармакологии, а именно к способам тестирования различных лечебных препаратов. Сущность изобретения состоит в том, что предложен способ определения антиокислительной активности водорастворимых антиоксидантов по параметру А = (А₀ – А₊)/А₀, где А₀ – максимальная амплитуда хемилюминесценции реакции Фентон Fe+2 + H₂O₂ без испытуемого вещества, А₊ – амплитуда хемилюминесценции той же реакции в присутствии испытуемого вещества. Для антиоксидантов А > 0,3. Чем параметр А больше, тем более выражены антиокислительные свойства. Технический результат заключается в повышении точности, ускорении и упрощении способа. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, к медицинской технологии и фармакологии, а именно к способам тестирования различных лечебных препаратов.

Природный трипептид глутатион, аминоксилоты метионин и цистеин предложены в качестве лечебных препаратов или компонентов ряда лекарственных рецептур: глазных капель, таблеток и инъекционных растворов [1]. В качестве основного механизма терапевтического действия этих соединений являются их антиокислительные эффекты [2]. Именно эти свойства являются основой для биологического тестирования синтезируемых или извлекаемых из натурального сырья как уже известных (глутатион, метионин и цистеин), так и новых ранее неизвестных антиоксидантов, возможных компонентов новых лекарств.

В качестве известного способа определения антиокислительной активности водорастворимых веществ разными авторами предлагались различные системы тестирования in vitro, в которых используются: окисляющий агент, например перекись водорода, ультрафиолетовый свет или OH-радикал [2] и само используемое вещество [3].

Наибольшим разрушительным действием при различной патологии обладает OH-радикал [2]. Одной из самых известных систем генерации OH-радикала, ставшей классической реакцией, является реакция Фентон: Fe⁺² + H₂O₂ —> OH-радикал [3] . Для оценки антиокислительных свойств различных веществ в большинстве случаев используют их свойство подавлять окисление OH-радикалом сыворотки крови млекопитающих. Суть его сводится к определению накопления в сыворотке крови млекопитающих, так называемых ТБК-активных продуктов, количество которых оценивают спектрофотометрически спустя несколько минут от внесения ионов двухвалетного железа в систему [3, 4]. Именно такой способ выбран нами в качестве прототипа изобретения. Однако описанный способ обладает целым рядом недостатков, основные из которых – малая точность способа, большой расход излучаемого вещества, длительность и сложность его осуществления.

Целями предлагаемого изобретения является увеличение точности способа, уменьшение расхода излучаемого вещества, ускорение и упрощение способа.

Цели достигаются тем, что излучается интенсивность хемилюминесценции реакции Фентон Fe⁺² + H₂O₂ без или в присутствии активаторов свечения, например люминола, при взаимодействии с различными излучаемыми препаратами.

Согласно современным взглядам на патогенез ряда заболеваний, при которых применяется глутатион, метионин и цистеин, в качестве основного поражающего агента может выступать OH-радикал [2]. Поэтому мы считаем, что изучение нейтрализующего действия различных веществ в отношении этого радикала может отражать их антиоксидантную активность.

Об антиокислительной активности можно судить по уменьшению хемилюминесценции реакции Фентон Fe⁺² + H₂O₂. Усилить свечение могут известные активаторы, например люминол.

Способ осуществляется следующим образом: излучаемое соединение растворяют в дистиллированной воде, непосредственно перед измерением вносят перекись водорода и люминол в конечных концентрациях 0,4 мМ и 10 мкМ соответственно. Реакцию Фентон запускают введением ионов 10 мкМ Fe⁺². Об антиокислительной активности вещества судят по параметру: A = (A₀ – A₊)/A₀, где A₀ – максимальная амплитуда хемилюминесценции реакции при отсутствии испытуемого вещества, A₊ – максимальная амплитуда свечения реакции в присутствии испытуемого вещества. Рассмотрим две ситуации:
1) A₀ = A₊, когда испытуемое вещество никак не влияет на интенсивность хемилюминесценции, что означает полное отсутствие у него антиоксидантных свойств. Тогда A = 0
2) A₊ = 0, когда испытуемое вещество полностью подавляет развитие свечения, что означает присутствие у него явного антиоксидантного действия. Тогда A = 1.

Для антиоксидантов A > 0,3. Чем параметр A больше, тем более выражены такие свойства. Максимальное значение A = 1 почти не достигается ни для одного сильного антиоксиданта. Напротив, для веществ с невыраженными антиоксидантными свойствами параметр A < 0,2, а для веществ без таких свойств почти достигает 0.

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Для исследования взят восстановленный глутатион фирмы “Sigma” (США). Для проведения тестирования взято около 20 мкг порошка вещества на 1 мл раствора перекиси водорода и люминола. Затем к полученному раствору добавили 1 мл раствора сульфата железа. Сразу после смешения измеряли максимальную амплитуду хемилюминесценции реакции (A₊ = 48 условных единиц). Затем определяли максимальную амплитуду свечения (A₀ = 100 условных единиц) той же реакции при отсутствии испытуемого вещества. Об антиокислительной эффективности восстановленного глутатиона судили по параметру A = (A₀ – A₊)/A₀, которая для глутатиона фирмы “Sigma” (США) составила 0,52 относительных единиц. Максимальную амплитуду сверхслабого свечения наблюдали на 3 – 7 секунде от введения ионов Fe⁺². Анализ занял около 1 минуты, состоял из двух операций.

Новый метод сравнения со способом-прототипом [3]. Для этого получали сыворотку крови крысы, на что уходило 50 минут, добавляли 0,2 мл ее к 10 мл дистиллированной воды. Затем 5 мг глутатиона, растворенного в дистиллированной воде, вносили в полученный раствор сыворотки. Такой раствор с добавленным глутатионом ставили на магнитную мешалку и активировали окисление сыворотки внесением в систему 1 мл 50 мМ раствора FeSO₄. Через каждые 20 минут отбирали по 0,8 мл и смешивали с таким же объемом 30% трихлоруксусной кислоты, спустя 20 минут от смешения каждую пробу центрифугировали в течение 20 минут при 10000 g, к полученному супернатанту добавляли 0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и кипятили полученный раствор в течение 60 минут. Количество ТБК-активных водорастворимых продуктов перекисного окисления оценивали по их флуоресценции в области 530 – 580 нм. Для возбуждения флуоресценции использовали свет с длиной 515 нм, ширина щели – 3 нм.

В качестве контроля использовали окисление той же сыворотки без добавления глутатиона. Об эффективности препарата судили по величине подавления им в описанной системе ТБК-активных продуктов перекисного окисления: ⁿ_i(F_i/F⁺_i)/n , где F_i – интенсивность флуоресценции контроля за i-тый промежуток времени окисления, F_i⁺ – интенсивность опытного образца (с 2,2 мМ глутатиона) за i-тый промежуток времени окисления, n – количество измерений. Чем выше эта сумма, тем больше биологическая эффективность препарата глуатион. Точность данного метода зависит от времени проведения анализа: для статистически достоверных различий достаточно уже взять четыре пробы, то есть достаточно проводить окисление в присутствии глутатиона в течение 80 минут. Для глуатиона фирмы “Sigma” (США), ⁿ_i = 1.810.3 относительных единиц. Суммарный расход глутатиона для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeSO₄ – 2,2 мМ, время анализа – 3,5 часа, количество операций – 5.

Пример 2.

Для исследования взят восстановленный глутатион фирмы “Serva” (ФРГ). Для проведения тестирования взято около 20 мкг порошка вещества на 1 мл раствора перекиси водорода и люминола в тех же концентрациях, что в примере 1. Затем к полученному раствору добавляли 1 мл раствора сульфата железа в той же концентрации, что в примере 1. Сразу после смешения измеряли максимальную амплитуду хемилюминесценции реакции (A₊ = 46 условных единиц). Затем определяли максимальную амплитуду свечения (A_o = 100 условных единиц) той же реакции при отсутствии испытуемого вещества. Об антиокислительной эффективности глутатиона судили по параметру A = (A₀ – A₊)/A₀, которая для глутатиона фирмы “Serva” (ФРГ) составила 0,54 относительных единиц. Максимальную амплитуду сверхслабого свечения наблюдали на 3-7 секунде от введения ионов Fe⁺². Анализ занял около 1 минуты, состоял из двух операций.

Новый метод сравнивали со способом-прототипом [3]. Для этого получали сыворотку крови крысы, на что уходило 50 минут, добавляли 0,2 мл ее к 10 мл дистиллированной воды. Затем 5 мг глутатиона, растворенного в дистиллированной воде, вносили в полученный раствор сыворотки. Такой раствор с добавленным глутатионом ставили на магнитную мешалку и активировали окисление сыворотки внесением в систему 1 мл 50 мМ раствора FeSO₄. Через каждые 20 минут отбирали по 0,8 мл и смешивали с таким же объемом 30% трихлоруксусной кислоты, спустя 20 минут от смешения каждую пробу центрифугировали в течение 20 минут при 10000 g, к полученному супернатанту добавляли 0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и кипятили полученный раствор в течение 60 минут. Количество ТБК-активных водорастворимых продуктов перекисного окисления оценивали по их флуоресценции в области 530 – 580 нм. Для возбуждения флоуоресценции использовали свет с длиной 515 нм, ширина щели – 3 нм.

В качестве контроля использовали окисление той же сыворотки без добавления глутатиона. Об эффективности препарата судили по величине подавления им в описанной системе ТБК-активных продуктов перекисного окисления: ⁿ_i(F_i/F⁺_i)/n , где F_i – интенсивность флуоресценции контроля за i-тый промежуток времени окисления, F_i⁺ – интенсивность опытного образца (с 2,2 мМ глутатиона) за i-тый промежуток времени окисления, n – количество измерений. Чем выше эта сумма, тем больше биологическая эффективность препарата глутатион. Точность данного метода зависит от времени проведения анализа: для статистически достоверных различий достаточно уже взять четыре пробы, то есть достаточно проводить окисление в присутствии глутатиона в течение 80 минут. Для глутатиона фирмы “Serva” (ФРГ), ⁿ_i = 1.680.8 относительных единиц. Суммарный расход глутатиона для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeSO₄ – 2,2 мМ, время анализа – 3,5 часа, количество операций – 5.

Пример 3.

Для исследования взят восстановленный глутатион фирмы “Реанал” (Венгрия”. Для проведения тестирования взято около 20 мкг порошка вещества на 1 мл раствора перекиси водорода и люминола в тех же концентрациях, что в примере 1. Затем к полученному раствору добавили 1 мл раствора сульфата железа в той же концентрации, что в примере 1. Сразу после смешения измеряли максимальную амплитуду хемилюминесценции реакции (A₊ = 43 условных единиц). Затем определяли максимальную амплитуду свечения (A₀ = 100 условных единиц) той же реакции при отсутствии испытуемого вещества. Об антиокислительной эффективности глутатиона судили по параметру A = (A₀ – A₊)/A₀, которая для глутатиона фирмы “Реанал” (Венгрия) составила 0,57 относительных единиц. Максимальную амплитуду сверхслабого свечения наблюдали на 3 – 7 секунде от введения ионов Fe⁺². Анализ занял около 1 минуты, состоял из двух операций.

Новый метод сравнивали со способом-прототипом [3]. Для этого получали сыворотку крови крысы, на что уходило 50 минут, добавляли 0,2 мл ее к 10 мл дистиллированной воды. Затем 5 мг глутатиона, растворенного в дистиллированной воде, вносили в полученный раствор сыворотки. Такой раствор с добавленным глутатионом ставили на магнитную мешалку и активировали окисление сыворотки внесением в систему 1 мл 50 мМ раствора FeSO₄. Через каждые 20 минут отбирали по 0,8 мл и смешивали с таким же объемом 30% трихлоруксусной кислоты, спустя 20 минут от смешения каждую пробу центрифугировали в течение 20 минут при 10000 g, к полученному супернатанту добавляли 0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и кипятили полученный раствор в течение 60 минут. Количество ТБК-активных водорастворимых продуктов перекисного окисления оценивали по их флуоресценции в области 530 – 580 нм. Для возбуждения флуоресценции использовали свет с длиной 515 нм, ширина щели – 3 нм.

В качестве контроля использовали окисление той же сыворотки без добавления глутатиона. Об эффективности препарата судили по величине подавления им в описанной системе ТБК-активных продуктов перекисного окисления: ⁿ₁(F_i/F⁺_i)/n , где F_i – интенсивность флуоресцении контроля за i-тый промежуток времени окисления, F_i⁺ – интенсивность опытного образца (с 2,2 мМ глутатиона) за i-тый промежуток времени окисления, n – количество измерений. Чем выше эта сумма, тем больше биологическая эффективность препарата глутатион. Точность данного метода зависит от времени проведения анализа: для статистически достоверных различий достаточно уже взять четыре пробы, то есть достаточно проводить окисление в присутствии глутатиона в течение 80 минут. Для глутатиона фирмы “Реанал” (Венгрия), ⁿ_i = 1.440.7 относительных единиц. Суммарный расход глутатиона для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворителе сыворотки и FeSO₄ – 2,2 мМ, время анализа – 3,5 часа, количество операций – 5.

Пример 4.

Для исследования взят восстановленный глутатион фирмы “Реанал” (Венгрия), который хранился в водном растворе в течение одного месяца при комнатной температуре 23^oC. Для проведения тестирования взято около 20 мкг порошка вещества (из водного раствора) на 1 мл раствора перекиси водорода и люминола в тех же концентрациях, что в примере 1. Затем к полученному раствору добавляли 1 мл раствора сульфата железа в той же концентрации, что в примере 1. Сразу после смешения измеряли максимальную амплитуду хемилюминесценции реакции (A₊ = 35 условных единиц). Затем определяли максимальную амплитуду свечения (A₀ = 100 условных единиц) той же реакции при отсутствии испытуемого вещества. Об антиоксидантной эффективности глутатиона судили по параметру A = (A₀ – A₊)/A₀, которая для глутатиона фирмы “Реанал” (Венгрия) составила 0,65 относительных единиц. Максимальную амплитуду сверхслабого свечения наблюдали на 3 – 7 секунде от введения ионов Fe⁺². Анализ занял около 1 минуты, состоял из двух операций.

Новый метод сравнивали со способом-прототипом [3]. Для этого получали сыворотку крови крысы, на что уходило 50 минут, добавляли 0,2 мл ее к 10 мл дистиллированной воды. Затем 5 мг глутатиона, растворенного за месяц до начала в дистиллированной воде, вносили в полученной раствор сыворотки. Такой раствор с добавлением глутатиона ставили на магнитную мешалку и активировали окисление сыворотки внесением в систему 1 мл 50 мМ раствора FeSO₄. Через каждые 20 минут отбирали по 0,8 мл и смешивали с таким же объемом 30% трихлоруксусной кислоты, спустя 20 минут от смешения каждую пробу центрифугировали в течение 20 минут при 10000 g, к полученному супернатанту добавляли 0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и кипятили полученный раствор в течение 60 минут. Количество ТБК-активных водорастворимых продуктов перекисного окисления оценивали по их флуоресценции в области 530 – 580 нм. Для возбуждения флуоресценции использовали свет с длиной 515 нм, шириной щели – 3 нм.

В качестве контроля использовали окисление той же сыворотки без добавления глутатиона. Об эффективности препарата судили по величине подавления им в описанной системе ТБК-активных продуктов перекисного окисления: ⁿ_i(F_i/F⁺_i)/n , где F_i – интенсивность флуоресценции контроля за i-тый промежуток времени окисления F_i⁺ – интенсивность опытного образца (с 2,2 мМ глутатиона) за i-тый промежуток времени окисления, n – количество измерений. Чем выше эта сумма, тем больше биологическая эффективность препарата глутатион. Точность данного метода зависит от времени проведения анализа: для статистически достоверных различий достаточно уже взять четыре пробы, то есть достаточно проводить окисление в присутствии глутатиона в течение 80 минут. Для глутатиона фирмы “Реанал” (Венгрия), ⁿ_i = 1.201.2 относительный расход глутатиона для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeSO₄ – 2,2 мМ, время анализа – 3,5 часа, количество операций – 5.

Пример 5.

Для исследования взят цистеин фирмы “Реанал” (Венгрия), водный раствор которого готовился непосредственно перед анализом. Для проведения тестирования взято около 10 мкг аминокислоты (из водного раствора) на 1 мл раствора перекиси водорода и люминола в тех же количествах, что в примере 1. Затем к полученному раствору добавили 1 мл раствора сульфата железа в той же концентрации, что в примере 1. Сразу после смешения измеряли максимальную амплитуду хемилюминесценции реакции (A₊ = 45 условных единиц). Затем определяли максимальную амплитуду свечения (A₀ – 100 условных единиц) той же самой реакции при отсутствии испытуемого вещества. Об антиоксидантной эффективности цистеина судили по параметру A = (A₀ – A₊)/A₀, которая для цистеина фирмы “Реанал” (Венгрия) составила 0,55 относительных единиц. Максимальную амплитуду сверхслабого свечения наблюдали на 3 – 7 секунде от введения ионов Fe⁺². Анализ занял около 1 минуты, состоял из двух операций.

Новый метод сравнивали со способом-прототипом [3]. Для этого получали сыворотку крови крысы, на что уходило 50 мин, добавляли 0,2 мл ее к 10 мл дистиллированной воды. Затем 1 мг цистеина, растворенного в воде непосредственно перед анализом, вносили в полученный раствор сыворотки. Такой раствор с добавленным цистеином ставили на магнитную мешалку и активировали окисление сыворотки внесением в систему 1 мл 50 мМ раствора FeSO₄. Через каждые 20 минут отбирали по 0,8 мл и смешивали с таким же объемом 30% трихлоруксусной кислоты, спустя 20 минут от смешения каждую пробу центрифугировали в течение 20 минут при 10000 g, к полученному супернатанту добавляли 0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и кипятили полученный раствор в течение 60 минут. Количество ТБК-активных водорастворимых продуктов перекисного окисления оценивали по их флуоресценции в области 530 – 580 нм. Для возбуждения флуоресценции использовали свет с длиной 515 нм, ширина щели – 3 нм. В качестве контроля использовали окисление той же сыворотки без добавления цистеина.

Об эффективности цистеина судили по величине подавления им в описанной системе ТБК-активных продуктов перекисного окисления: ⁿ_i(F_i/F⁺_i)/n, как в предыдущем примере 4. Чем выше эта сумма, тем больше биологическая эффективность цистеина. Точность данного метода зависит от времени проведения анализа: для статистически достоверных различий достаточно уже взять четыре пробы, то есть достаточно проводить окисление в присутствии цистеина в течение 80 минут. Для цистеина фирмы “Реанал” (Венгрия), ⁿ_i = 1.201.2 относительных единиц. Суммарный расход цистеина для такого анализа составлял 1 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeSO₄ – 2,2 мМ, время анализа – 3,5 часа, количество операций – 5.

Из приведенных примеров можно заключить, что новый способ по сравнению с известным прототипом [3] более прост (всего 2 операции вместо 5), более быстрый (1 минута для анализа вместо 3,5 часа) и не требует большего расхода вещества (от 10 до 20 мкг глутатиона или цистеина вместо 1 – 5 мг).

Антиокислительная активность излучаемого восстаноленного глутатиона определяется количеством свободных (восстановительных) SH-групп, которые нейтрализуют OH-радикалы. О количестве восстановленных SH-групп можно судить с помощью известного способа [5], основанного на том, что с избытком аллоксана восстановленные SH-группы глутатиона образуют соединение, имеющее максимум поглощения при 305 нм. Для этого из 25% раствора метафосфорной кислоты в день проведения анализа готовили 5% раствор. 0,1 М раствор аллоксана фирмы “Serva” (США) хранили в замороженном состоянии. 0,5 М раствор натрия хлорида титровали перед анализом, чтобы 10 мл щелочи были эквиваленты 10 мл 5% раствора метафосфорной кислоты и 10 мл 0,1 М аллоксана. В центрифужную пробирку наливали 9 мл 5% раствора метафосфорной кислоты и помещали очищенный перекристаллизацией в метаноле восстановленный глутатион фирмы “Sigma” (США) в количестве от 10 до 80 мкг для получения калибровочной кривой при 305 нм. Для определения количества восстановительных SH-групп глутатиона в опытных образцах измеряли оптическую плотность при 305 нм полученных комплексов аллоксана с трипептидом согласно известной методике [5]. В таблице 1 приведены результаты анализа восстановлненого неочищенного глутатиона фирмы “Sigma” (США), “Serva” (ФРГ) и “Реанал” (Венгрия), а также образцы водных растворов глутатиона “Реанал” (Венгрия) спустя 1 месяц хранения при комнатной температуре с момента их приготовления. В результате месячного хранения глутатиона окислялись его свободные SH-группы и, как следствие, снижались антиокислительные свойства.

Из таблицы можно убедиться, что новый хемилюминесцентный способ обладает значительно лучшей точностью по сравнению со способом-прототипом [3].

Таким образом, на примере восстановленного глутатиона доказано, что новый способ определения антиокислительной активности веществ путем изучения хемилюминесценции реакции Фентон более точен, прост, требует меньше тестируемого вещества и более быстрый в осуществлении.

Литература
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. “Медицина”, 1984, т. 2, стр. 96 – 99.

2. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. (1986) in Free Radicals in Biology and Medicine, Clarendon Press, Oxford, 168 – 169.

3. Л. В. Часовникова, В. Е. Формазюк, В.И.Сергиенко, Ю.А. Владимиров. “Антиоксидантное действие антикатарактальных лекарственных препаратов” – Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1989, N 12, с. 668 – 670.

4. L. V.Tchasovnikova. V.E.Formaziuk, V.I.Sergienko, A.A.Boldyrev, S.E. Severin. The ANTIOXIDATIVE PROPERTIES OF CARNOSINE AND OTHER DRUGS. Biochem. Inter., 1990, v 20, N 6, pp. 1097 – 1103.

5. Методы биохимических исследований под ред. проф. М.И. Прохоровой. Изд. Ленинградского университета, 1982, с. 183 – 186.

Формула изобретения

Способ определения антиокислительной активности вещества путем спектральной оценки их способности подавлять появление ОН-радикалов в реакции Фентон, отличающийся тем, что оценку осуществляют по интенсивности хемилюминесценции реакции Фентон по формуле А = (А₀ – A₊)/A₀, где A₀ – максимальная амплитуда хемилюминесценции реакции Фентон при отсутствии испытуемого вещества, A₊ – максимальная амплитуда свечения реакции в присутствии испытуемого вещества и при значениях A > 0,3 делают вывод об антиоксидантных свойствах у испытуемого вещества.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 20.11.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 13-2004

Извещение опубликовано: 10.05.2004