Патент на изобретение №2163019
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ КАЧЕСТВЕННО-КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКИХ РАСТВОРАХ
(57) Реферат: Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в лабораторной практике для проведения массовых обследований на содержание белка в различных биологических растворах (сыворотка крови, лимфа, моча, бактериальная взвесь и т. д.). Исследуемый раствор и стандартный раствор белка раститровывают параллельно на микробиологическом планшете. Белок связывают с красящим реагентом и учитывают содержание белка по изменению окраски при сравнении исследуемого и стандартного растворов визуально в течение 4 ч. Способ обеспечивает универсальное, достаточно точное и экстренное определение белка. Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в лабораторной практике для проведения массовых анализов на содержание белка в различных биологических растворах (сыворотка крови, моча, лимфа, иммуноглобулины, бактериальная взвесь). Качественные и количественные пробы на белок основаны на коагуляции его химическими реактивами или физическими методами. К наиболее массовым исследованиям относится определение белка в моче. Принцип качественного и количественного определения белка в моче основан на помутнении или выпадении хлопьевидного осадка при воздействии сульфосалициловой кислотой [Справочник по клиническим лабораторным методам исследования/Под ред. Е.А. Коста.- М.: Медицина, 1975, с. 221-222]. Количественное определение содержания белка проводят по интенсивности коагуляции через 5 мин после реакции исследуемого раствора с кислотой на ФЭК против контроля с помощью калибровочной кривой по стандартному раствору альбумина. В этом анализе жестким требованием является прозрачность мочи, что удлиняет исследования. Необходимость проведения контроля через 5 мин после реакции затрудняет проведение массовых исследований. Способ неприменим к другим биологическим растворам. Известен способ определения белка в плазме крови с учетом примеси гемоглобина в массовых исследованиях путем последовательной обработки пробы крови водными растворами красной кровяной соли с цианидом калия и бикарбонатом натрия, а затем – биуретовым раствором. Показатели экстинции учитывают последовательно через 15 мин фотометрированием при 545 нм, а белок определяют как разницу между показателями экстинции [Биохимические методы исследования в клинике/Под ред. А.А. Покровского.- М.: Медицина, 1969, с. 61]. Этот способ применим только для плазмы крови. Известен способ определения белка в биологических растворах путем проведения иммуноферментного анализа [Дзантнев Б.В., Егоров А.М. Ж. ВХО им. Д.И. Менделеева, 1982, т. 27, N 4, с. 82-89]. Сложность способа для организации массовых исследований заключается в необходимости подготовки конъюгата для каждого типа исследуемого раствора, создания оптимальных условий образования комплекса антиген-антитело. Известен достаточно простой способ качественного определения белка в биологических растворах [a.с. СССР N 1193181, C 01 N 33/43, 23.11.85. Бюл. N 43]. Способ осуществляют путем воздействия на исследуемый раствор реагентом, состоящим из трихлоруксусной кислоты и формалина с последующим учетом помутнения с помощью экрана при освещенности 400-450 лк сверху и 145-155 лк снизу. Способ неприменим для количественного определения содержания белка. Наиболее близким по назначению и сущности к заявляемому является способ количественного определения белка в биологических растворах, основанный на изменении окраски при воздействии на него красящего реагента [Bradford М.М., Analitical Biochemistry, v. 72, 1976, p. 248-254]. В качестве красящего реагента используется спиртовой раствор Кумасси C-250 при следующем содержании компонентов на 1 л воды: Кумасси C-250 – 100 мг, этиловый спирт 95% – 50 мл, фосфорная кислота 85%-ная – 100 мл, в соотношении исследуемой биологический раствор к реагенту 1: 8. Краситель в кислоте переходит в лейкооснование, образовывая коллоидный раствор, который при связи с белком изменяет окраску. Изменение окраски учитывают на спектрофотометре при 595 нм через 2-3 мин после реакции, содержание белка определяют по кривой, построенной заранее по раститрованному альбумину. Недостатком прототипа является то, что изменение окраски на спектрофотометре необходимо фиксировать в течениe 30 мин, в противном случае из-за выпадения осадка белка с Кумасси показания, снятые прибором, будут недостоверны. Кроме того, использование данного способа для определения белка в мутных биологических растворах не представляется возможным. Целью изобретения является разработка универсального, достаточно точного и экспрессного метода определения содержания белка в различных биологических растворах, обеспечивающего организацию массовых анализов и при отсутствии соответствующих приборов. Поставленная цель достигается тем, что исследуемый раствор и стандартный раствор белка раститровывают параллельно на микробиологическом планшете, белок связывают с красителем и учитывают содержание белка по изменению окраски исследуемого раствора в сравнении со стандартным раствором белка визуально в течениe 4 ч. Учет результатов можно проводить с первых секунд внесения реагента. По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки. Раститровка исследуемого биологического раствора и стандартного раствора белка на микробиологическом планшете обеспечивает возможность единообразного связывания белка с красящим реагентом и достаточную точность учета визуально изменения окраски, исключая необходимость построения стандартной кривой. Визуальный учет позволяет определить содержание белка в дисперсных растворах, содержащих липиды, клеточные элементы, а также в случае выпадения в осадок белка с красителем, что фотометрически не фиксируется. Возможность практического использования заявляемого способа иллюстрируется примерами конкретного выполнения. Пример 1. В лунках микробиологического планшета на двух рядах последовательно проводят двукратное разведение мочи и раствора альбумина в концентрации 1 мг/мл. Затем в каждую лунку, содержащую 0,1 мл раствора, вносят по 0,1 мл красящего реагента, содержащего в расчете на 1 л 100 мг красителя Кумасси C-250, 50 мл 95%-ного этилового спирта и 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты. После внесения реагента планшет встряхивают с целью лучшего перемешивания проб с реагентом и проводят учет результатов. Визуальный учет определения концентрации белка в исследуемой моче проводится сопоставлением интенсивности окраски разведений мочи с окраской раститрованного альбумина. Количество белка в моче соответствует количеству белка в разведенной пробе альбумина, наиболее сходной по окраске. Визуальные показатели: при содержании белка более 12 мкг/мл – окраска синяя, до 8 мкг/мл – слабо-синяя, до 3 мкг/мл – следы синей, до 0,5 мкг/мл под увеличением в 20 раз – синий осадок через 4 ч. Отсутствие белка – желто-зеленая окраска. Окраска белка в растворах стабильна и сохраняется в течение нескольких суток (3-4) до высыхания пробы. Пример 2. Осуществляется аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве исследуемого раствора применяют сыворотку крови. При этом визуально синяя окраска регистрируется при содержании белка более 12 мкг/мл, слабо-синяя – от 12 до 8 мкг/мл, следы синей – от 8 до 3 мкг/мл, синий осадок – от 3 до 0,5 мкг/мл определяется через 4 ч под увеличением в 20 раз. Полученные результаты соответствуют результатам определения белка в моче. Пример 3. Осуществляется аналогично примерам 1 и 2, за исключением того, что в качестве исследуемого раствора применяют бактериальную взвесь. Учет результатов ведется исключительно визуально, так как изначальная мутность раствора не предполагает использования приборов. После внесения красящего реагента в пробу сразу появляется окрашивание: при содержании белка более 12 мкг/мл – синяя, от 12 до 8 мкг/мл – слабо-синяя, от 8 до 3 мкг/мл – следы синей, от 3 до 0,5 мкг/мл под увеличением в 20 раз через 4 ч – синий хлопьевидный осадок. Полученные результаты при определении концентрации белка в бактериальных взвесях соответствуют результатам, полученным при определении концентраций белка в других биологических растворах, представленных в примерах 1 и 2. Таким образом, преимуществом заявляемого способа по сравнению с известными аналогами является достаточно точное и простое определение содержания белка в биологических растворах, в том числе дисперсных, содержащих липиды и клеточные элементы. Представляется перспективным его использование в лабораторной практике, особенно при массовых исследованиях. Формула изобретения
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 03.03.2002
Номер и год публикации бюллетеня: 11-2003
Извещение опубликовано: 20.04.2003
|
||||||||||||||||||||||||||
