Патент на изобретение №2351021

(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной ревматологии, и может быть использовано для моделирования ревматоидного артрита. Для этого подкожно вводят 4 мг овальбумина в 1 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) в область коленного сустава. После введения овальбумина в ПАФ внутривенно вводят папаин в дозе 8-10 мг/кг массы тела. Затем на 12-е сутки с начала формирования модели вводят 5 мг овальбумина в полость коленного сустава, при этом овальбумин в ПАФ вводят однократно. Способ обеспечивает сокращение количества этапов и сроков моделирования ревматоидного артрита, формирование более выраженных системных воспалительных реакций в организме, что позволяет проводить апробацию комплексных способов лечения с использованием не только местно, но и системно действующих препаратов.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”окт.1991. с.138-139. O’SHAUGHNESSY МС.et al. The effect of substance P on nitric oxide release in a rheumatoid arthritis model. Inflamm Res. 2006 Jun;55(6):236-40. FATHY N. et al. Combination therapy for autoimmune diseases: the rheumatoid arthritis model. Springer Semin Immunopathol. 2001;23(1-2):5-26.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования ревматоидного артрита на животных при апробации различных способов и средств лечения.

Известен способ моделирования ревматоидного артрита у крыс путем введения 0,07-0,08 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), после чего организм животного подвергают воздействию иммобилизационного стресса в течение 1 часа ежедневно в период с 14-х по 28-е сутки (патент РФ №2305328, кл. G 09 23/28. Опубл. 27.08.2007 г. Бюл. №23).

Недостатками способа являются использование длительного (двухнедельного) ежедневного часового иммобилизационного стресса, а также внутрикожные введения ПАФ, что создает определенные трудности технического характера. Кроме того, способ продолжителен по времени (28 суток).

Известен также способ моделирования ревматоидного артрита у крыс путем парентерального введения ПАФ и бычьего сывороточного альбумина с последующей электростимуляцией с помощью электродов, имплантированных в область основания хвоста и голеностопного сустава (авторское свидетельство №1748174, кл. G 09 23/28. Опубл. 18.06.1990 г. Бюл. №26).

Недостатками этого способа являются значительная сложность и трудоемкость моделирования артрита. Для выполнения способа требуется операция у крыс, для чего выполняется фиксация на операционном столе, внутрибрюшинная наркотизация тиопенталом, подкожная имплантация электродов в область основания хвоста и голеностопного сустава, ушивание кожи в области оперативного вмешательства. Помимо этого проводят введение ПАФ в основание хвоста и бычьего сывороточного альбумина в подушечку задней лапы.

Данный способ позволяет воспроизводить только тяжелую форму артрита, предназначенную для изучения далеко зашедшей стадии заболевания с выраженной воспалительной деструкцией суставных тканей, когда терапевтическое воздействие, в том числе медикаментозное, малоэффективно. В то же время необходимость изучения тонких патогенетических механизмов заболевания и совершенствование диагностики метаболических нарушений, а также апробация новых схем медикаментозной терапии перспективны именно в начальной стадии, при минимальной степени активности воспалительного процесса.

Недостатками данного способа являются многоэтапность и длительность формирования модели (21-22 дня), а также отсутствие выраженных системных проявлений воспалительных реакций в организме.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является сокращение количества этапов и сроков моделирования ревматоидного артрита, формирование более выраженных системных воспалительных реакций в организме, что позволяет проводить апробацию комплексных способов лечения с использованием не только местно, но и системно действующих препаратов.

Поставленная задача решается тем, что в способе моделирования экспериментального ревматоидного артрита путем подкожного введения 4 мг овальбумина в 1 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) в область коленного сустава с последующим внутрисуставным введением 5 мг овальбумина, дополнительно, после подкожного введения овальбумина в ПАФ, внутривенно вводят папаин в дозе 8-10 мг/кг массы тела, а на 12-е сутки с начала формирования модели – овальбумин в полость коленного сустава, при этом овальбумин в ПАФ вводят однократно.

Авторами изобретения установлено, что дополнительное внутривенное введение папаина, протеолитического фермента растительного происхождения, одновременно с подкожным введением 4 мг овальбумина в 1 мл ПАФ в область опытного коленного сустава приводит к интенсивной деградации белково-углеводных компонентов матрикса соединительно-тканных суставных структур, усиливая их воспалительную деструкцию, что приводит к более выраженным и системным воспалительным реакциям в организме.

Дополнительное внутривенное введение папаина позволяет вводить овальбумин в ПАФ однократно, сокращая количество этапов за счет исключения повторной иммунизации, и осуществлять введение овальбумина в полость коленного сустава на 12-е сутки с начала формирования модели, что приводит к сокращению срока формирования модели до 15 суток.

Выбранная опытным путем разовая доза папаина 8-10 мг/кг массы тела наиболее оптимальна и эффективна для формирования выраженных системных воспалительных реакций в организме. Доза менее 8 мг/кг не обеспечивает формирования полноценной модели, а доза более 10 мг/кг не дает дополнительного положительного эффекта.

Технический результат заключается в сокращении количества этапов и ускорении моделирования ревматоидного артрита, а также в формировании более выраженных системных воспалительных реакций в организме.

Способ реализуют следующим образом.

Лабораторное животное, в частности кролика, фиксируют на станке для лабораторных животных. Проводят подготовку коленного сустава: сбривают волосяной покров, после чего кожу обрабатывают 5%-ным раствором йода или спиртовым 1%-ным раствором бриллиантового зеленого. В эксперименте использовали ПАФ, содержащий 20 мг убитых автоклавированием микобактерий в виде сухой вакцины БЦЖ, 10 мл растительного масла и 2 мл физиологического раствора. ПАФ готовят непосредственно перед применением, стерильно, тщательно размешивая. В качестве антигена использовали овальбумин. Иммунизацию животного проводят путем подкожного введения 4 мг овальбумина в 1 мл ПАФ в две точки (латерально и медиально) в области опытного коленного сустава.

После этого в обработанную 5%-ным раствором йода краевую вену уха кролика вводят папаин в дозе 8-10 мг/кг массы тела. После проведения манипуляций места инъекций заклеивают бактерицидным пластырем.

На 12-е сутки после иммунизации стерильно в опытный коленный сустав животного вводят 5 мг овальбумина в 1 мл физиологического раствора. Через 2-3 суток после этого наблюдалась картина выраженного артрита.

Эксперимент был проведен на 43 кроликах породы «Шиншилла Русская», весом 3,0-3,6 кг, находившихся в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Из них у 15 особей моделирование артрита осуществлялось по методу Pettipher E.R. с соавт., (1988) и у 20 – по предлагаемому способу. 8 интактных (здоровых) кроликов составили группу контроля. Воспроизводимость модели экспериментального ревматоидного артрита составила 100%.

Формирование моделей было подтверждено анализом как локальных, так и системных клинико-лабораторных проявлений артрита. Клинические методы исследования включают осмотр, общую оценку поведения животного, его активность, вес и аппетит, пальпацию суставов, измерение окружности, объем движений в суставах. Также учитываются данные тепловизионного, гематологического, биохимического и гистоморфометрического методов исследования. Исследования были проведены в сыворотке крови и содержимом суставной полости.

При сравнительном анализе как предлагаемого, так и известного, выбранного в качестве прототипа, способов развивается классическая картина артрита. Однако заявляемый способ позволил формировать модель в более короткие сроки, чем известный. При этом выявилась более высокая степень общей активности воспалительного процесса с резким сдвигом показателей гемоцитограммы, а также более выраженными метаболическими нарушениями. Последние определяются степенью воспалительно-деструктивных процессов в соединительной ткани, интенсификацией процессов липопероксидации и недостаточностью антиоксидантной системы защиты, приводящих к развитию перекисно-антиоксидантного дисбаланса.

ПРИМЕР. У кролика №6, массой 3,4 кг, формировали экспериментальный ревматоидный артрит. На 15-е сутки после начала проведения эксперимента проводили всестороннее обследование кролика с целью подтверждения формирования модели.

При осмотре животное вялое, мало подвижное по сравнению с интактными животными, шерсть тусклая с проплешинами. Масса тела животного составила 3,2 кг. Окружность опытного сустава, в который вводилась разрешающая доза антигена-овальбумина, увеличена на 6 мм и составила 14 мм (до начала эксперимента – 8 мм). Нарушена опорная функция опытной конечности из-за отека и болевой реакции. Пальпация опытного коленного сустава болезненна (животное отдергивает конечность). Объем активных и пассивных движений снижен.

При тепловизионном обследовании обнаружена выраженная температурная асимметрия в области коленных суставов. Разница температур между опытным и контрольным суставом составила 1,3°С.

Клиническую картину заболевания подтверждают и результаты проведенных лабораторных методов исследования. Лабораторные данные крови: СОЭ – 8,00 мм/ч при норме 2,8±0,20 мм/ч; гемоглобин – 118,20 г/л при норме 124,30±0,80 г/л; эритроциты – 3,33·10¹²/л при норме 4,04±0,10·10¹²/л; лейкоциты – 10,14·10⁹/л при норме 7,60±0,11·10⁹/л; палочкоядерные – 5,82% при норме 3,96±0,18%; сегментоядерные – 51,37% при норме 42,60±0,81%; лимфоциты – 33,26% при норме 47,80±0,84%; эозинофилы – 2,57% при норме 1,49±0,10%; моноциты – 4,62% при норме 3,44±0,12%; молекулы средней массы – 0,312 ед.о.п. при норме 0,236±0,002 ед.о.п.; церулоплазмин 38,01 у.е. при норме 27,77±1,03 у.е.; малоновый диальдегид – 5,2 мкмоль/л при норме 3,59±0,15 мкмоль/л; гликозаминогликаны, определяемые по уроновым кислотам – 3,4 г·10^-2/л при норме 1,47±0,03 г·10^-2/л.

Лабораторные данные содержимого суставной полости: общий цитоз – 2,12·10⁹/л при норме 0,15·10⁹/л; нейтрофилы – 42,00% при норме 9,51±0,11%; лимфоциты – 41,03% при норме 8,43±0,09; макрофаги – 38,22% при норме 0%; рагоцитоподобные клетки – 30,51% при норме 0%.

При гистоморфометрическом исследовании тканей опытного коленного сустава было выявлено утолщение параартикулярных тканей, разволокнение пучков коллагеновых волокон и слабая периваскулярная метахромазия, свидетельствующая о наличии мукоидного набухания – признака дезорганизации соединительной ткани. Определялась умеренно выраженная пролиферация фибробластов и слабая лимфоидно-клеточная инфильтрация. Сумма баллов признаков поражения – 7.

Синовиальная оболочка была утолщена и разрыхлена. Определялась очаговая пролиферация синовиоцитов, выявлялась гиперплазия ворсин и пролиферация крупных молодых пиронинофильных форм фибробластов. Имелись воспалительно-экссудативные признаки – разрыхление поверхностного слоя. Определялся пролиферативный эндоваскулит. Из признаков дезорганизации соединительной ткани выявлялась периваскулярная метахромазия как результат усиленного синтеза гликозаминогликанов фибробластами и синовиоцитами, а также декомпозиции белково-углеводных комплексов основного вещества соединительной ткани. Обнаружен склероз, проявлявшийся периваскулярным фиброзом и уплотнением стромы субинтимального слоя. Сумма баллов признаков поражения – 11.

А в менисках выявлялась пролиферация фибробластов, некоторое ослабление метахромазии глубоких зон и плазматические клетки. Сумма баллов признаков поражения – 5.

В суставном же хряще имелись дегенеративные изменения, типичные для ревматоидного артрита: очаговая потеря наружных слоев поверхностной зоны хряща, очаговое разволокнение поверхностной и частично основной зон, диффузная ортохромазия, свидетельствующая о выходе гликозаминогликанов, потеря хондроцитов и дистрофия оставшихся, что сопровождалось пиронинофилией и повышением активности кислой фосфатазы – маркерного фермента лизосом. Сумма баллов признаков поражения – 4.

При этом и строение субхондральной кости было нарушено. Выявлялось истончение субхондральной костной пластинки и трабекул, свидетельствующее о потере костного вещества. Сумма баллов признаков поражения – 2.

Анализ результатов гистоморфометрического исследования установил, что у данного кролика в тканях опытного коленного сустава развилось ревматоидное воспаление, морфологическим субстратом которого также, как и у больных ревматоидным артритом, являются два взаимосвязанных процесса: воспалительная инфильтрация с пролиферацией синовиоцитов и дезорганизация матрикса соединительнотканных структур, формирующих элементы сустава.

Заключение по гистоморфометрическому исследованию: у данного кролика имеются признаки выраженного хронического неспецифического продуктивного синовита.

Таким образом, на 15-е сутки с начала проведения эксперимента у животного имеются выраженные клинические локальные и общие проявления артрита с высокой степенью общей и местной активности воспалительного процесса и существенное нарушение метаболического гомеостаза.

Предлагаемый способ сокращает количество этапов и сроки моделирования ревматоидного артрита, а также формирует более выраженные системные воспалительные реакции в организме.

Надежность и оперативность воспроизведения модели экспериментального ревматоидного артрита, сопоставимость клинических проявлений, а также гематологических, биохимических и морфологических изменений у животных и больных ревматоидным артритом, доступность используемых препаратов позволяют рекомендовать описанную модель для изучения различных схем медикаментозной и немедикаментозной терапии.

Формула изобретения

Способ моделирования экспериментального ревматоидного артрита путем подкожного введения 4 мг овальбумина в 1 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) в область коленного сустава с последующим внутрисуставным введением 5 мг овальбумина, отличающийся тем, что дополнительно, после введения овальбумина в ПАФ, внутривенно вводят папаин в дозе 8-10 мг/кг массы тела, а на 12-е сутки с начала формирования модели – овальбумин в полость коленного сустава, при этом овальбумин в ПАФ вводят однократно.