Патент на изобретение №2350955

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЯЖЕЛОГО ТЕЧЕНИЯ ЛЕПРОЗНЫХ ПОЛИНЕВРИТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть, в частности, использовано для прогнозирования тяжелого течения полиневритов.

Недостатками этого способа являются: недостаточная эффективность способа из-за отсутствия возможности прогнозирования нарушения чувствительной и трофической функций периферических нервов, что в комплексе с двигательными нарушениями и лежит в основе тяжелых лепрозных нейропатий. Кроме того, недостатком известного способа является тот факт, что предложенный этими авторами критерий может быть использован только уже при наличии патологических изменений в нервных стволах. Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат – повышение эффективности способа.

Известен также способ прогнозирования тяжелого течения полиневритов у больных лепрой, заключающийся в обнаружении в сыворотке крови больных лепрой антител к одному из нейромаркеров периферических нервов – церамиду. Показано, что высокий уровень антицерамидных антител у больных лепрой обнаруживается при прогрессирующей деструкции периферических нервов (Narayan R., Maheshwari Р.К., Desikan K.V. Harinath B.C. Detection of S-100 protein and anticeramide antibodies in leprosy patients by ELISA. Lepr.Rev. – 1997. – Vol.68. – №2. – Р.117-124).

Недостатками этого способа являются: недостаточная эффективность способа из-за отсутствия возможности прогнозирования тяжелого течения лепрозных невропатий; кроме того, недостатком известного способа является тот факт, что предложенный этими авторами критерий может быть использован только уже при наличии патологических изменений в нервных стволах. Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат – повышение эффективности способа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования тяжелого течения полиневритов, предложенный Барановым Ю.Н., Евстратовой В.А., Подоплеловым В.И. «Пальцевая дерматоглифика у больных лепрой с тяжелый неврологическими нарушениями» («Актуальные вопросы лепрологии», Астрахань, 1984 г., с.90-93).

Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что в обоих способах применен генетический подход, основанный на изучении генетических особенностей человека.

Сущность этого способа состоит в определении особенностей пальцевого узора в зонах пальцевой иннервации локтевого и срединного нервов. Недостатками известного способа являются:

– недостаточная эффективность прогнозирования развития тяжелого течения полиневрита из-за сложности определения пальцевого узора у больных лепрой, обусловленной трофическими изменениями концевых фаланг пальцев кисти, что в итоге затрудняет проведение данного исследования;

– различия в трактовке результатов по половому признаку, что сужает диагностический диапазон данного способа.

Таким образом, перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат – повышение эффективности способа.

Периферическая нервная система у больных лепрой обычно в той или иной степени вовлекается в процесс, однако тяжелые неврологические нарушения развиваются не у всех больных. Не всегда имеется соответствие между тяжестью процесса на коже и поражением периферических нервов, а острые невриты могут возникать на фоне регресса высыпаний на коже (Аламдаров И.Н. «Учен. зап. Ин-та по изуч. лепры.», Астрахань, 1976, №9 (14), с.5-12). Кроме того, лечение противолепрозными препаратами, начатое даже у больных с начальными неврологическими проявлениями, не во всех случаях предупреждает прогрессирование лепрозных полиневритов, а также не всегда способствует регрессу уже имевшихся неврологических нарушений (Андросюк Ю.Г. «Клинико-диагностическое значение сывороточных маркеров в распознавании и прогнозировании течения лепрозных невропатий»: Автореф. дис.-канд. мед. наук. – Саратов, 2005. – 19 с.). Этот факт дает основание предположить, что развитие неврологических нарушений у больных лепрой во многом зависит от врожденных свойств организма.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу – повышение эффективности способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Предлагаемый способ состоит в том, что определяют генотип HLA-DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602/08 в крови больного и по его наличию прогнозируют тяжелое течение лепрозных полиневритов.

Таким образом, реализуется положительный результат изобретения, суть которого состоит в повышении эффективности способа.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК проводили по методу Higuchi (R.Higuchi H.Erlich «Using PCR to engineer DNA, In: PCR Technology», Stockton Press, New York, N.Y.,1989, P.61-70) с некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, взятой с ЭДТА в качестве антикоагулянта, смешивали в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл типа Эппендорф, содержащих 0,5 мл лизирующего раствора. Состав лизирующего раствора: 0,32 М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl буфера рН 7,5, 5 мМ MgCl₂, 1% Тритона Х-100 центрифугировали в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза промывали вышеуказанным раствором. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3; 2,5 мМ MgCl₂, 0,45% NP-40, 0,45% Твина-20 и 250 мкг/мл протеиназы К при 37°С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К нагреванием в твердотельном термостате при 95°С в течение 5 мин. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при – 20°С. Концентрация ДНК, определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-флуориметре (Hoefer, США), составляла от 50 до 100 мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 мин. Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2 мМ каждого из дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), 67 мМ Трис-HCl рН 8,8; 2,5 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, 0,1 мг/мл желатина, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Для предотвращения изменения концентраций компонентов реакционной смеси из-за образования конденсата реакционную смесь покрывали 20 мкл минерального масла. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере «Терцик» (ЗАО НПФ “ДНК-Технология”, Москва).

Типирование локуса DRB1 проводили в два этапа. Во время первого раунда геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках. В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRB1 (праймеры DRBsen и DRBas), а во второй – пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR3, DR5, DR6, DR8 (праймеры DR3568s и DRBas). В обоих случаях температурный режим амплификации (для термоциклера «Терцик») был следующим:

Полученные продукты разводили в 10 раз и использовали на втором раунде.

При амплификации на втором раунде использовали следующий температурный режим:

Типирование локуса DQA1 проводилось в два этапа. На первом раунде использовалась пара праймеров, амплифицирующая все специфичности локуса DQA1, а на втором раунде использовались пары праймеров, амплифицирующие следующие специфичности *0101, *0102, *0103, *0201, *0301, *0401, *0501, *0601.

Первый раунд проводили по программе:

Продукты амплификации первого раунда разводили в 10 раз и использовали на втором раунде по следующей программе:

Типирование локуса DQB1 также проводилось в два этапа. На первом раунде использовали пару праймеров, амплифицирующую все специфичности локуса DQB1. Температурный режим был следующий:

На втором раунде использовали пары праймеров, амплифицирующие следующие специфичности: *0201, *0301, *0302, *0303, *0304, *0305, *04, *0501, *0502, *0503, *0601, *0602/08. Продукты первого раунда разводили в 10 раз и проводили амплификацию в следующем температурном режиме:

Электрофорез проводили при напряжении 200-250V в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Время проведения электрофореза: после окончания I этапа – 10 минут, после окончания II этапа – 20 минут. Продукты амплификации видны в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета в ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм на трансиллюминаторе (Fluorescent tables combi-light, France). В качестве маркера длин использовали перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp I.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицами (таблицы 1, 2, 3) и примерами.

В таблице 2, 3 представлено и видно, что длительность заболевания и возраст больных не оказывают влияния на достоверность результатов.

Вывод: в таблицах 2 и 3 показано, что развитие тяжелых полиневритов у больных лепрой не зависит от возраста и длительности заболевания.

Предлагаемый способ был апробирован на 42 больных, находящихся на лечении и диспансерном наблюдении в ФГУ НИИ по изучению лепры Росздрава, г.Астрахань, в течение 8 лет с 1999 г. по 2006 годы. Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1.

Больной К-ко, 1946 г.р. (история болезни №2662). Болен лепрой с 1957 года. В 1957 году впервые госпитализирован в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, пограничный туберкулоид (ВТ). Лепрозный процесс носил ограниченный характер. Гистологическое исследование показало признаки нисходящей трансформации процесса в лепроматозный тип. После курса химиотерапии был выписан на амбулаторное лечение. В 1963 году больной поступил с рецидивом заболевания: лепроматозный тип лепры. Периферическая нервная система не была вовлечена в специфический лепрозный процесс.

В период апробации способа проведено генетическое исследование. У больного брали кровь из вены в количестве 1,5 мл и определяли генотип и прогнозировали тяжелое течение полиневрита. Геномную ДНК выделяли из периферической крови методом высаливания по стандартной процедуре, указанной выше. Для типирования генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) использовали наборы HLA-ДНК-Тех (НПФ «ДНК-технология», Россия). Реакцию амплификации проводили на амплификаторе «Терцик» («ЗАО НПФ ДНК-Технология») по программам, указанным выше. Детекцию продуктов амплификации проводили при помощи электрофореза в 3% агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

У больного неврологический статус характеризовался сгибательной контрактурой II и V пальца правой кисти и V и IV пальцев левой кисти, амиотрофией межкостных мышц, специфическим полиневритом с распространенными чувствительными, трофическими и двигательными нарушениями, сгибательной контрактурой всех пальцев кистей, анестезией до плечевых суставов и ягодичных складок. Периферические нервные стволы утолщены, болезненны. С осени 2001 г. резко ухудшилось состояние трофики тканей левой стопы. Объективно: левая стопа резко отечна, в области I пальца на дистальной фаланге имеются несколько свищевых ходов. Диагноз: Хронический специфический остеомиелит в стадии обострения. 16 сентября 2001 г. назначено оперативное вмешательство. Произведена секвестротомия концевой фаланги первого пальца левой стопы.

29 декабря 2001 г. усилились боли в области II пальца левой стопы. Диагноз: Остеомиелит II пальца левой стопы. Назначено оперативное вмешательство. 15.02.2001 г. произведена экзартикуляция II пальца левой стопы.

Пример №2.

Больной Б-ов, 1956 г.р. (история болезни №3206). Болен лепрой с 1963 года. В 1964 году впервые госпитализирован в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Клинически заболевание характеризовалось наличием кольцевидных элементов в области ягодиц с нарушением чувствительности. На верхних и нижних конечностях все виды поверхностной чувствительности были сохранены. Гистологически: лепроматозный инфильтрат с наличием большого количества микобактерий лепры. Лепроминовая проба была отрицательной. С 1974 г. больной поступил с рецидивом заболевания и начали беспокоить лепрозные невриты.

Неврологический статус в 2000 г.: локтевые нервы утолщены, больше справа, справа нерв болезненный. Справа парестезии и гипостезии в зоне иннервации n.ulnaris на фоне полиневритического типа. Амиотрофические изменения не нарастают. Больному назначено специфическое лечение: витамины группы В, десенсибилизирующие, мочегонные, болеутоляющие средства, фонофорез с гидрокортизоном на область локтевых и малоберцовых нервов. Комплексное лечение привело к улучшению неврологического статуса.

В дальнейшем, несмотря на проводимую специфическую противолепрозную терапию и лечение невритов, у больного прогрессировало ухудшение неврологического статуса.

В ноябре 2001 г. больной стал предъявлять жалобы на периодические боли в руках стреляющего характера, онемение рук, снижение чувствительности на верхних и нижних конечностях. Объективно: локтевые и малоберцовые нервы утолщены при пальпации, болезненны, нарушение чувствительности по полиневритическому типу: на руках гипестезии до плечевых суставов, на ногах до коленных. Атрофия межкостных мышц кистей, стоп, m.thenar, m.hypothenar, мышц голеней, предплечья. Сгибательная контрактура средней фаланги V пальцев обеих кистей. В настоящее время неврологический статус характеризуется специфическим полиневритом с распространенными чувствительными, трофическими и двигательными нарушениями, амиотрофией межкостных мышц правой кисти, утолщением и болезненностью локтевых и малоберцовых нервов.

Пример №3.

Больная К-ва Н.И., 1938 г.р. (история болезни №1813). Болеет лепрой с 1948 года. Первичный диагноз: лепра, туберкулоидный тип. В 1971 и 1973 годах госпитализирована в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с рецидивом заболевания с диагнозом: лепра, лепроматозный тип, специфический полиневрит с чувствительными и трофическими нарушениями. Клинически заболевание характеризовалось очаговой инфильтрацией на коже туловища, ягодиц, верхних и нижних конечностей. Локтевые нервы были умеренно утолщены, слегка болезненны, анестезия до верхней трети плеч, трофические язвы стоп. Больная неоднократно лечилась в стационаре НИИЛ по поводу лепрозного полиневрита.

Прогнозирование тяжелого течения лепрозного полиневрита осуществляли способом, описанным в примере №1.

После типирования у больной выявлен гаплотип HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602Y08.

В декабре 2000 года у больной неврологический статус характеризовался нарушением чувствительности по полиневритическому типу, атрофией межкостных мышц кистей, стоп, m.thenar, m.hypothenar, контрактурой основных и концевых фаланг I, III, IV, V пальцев левой кисти, мутиляцией II и V пальцев правой стопы, трофической язвой на подошвенной поверхности правой стопы. Локтевые нервы умеренно утолщены, слегка болезненны при пальпации. В настоящее время неврологический статус характеризуется специфическим полиневритом с распространенными чувствительными, трофическими и двигательными нарушениями, медленно-прогрессирующее течение.

Пример №4.

Больная Д-ва А.А., 1940 г.р. (история болезни №2441). Болеет лепрой с 1955 года. В 1955 году впервые госпитализирована в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Неоднократно лечилась по поводу рецидивов заболевания, остеомиелита костей нижних конечностей.

Прогнозирование тяжелого течения лепрозного полиневрита осуществляли способом, описанным в примере №1.

В июне 2000 г. больная стала предъявлять жалобы на боли в левой стопе при ходьбе. Объективно: на подошвенной поверхности левой стопы имелась трофическая язва с обильными серозно-гнойными выделениями. Больной было произведено хирургическое вмешательство, что привело к исчезновению язвы. В дальнейшем у больной нарастала симптоматика обострения и утяжеление течения специфического полиневрита. Неврологический статус характеризовался умеренным утолщением периферических нервных стволов, умеренной болезненностью при пальпации. На правой руке отсутствовал III палец, остальные на обеих руках в состоянии сгибательной контрактуры. На правой ноге отсутствуют IV и V пальцы, на левой II и V пальцы, остальные деформированы. На обеих стопах с подошвенной поверхности трофические язвы. Степпаж с обеих сторон. Атрофия мышц кистей, предплечий.

Пример №5.

Больная Ю-на-Г-ва, 1932 г.р. (история болезни №3008). Болеет лепрой с 1961 года. В 1961 году впервые госпитализирована в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Клинически заболевание характеризовалось очаговой и диффузной поверхностной инфильтрацией. Локтевые нервы были утолщены, поверхностные виды чувствительности снижены. Гистологически: лепроматозный инфильтрат с наличием огромного количества гомогенных и зернистых форм микобактерий лепры. Неврологический статус: Локтевые нервы слегка утолщены, больше справа, при пальпации безболезненны, остальные периферические нервы не утолщены, безболезненны при пальпации. Контрактур, мутиляций, трофических нарушений нет.

Прогнозирование тяжелого течения лепрозного полиневрита осуществляли способом, описанным в примере №1.

После типирования у больной выявлен гаплотип HLA DRB1-1-DQA1-0101-DQB1-0501.

За время наблюдения клинических признаков обострения лепрозной невропатии не зарегистрировано, периферические нервные стволы не утолщены, безболезненны.

Таким образом, отсутствие в крови больной гаплотипа HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602V08 не дает возможность прогнозировать тяжелое течение лепрозного полиневрита.

Пример №6.

Больная Ч-ва Т.А., 1937 г.р. (история болезни №3759). Болеет лепрой с 1959 года. В 1959 году впервые госпитализирована в Абинский лепрозорий с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Неоднократно поступала с рецидивом заболевания. Неврологический статус характеризовался утолщением и болезненностью левого локтевого нерва.

Прогнозирование тяжелого течения лепрозного полиневрита осуществляли способом, описанным в примере №1.

После типирования у больной выявлен гаплотип HLA DRB1-11-DQA1-0501-DQB1-0301. Неврологический статус на протяжении всех лет наблюдения характеризуется спокойным течением, периферические нервные стволы не утолщены, безболезненны.

Таким образом, отсутствие в крови больного гаплотипа HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602V08 не дает возможность прогнозировать тяжелое течение лепрозного полиневрита.

Применением предложенного способа по сравнению со способом-прототипом достигается положительный результат, заключающийся в повышении эффективности прогнозирования тяжелого течения лепрозных полиневритов. Повышение эффективности способа достигается определением конкретного иммуногенетического маркера, определяющего тяжесть течения полиневритов, и может быть использован на всех стадиях лепрозного процесса, как на самых ранних, включая субклиническую стадию, так и на отдаленных стадиях антибактериальной терапии, а также возможностью предупреждения тяжелого поражения нервной системы больного лепрой с помощью своевременных лечебных и реабилитационных мероприятий.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагаемый способ прогнозирования тяжелого течения лепрозных полиневритов у больных лепрой.

Предлагаемый способ может быть рекомендован к клиническому использованию в противолепрозных учреждениях и неврологических клиниках для прогнозирования тяжести течения полиневритов.

Формула изобретения