Патент на изобретение №2349965

(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОСТРОГО ПИЕЛОНЕФРИТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной нефрологии, и может быть использовано для моделирования острого пиелонефрита. Для этого лабораторным крысам внутрибрюшинно однократно вводят клинический изолят Escherichia coli или Staphylococcus saprophyticus в концентрации 10⁶-10⁹ КОЕ/мл. При этом изолят выделяют из мочи пациента с острым пиелонефритом. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение модели за счет использования уропатогенного штамма при исключении нанесения животному операционной травмы.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”урологов, 1996, с.158-159. SCHMIDT H. et al. [Detection of fibria-like surface structures in Staphylococcus saprophyticus as a pathogen in chronic pyelonephritis] Z. Urol. Nephrol., 1988 Jul; 81(7):437-44. MOBLEY H.L. et al. Isogenic P-fimbrial deletion mutants of pyelonephritogenic Escherichia coli: the role of alpha Gal(l-4) beta Gal binding in virulence of a wild-type strain. Mol. Microbiol. 1993 Oct; 10(1):143-55.

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической физиологии и нефрологии, и может быть использовано для изучения патогенеза острого пиелонефрита и исследования эффективности новых лекарственных препаратов для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний органов мочевой системы в доклинических экспериментах.

Известные способы моделирования пиелонефрита основаны на создании нарушения почечной гемодинамики за счет курсового введения в организм экспериментальных животных (белых крыс) химических агентов, изменяющих синтез почечных простагландинов, и гематогенного инфицирования непатогенными штаммами бактерий – непатогенные штаммы кишечной палочки 0-111 (Ю.М.Есилевский, М.А.Пальцев, Э.С.Севергина и Д.Г.Уфимцева. Авторское свидетельство СССР №1097633, кл. G09В 23/28, опубл. 1982). При моделировании пиелонефрита по методу Лукьянова А.В., Долгих В.Т., Потиевского Э.Г., Рейс Б.А., Соколова Т.О., Никонова В.М. (Бюллетень сибирской медицины, 2004. №6, с.42-46) крысам культура коллекционного штамма кишечной палочки (гемолизирующая Е.coli с колицинотипом Са 38) вливается через стенку мочевого пузыря под визуальным контролем после предварительной лапаротомии, то есть с применением оперативных методов. При этом гистологические признаки воспалительного процесса регистрируются преимущественно в интерстиции почек и почечных канальцах и не выявляются в слизистой и строме лоханок и чашечек.

Недостатками существующих способов моделирования пиелонефрита путем применения оперативного доступа к органам мочевой системы являются, помимо развития у лабораторных крыс инфекционного процесса, являющегося конечной целью эксперимента, нанесение животному операционной травмы, что искажает регистрируемые в эксперименте показатели и тем самым уменьшает чистоту эксперимента и достоверность полученных результатов. К тому же при данных способах нередко развитие острого гнойного пиелонефрита, что нетипично для рядовой клинической ситуации. Способы гематогенного заражения подразумевают, как правило, использование в качестве инфекционного агента непатогенных, коллекционных штаммов, не имеющих тропности к уроэпителию, применение которых также не позволяет создать у животного типичной клиники острого пиелонефрита. Кроме того, гистологические признаки воспалительного процесса регистрируются в интерстиции и почечных канальцах и не выявляются в слизистой и строме лоханок и чашечек. Поэтому разработка экспериментальной модели острого пиелонефрита, максимально приближенной к реальным условиям, является актуальной научно-практической задачей.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание модели острого пиелонефрита, воспроизводимой без технических трудностей, по этиопатогенезу, клиническому течению и лабораторным показателям идентичной воспалительному процессу в органах мочевой системы, наблюдаемому в клинике, и не сопровождающейся нанесением животному операционной травмы.

Сущность изобретения заключается в однократном внутрибрюшинном введении лабораторным крысам клинического изолята Escherichia coli или Staphylococcus saprophyticus концентрации 10^-6-10⁹ КОЕ/мл, выделенных из мочи пациентов с острым пиелонефритом, подтвержденным клиническими и лабораторными данными, и обладающих уропатогенными свойствами.

Новым в способе является то, что заражение экспериментального животного – самки белой беспородной крысы – осуществляется путем однократного внутрибрюшинного введения микробной суспензии, что позволяет получить воспалительные изменения в почках экспериментальных животных, идентичные наблюдаемым в клинике без нанесения животному операционной травмы; с целью увеличения вероятности развития у животного воспалительного процесса в почках для заражения используется клинические изоляты Staphylococcus saprophyticus или Escherichia coli, обладающие уропатогенными свойствами и вызывающие у экспериментального животного воспалительный процесс в органах мочевой системы, подтверждаемый данными лабораторных, морфологических и микробиологических исследований.

Способ осуществляется следующим образом. Для моделирования пиелонефрита используются самки беспородных белых крыс, содержащиеся в стандартных условиях вивария. Лабораторному животному однократно интраперитонеально вводят суточную бульонную культуру уропатогенных штаммов лактозонегативной Escherichia coli или Staphylococcus saprophyticus, изолированных из мочи пациентов с клинической картиной острого пиелонефрита, подтвержденного лабораторными данными. Культуры используемых для заражения штаммов вводятся в концентрации 10⁶-10⁹ КОЕ/мл, определяемой нефелометрическим методом (оптическая плотность бактериальной суспензии в мясопептонном бульоне для Escherichia coli – 0,012-0,026, для Slaphylococcus saprophyticus – 0,015-0,028, длина волны 540 нм, кювета – 1,060 мм).

Пример 1. Наркотизированной эфиром белой крысе (самке) массой 150 г введено внутрибрюшинно однократно 400 мкл микробной суспензии суточной бульонной культуры клинического изолята лактозонегативной Escherichia coli в концентрации 10⁵ КОЕ/ мл, предварительно определенной нефелометрическим методом на фотоэлектрофотометре, КФК-3, (оптическая плотность бактериальной суспензии в мясопептонном бульоне 0,011, длина волны 540 нм, кювета – 1,060 мм). Через 3 дня после заражения животного в периферической крови достоверных изменений лейкоцитарной формулы не выявлено. На 10 сутки животное было умерщвлено под эфирным наркозом путем перерезки спинного мозга, проведено бактериологическое и гистологическое исследование внутренних органов. При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала культура Escherichia coli в ткани почек, селезенки и печени крысы не обнаружена. При проведении гистологического исследования в почках экспериментального животного изменений, свидетельствующих о развитии у животного острого пиелонефрита не выявлено.

Пример 2. Наркотизированной эфиром белой крысе (самке), массой 150 г, введено внутрибрюшинно однократно 400 мкл микробной суспензии суточной бульонной культуры клинического изолята лактозонегативной Escherichia coli в концентрации 10⁶ КОЕ/мл, предварительно определенной нефелометрическим методом на фотоэлектрофотометре, КФК-3, (оптическая плотность бактериальной суспензии в мясопептонном бульоне 0,012, длина волны 540 нм, кювета – 1,060 мм). Через 3 дня после заражения животного в периферической крови выявлено достоверное увеличение лейкоцитов с нейтрофильным сдвигом влево и эозинофилия, сохраняющиеся до момента вывода животного из эксперимента. На 10 сутки животное было умерщвлено под эфирным наркозом путем перерезки спинного мозга, проведено бактериологическое и гистологическое исследование внутренних органов. При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала культура Escherichia coli в концентрации 10⁶ КОЕ/ мл была выделена из ткани почек, селезенки и печени крысы. При проведении гистологического исследования в почках экспериментального животного обнаружено полнокровие сосудов стромы и ее инфильтрация лейкоцитами и макрофагами, зернистая дистрофия эпителия канальцев и белковые цилиндры в просветах, воспалительная лимфогистиоцитарная инфильтрация с примесью нейтрофилов в слизистой оболочке и строме почечных лоханок и чашечек. Выявленные изменения свидетельствуют о развитии у животного острого пиелонефрита.

Пример 3. Наркотизированной эфиром самке белой крысы (масса тела 180 г) внутрибрюшинно введено 700 мкл бактериальной взвеси суточной бульонной культуры изолированного от пациента уропатогенного штамма Staphylococcus saprophyticus концентрации 10⁷ КОЕ/мл, предварительно определенной нефелометрическим методом (оптическая плотность культуры – 0,025, длина волны – 540 нм, кювета – 1,060 мм). Через 3 дня после заражения животного в периферической крови выявлено увеличение лейкоцитов с нейтрофильным сдвигом влево и эозинофилия. Выявленные изменения приобрели характер достоверных к 7 суткам от заражения. На 10 сутки животное было умерщвлено под эфирным наркозом путем перерезки спинного мозга, проведено бактериологическое и гистологическое исследование внутренних органов. При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала культура Staphylococcus saprophyficus в концентрации 10⁷ КОЕ/мл была выделена из ткани почек, селезенки и печени крысы. При проведении гистологического исследования в почках экспериментального животного обнаружено полнокровие сосудов стромы и ее инфильтрация лейкоцитами и макрофагами, зернистая дистрофия эпителия канальцев и белковые цилиндры в просветах, воспалительная инфильтрация, представленная лейкоцитами, лимфоцитами, макрофагами, в слизистой оболочке и строме почечных лоханок и чашечек. Выявленные изменения свидетельствуют о развитии у животного острого пиелонефрита.

Пример 4. Наркотизированной эфиром самке белой крысы (масса тела 150 г) интраперитонеально введено 1000 мкл бактериальной взвеси суточной бульонной культуры лактозонегативной уропатогенной Escherichia coli в концентрации 10 КОЕ/мл, предварительно определенной нефелометрическим методом (оптическая плотность культуры – 0,026, длина волны – 540 нм, кювета – 1,060 мм). Через 3 дня после заражения животного в периферической крови выявлено достоверное увеличение лейкоцитов с нейтрофильным сдвигом влево. К 7 суткам, прошедшим после заражения, выявленные изменения сохранялись. На 10 сутки животное было умерщвлено под эфирным наркозом путем перерезки спинного мозга, проведено бактериологическое и гистологическое исследование внутренних органов. При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала культура лактозонегативной Escherichia coli в концентрации 10⁹ КОЕ/мл была выделена из ткани почек, селезенки и печени крысы. При проведении гистологического исследования в почках экспериментального животного обнаружено полнокровие сосудов стромы и ее инфильтрация лейкоцитами и макрофагами, зернистая дистрофия эпителия канальцев и белковые цилиндры в их просветах, воспалительная инфильтрация, представленная лейкоцитами, лимфоцитами, макрофагами, гистиоцитами в слизистой оболочке и строме почечных лоханок и чашечек. Выявленные изменения свидетельствуют о развитии у животного острого пиелонефрита.

Пример 5. Наркотизированной эфиром белой крысе (самке) массой 150 г введено внутрибрюшинно однократно 400 мкл микробной суспензии суточной бульонной культуры клинического изолята лактозонегативной Escherichia coli в концентрации 10¹⁰ КОЕ/мл, предварительно определенной нефелометрическим методом на фотоэлектрофотометре, КФК-3 (оптическая плотность бактериальной суспензии в мясопептонном бульоне 0,028, длина волны 540 нм, кювета – 1,060 мм). Через 3 дня после заражения животного в периферической крови выявлено достоверное увеличение лейкоцитов с нейтрофильным сдвигом влево и эозинофилия, сохраняющиеся до момента вывода животного из эксперимента. На 10 сутки животное было умерщвлено под эфирным наркозом путем перерезки спинного мозга, проведено бактериологическое и гистологическое исследование внутренних органов. При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала культура Escherichia coli в концентрации 10¹⁰ КОЕ/ мл была выделена из ткани почек, селезенки и печени крысы. При проведении гистологического исследования в почках экспериментального животного обнаружено выраженное полнокровие сосудов стромы и ее инфильтрация лейкоцитами и макрофагами, зернистая дистрофия эпителия канальцев и белковые цилиндры в просветах, воспалительная лимфогистиоцитарная инфильтрация с примесью нейтрофилов в слизистой оболочке и строме почечных лоханок и чашечек. В толстой кишке отмечалось избыточное количество бокаловидных клеток, десквамирующихся в просвет кишки, разрастание лимфоидной ткани в подслизистом слое. В строме в основании слизистой оболочки признаки отека, более выраженная, чем в тонкой кишке, воспалительная инфильтрация лимфогистиоцитарного характера с примесью нейтрофилов и плазматических клеток. В противовес инфильтрату в строме толстой кишки практически отсутствовали эозинофилы. В легких отмечалась периваскулярная, перибронхиальная и диффузная воспалительная инфильтрация – лимфолейкоцитарная с примесью плазматических клеток, макрофагов, эозинофилов. В лимфоидной ткани селезенки выявлялись светлые центры размножения в фолликулах, в красной пульпе крупные макрофаги с гиперхромными ядрами, умеренная лимфолейкоцитарная инфильтрация. Отмечаемые патоморфологические изменения в различных органах крысы объясняются генерализованным характером инфекционно-воспалительного процесса, возможно в связи с развитием сепсиса, т.о. данная концентрация Escherichia coli не может быть применена для моделирования острого пиелонефрита.

Предлагаемая модель пиелонефрита позволяет воспроизводить инфекционно-воспалительный процесс в почках, подобный наблюдаемому в клинике, поскольку для заражения животных используются уропатогенные штаммы – клинические изоляты Staphylococcus saprophyticus и лактозонегативной Escherichia coli, отсутствует нанесение животному операционной травмы, и в результате эксперимента выявляются гистологические изменения в почках, характерные для острого негнойного пиелонефрита с вовлечением в воспалительный процесс не только интерстициальной ткани, но и собирательной системы почек – лоханок и чашечек. Преимуществом предлагаемого способа (по сравнению с известными) является более адекватное воспроизведение инфекционно-воспалительного процесса в почках, более высокая воспроизводимость модели, удешевление ее стоимости.

Формула изобретения

Способ моделирования острого пиелонефрита путем введения лабораторным крысам микробной суспензии уропатогенного штамма (лактозонегативной Escherichia coli или Staphylococcus saprophyticus), отличающийся тем, что для моделирования пиелонефрита лабораторным крысам внутрибрюшинно однократно вводят клинический изолят Escherichia coli или Staphylococcus saprophyticus в концентрации 10⁶-10⁹ КОЕ/мл, выделенный из мочи пациента с острым пиелонефритом и обладающий уропатогенными свойствами.