Патент на изобретение №2349597

(54) ТИОМОРФОЛИНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ СТЕРОИДОВ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГУЛИРУЮЩИХ МЕЙОЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТИХ СОЕДИНЕНИЙ

(57) Реферат:

Описаны тиоморфолиновые производные стероидов общей формулы I, которые могут быть успешно использованы для стимулирования мейоза ооцитов человека, эти стероиды характеризуются наличием тиоморфолинового фрагмента, присоединенного к С¹⁷ стероидного скелета через алкиленовый спейсер, где R⁴ и R^4′ водород и метил, при условии, что оба R⁴ и R^4′ одновременно не обозначают водород. 7 н. и 5 з.п.ф-лы, 6 ил.

Настоящее изобретение относится к фармацевтически активным тиоморфолиновым производным стероидов, фармацевтическим композициям, включающим эти соединения, к применению этих соединений для получения фармацевтических композиций, пригодных для регулирования репродукции, в частности, мейоза, к лекарственным средствам – контрацептивным средствам или средствам, способствующим повышению фертильности, к способу регулирования репродукции, например, мейоза, к способу повышения способности ооцитов к развитию внутри организма млекопитающего с использованием этих соединений, а также к способу получения (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола.

Мейоз является уникальным и исключительно важным явлением, наблюдающимся у зародышевых клеток, на мейозе основывается половое размножение. Мейоз включает два мейотических деления. В процессе первого деления происходит обмен между материнскими и отцовскими генами перед тем, как пары хромосом разделятся на дочерние клетки. Они содержат только половину количества (1n) хромосом и 2с ДНК. Второе мейотическое деление протекает без синтеза ДНК. Это деление, таким образом, приводит к образованию гаплоидных зародышевых клеток только с одной ДНК.

Мейотические процессы сходны у мужских и женских зародышевых клеток, но время протекания и процессы дифференцировки, которые приводят к возникновению женских зародышевых клеток (яйцеклеток) и сперматозоидов совершенно различны. Все женские зародышевые клетки входят в профазу первого мейотического деления на ранних этапах развития, часто до рождения, но все подвергаются затем задержке в виде ооцитов в профазе (диктиатное состояние) вплоть до овуляции по достижению половой зрелости. Таким образом, у женщин с ранних стадий развития имеется запас ооцитов, который используется до тех пор, пока не израсходуется. Мейоз у женщин не завершается до тех пор, пока не произойдет оплодотворение, и приводит к появлению только одной зрелой яйцеклетки и двух абортивных полярных телец на одну зародышевую клетку. Наоборот, лишь некоторые мужские зародышевые клетки входят в стадию мейоза при половой зрелости и оставляют популяцию зародышевых клеток на всем протяжении жизни. Однажды начавшись, мейоз протекает в мужских клетках без значительной задержки и приводит к продуцированию четырех сперматозоидов.

Совсем немного известно о механизмах, которые инициируют мейоз в мужских и женских организмах. Последние исследования свидетельствуют о том, что фолликулярные пурины, гипоксантин и аденозин могут быть ответственными за задержку мейоза в ооцитах [S.M.Downs et al., Dev. Biol., 82, 454-458 (1985); J.J.Epplg. et al., Dev. Biol., 119, 313-321 (1986); S.M.Downs, Mol. Reprod. Dev., 35, 82-94 (1993)]. Наличие диффузионных регулирующих мейоз соединений было впервые описано для культуральной системы женских гонад мышей в статье: A.G.Byskov et al., Dev. Biol., 52, 193-200 (1976). Соединение, активирующее мейоз, называемое MAS (MAS – сокр. от англ. Meiosis activating substance), секретируется яичниками мышей-самок, причем в яичниках протекает мейоз, а соединение, предотвращающее мейоз, называемое MPS (MPS – сокр. от англ. Meiosis preventing substance) высвобождается из морфологически дифференцированного яичка с покоящимися, не мистическими зародышевыми клетками. Предполагают, что относительная концентрация MAS и MPS регулирует начало, остановку и возобновление мейоза в мужских и женских зародышевых клетках [A.G.Byskov et al., in: The Physiology of Reproduction (eds. E.Knobil, J.D.Neill), Raven Press, New York (1994)]. Очевидно, если возможно регулировать мейоз, то возможно контролировать репродукцию (размножение). В недавней статье [A.G.Byskov et al., Nature, 374, 559-562 (1995)] сообщается о выделении некоторых стеринов (стеролов). Такие стерины были выделены из семенников быков и фолликулярной жидкости, эти соединения активируют мейоз ооцитов и эти соединения обозначают как T-MAS – активирующий мейоз стерин из семенников (сокр. от англ. testes meiosis-activating sterol) и FF-MAS – активирующий мейоз стерин из фолликулярной жидкости (сокр. от англ. follicular fluid meiosis – activating sterof): 4,4-диметил-5-холеста-8,14,24-триен-3-ол].

Также было показано, что микромолярные концентрации синтетического FF-MAS могут индуцировать возобновление мейоза зависящим от концентрации соединения образом в случае ооцитов крысы, которые подвергались задерживающему воздействию ингибитора фосфодиэстеразы IBMX (3-изобутил-1-метилксантин) [С.Hegele-Hartung et al., Biol. Reprod., 64, 418-424 (2001)]. показано, что этот эффект может наблюдаться в том случае, когда ооциты, окруженные кумулюсом (совокупность оболочек), сокращенно СЕО (СЕО – сокр. от англ. cumulus-enclosed oocytes), а также ооциты, лишенные кумулюса (голые ооциты), сокращенно DO (DO – сокр. от англ. denuded oocytes) культивируют in vitro в присутствии соединения FF-MAS.

Другие соединения, которые регулируют мейоз, описаны в следующих документах.

В опубликованной международной заявке WO 98/52965 A1 описаны активирующие мейоз производные 20-аралкил-5-прегнана.

В опубликованной международной заявке WO 00/68245 A1 описаны производные стероида, которые способны ингибировать мейоз таким образом, что эти соединения могут быть использованы как контрацептивные средства для женщин и мужчин. Эти соединения представляют собой первично ненасыщенные производные холестана, характеризующиеся наличием 3-атома водорода, связанного с атомом углерода С¹⁴ холестанового скелета.

В опубликованной международной заявке WO 96/00235 А1 описаны индуцирующие мейоз стерины, которые известны как промежуточные соединения биосинтеза холестерина, а также описаны некоторые структурно родственные синтетические стерины. Как было установлено, эти соединения регулируют мейоз. По аналогии с холестерином, эти соединения содержат боковую цепь у С¹⁷ в стериновом скелете и дополнительно по меньшей мере одну двойную связь ⁷, ⁸ или ⁸⁽¹⁴⁾.

В опубликованной международной заявке WO 96/27658 А1 описан способ стимулирования мейоза зародышевой клетки, этот способ включает введение в клетку in vivo, ex vivo или in vitro эффективного количества соединения, которое вызывает аккумуляцию эндогенного активирующего мейоз соединения до уровня, при котором индуцируется мейоз. Такими соединениями, которые вызывают аккумуляцию активирующего мейоз соединения, как описано в этом документе, являются амфотерицин В, аминогуанидин, 3,5,6-тригидроксихолестан, мелатонин, 6-хлормелатонин и 5-метокситриптамин, а также другие их производные и антагонисты. К числу активирующих мейоз соединений, как сообщалось, также относят 5-холестан-3-ол, D-гомо-холеста-8,14-диен-3-ол и 22,25-диазахолестерин, 25-аза-24,25-дигидроланостерин, 24,25 иминоланостерин, 23- и 24-азахолестерин, а также производные 25 азахолестанола.

В опубликованной международной заявке WO 97/00884 А1 и в опубликованной международной заявке WO 98/28323 А1 описаны соединения, которые могут быть использованы для стимулирования мейоза in vitro, in vivo или ex vivo. Следовательно, описанные в этом документе соединения являются агонистами встречающихся в природе активирующих мейоз соединений, и таким образом могут быть использованы для лечения бесплодия, которое является следствием недостаточного стимулирования мейоза у женщин и мужчин. В этом документе также описаны некоторые соединения, которые могут быть антагонистами встречающихся в природе активирующих мейоз соединений, так что указанные соединения могут подойти для использования в качестве контрацептивных средств. Среди соединений, описанных в этом документе, упомянуты 5-холест-8-ен-3-олы и 5-холест-8,14-диен-3-олы, которые, в частности, могут содержать аминогруппу в боковой цепи, присоединенной к С¹⁷ холестеринового скелета, причем аминогруппа присоединена к стериновому скелету через С₄-спейсер. Группы C₁-С₄ алкил или С₃-С₆ циклоалкил присоединяются к аминогруппе.

Кроме того, в опубликованной международной заявке WO 99/58549 А1 описаны производные стерина, которые эффективны при регулировании мейоза. Описано, что эти соединения обладают способностью снижать мужское и женское бесплодие, в особенности у людей. К числу производных стерина, обладающих эффектом регулирующих соединений, относятся, в частности, (20R)-20-метил-23-диметиламино-5-прегна-8,14-диен-3-ол, (20R)-20-метил-23-диметиламино-5-прегна-5,7-диен-3-ол, 4,4-диметил-24-фениламино-5-хола-8,14-диен-3-ол, 4,4-диметил-24-(N,N-диметиламино)-24-циано-5-холеста-8,14-диен-3-ол и дополнительно ряд производных стеринов – амидов 24-оновой кислоты, содержащих одну или более двойных связей в стериновом скелете.

В опубликованной международной заявке WO 02/079220 А2 описаны производные стероидов, которые обладают способностью регулировать мейоз, причем эти соединения представляют собой первичные стерины, содержащие аминометиловый или аминоэтиловый фрагмент, присоединенный к С²⁰.

Аминогруппа может представлять собой, например, фрагмент азотсодержащей гетероциклической кольцевой системы, более конкретно, пиперидиновой кольцевой системы. Одним из примеров таких соединений является (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол. Как правило, эти соединения проявляют стимулирующее мейоз действие, особенно в отношении ооцитов, окруженных кумулюсом – СЕО (СЕО – сокр. от англ. cumulus enclosed ovocytes). В одном из примеров конкретного выполнения описано тиоморфолиновое производное.

Ненасыщенные производные стерина, содержащие аминогруппу в боковой цепи при С¹⁷, также описаны в: J.J.Sheets, L.E.Vickery, “Active Site-directed Inhibitors of Cytochrome P-450scc”, J. Biol. Chem., Vol.258 (19), 1983, pp.11446-11452, в этой статье описывается воздействие этих стеринов на отщепление цитохрома Р-450 (Р-450 scc) от боковой цепи адренокортикального холестерина быка. В этом документе, в частности, описаны 22-амино-23,24-бис-нор-хол-5-ен-3-ол и 23-амино-24-нор-хол-5-ен-3-ол.

Кроме того, ненасыщенные производные, содержащие аминогруппу в боковой цепи при С¹⁷, описаны в: А.Т.Mangia, W.D.Nes “Sterol C-methyl Transferase from Prototheca – wickerhamii, Mechanism, Sterol Specificity and Inhibition”, Bioorg. and Med. Chem. (2000), 8 (5), 925-936. В этом документе среди прочих соединений описан 23-азазимостерин.

При использовании ранее описанных регулирующих мейоз компонентов было обнаружено, что возобновление мейоза происходит в оголенных ооцитах (клетки, лишенные поверхностных антигенных детерминант) in vitro. Однако большая часть этих соединений лишь ограниченно эффективна при стимулировании мейоза в ооцитах, окруженных кумулюсом – зернистыми клетками яичника (СЕО). Кроме того, соотношение оплодотворения in vitro, обратной имплантации, а также количества живых плодов в конце беременности являются недостаточно высокими.

Вышеуказанные документы включены в текст настоящей заявки в качестве ссылки.

Одной из целей настоящего изобретения является обнаружение соединений, которые могут быть полезными для регулирования репродукции, в частности, мейоза, у женских и мужских организмов, в особенности у млекопитающих, и более конкретно – у человека.

Другой целью настоящего изобретения является получение новых фармацевтических композиций, включающих новые соединения.

Настоящее изобретение также относится к применению новых соединений для получения фармацевтической композиции, которая может быть использована для регулирования репродукции, в частности, мейоза.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание нового способа регулирования репродукции, например, мейоза.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа лечения бесплодия человека.

Еще одной целью настоящего изобретения является улучшения созревания ооцитов человека.

Кроме того, целью настоящего изобретения является повышение синхронности ядерного, цитоплазматического и/или мембранного созревания ооцитов.

Кроме того, целью настоящего изобретения является повышение фертильности ооцитов.

Кроме того, целью настоящего изобретения является повышение коэффициента имплантации ооцитов у человека при созревании и оплодотворении in vitro.

Кроме того, целью настоящего изобретения является снижение случаев хромосомных нарушений преэмбрионов человека (таких как анеуплоидия – нарушение числа хромосом в геноме).

Дополнительно, целью настоящего изобретения является увеличение коэффициента дробления преэмбриона человека.

Дополнительно, целью настоящего изобретения является повышение качества преэмбриона человека.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа получения новых соединений.

Согласно настоящему изобретению тиоморфолиновые производные стероидов общей формулы I могут быть эффективно использованы при регулировании репродукции, например, мейоза, у млекопитающих, например, у млекопитающих мужского и женского пола, в частности, у человека:

где во фрагменте I’ соединения I

каждая связь между С⁵ и С⁶, между С⁶ и С⁷, между С⁷ и С⁸, между С⁸ и С⁹, между С⁸ и С¹⁴ и между С¹⁴ и С¹⁵, независимо, представляет собой простую связь или двойную связь, причем по меньшей мере одна из этих связей представляет собой двойную связь, и

где каждый атом углерода С⁵, С⁶, С⁷, С⁸, С⁹, С¹⁴ и С¹⁵ присоединен к каждому соседнему атому углерода С самое большее посредством одной двойной связи, при условии, что не имеется двойной связи в стероидном скелете исключительно между С⁵ и С⁶ (это последнее условие означает, что соединения, содержащие исключительно ⁵ двойную связь, не входят в объем настоящего изобретения), и

где

R⁴ и R^4′, независимо, выбирают из группы, включающей водород и метил.

Фрагмент общей формулы I’ в производном стероида согласно настоящему изобретению предпочтительно включает одну двойную связь между С⁸ и С¹⁴ или две сопряженные двойные связи, предпочтительно, либо две двойные связи между С⁸ и С⁹ и между С¹⁴ и С¹⁵, либо две двойные связи между С⁵ и С⁶ и между С⁷ и С⁸.

R⁴ и R^4′ предпочтительно означают одинаковые радикалы, т.е. они оба представляют собой водород или они оба представляют собой метил.

Остальные атомы водорода могут быть присоединены к атомам С¹, С², С⁵, С⁶, С⁷, необязательно С⁸, С⁹, С¹¹, С¹², С¹⁴, С¹⁵, С¹⁶ и С¹⁷, в зависимости от того, являются ли соответствующие атомы С частью двойной связи или не являются. При С¹⁰, С¹³ и С¹⁸ метальные группы присоединены к стероидному скелету и боковой цепи, соответственно.

Более предпочтительно, согласно настоящему изобретению, производное стероида выбирают из группы, включающей следующие соединения:

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол:

Соединение IА

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8(14)-ен-3-ол:

Соединение IБ

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-5-прегна-8,14-диен-3-ол:

Соединение IB

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-прегна-5,7-диен-3-ол:

Соединение IГ

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-5-прегна-8(14)-ен-3-ол:

Соединение IД

Наиболее предпочтительное тиоморфолиновое производное согласно настоящему изобретению представляет собой (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол, соответствующий химической формуле IA. Таким образом, оптимальные характеристики в отношении индуцирования созревания в фолликулярной культуральной системе достигается при использовании тиоморфолинового производного, если стероидный скелет включает систему двойных связей ^8,14 и если R⁴ и R^4′ представляют собой метил (соединение IA).

Новые производные стероидов содержат ряд хиральных центров, поэтому эти соединения существуют в нескольких изомерных формах. Все эти изомерные формы входят в объем настоящего изобретения, если не указывается иное.

Неожиданно было обнаружено, что соединения согласно настоящему изобретению обладают сильным стимулирующим мейоз воздействием на ооциты, в особенности на ооциты, окруженные кумулюсом (СЕО), хотя эти соединения значительно отличаются по структуре от стерина FF-MAS. В этом отношении соединения согласно настоящему изобретению превосходят ранее описанное стимулирующее мейоз соединение [например: A.G.Byskov et al., Nature, 374, 559-562 (1995)]. Предпочтительными соединениями общей формулы I являются такие соединения, которые индуцируют разрыв зародышевого пузырька по меньшей мере в 40% случаев, предпочтительно по меньшей мере в 60% случаев и особенно предпочтительно по меньшей мере в 80% случаев при проведении ооцитового теста таким образом, как описано ниже.

Соединения согласно настоящему изобретению превосходят ранее описанные стимулирующие мейоз соединения и во втором аспекте. В то время как FF-MAS не способны индуцировать созревание в фолликулярной культуральной системе, соединения согласно настоящему изобретению способны активировать мейоз в такой ситуации.

По сравнению с соединениями, описанными в опубликованной международной заявке WO 02/079220 А2, тиоморфолиновые производные стероидов согласно настоящему изобретению проявляют даже более сильную стимулирующую созревание активность, особенно при оплодотворении, и более благополучное соотношение переноса в трубы женского организма после оплодотворения in vitro. Кроме того, новые соединения проявляют превосходящие свойства в отношении живых плодов в конце беременности, если был выполнен обратный перенос подвергнутых стимуляции ооцитов. Кроме того, растворимость соединений согласно настоящему изобретению в воде лучше, чем растворимость соединений, известных из предшествующего уровня техники. Также было обнаружено, что лучше стимулируется рост бластоцистов (бластодермальных пузырьков), как было показано на мышах.

Вышеуказанные преимущества новых соединений также справедливы для тиоморфолиновых производных согласно настоящему изобретению при их сравнении с наиболее эффективными соединениями, описанными в опубликованной международной заявке WO 02/079200 А2, в частности, при сравнении с (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-олом (соединение №2 согласно этому документу).

По этой причине новые производные стероидов, например, могут быть использованы для применения in vivo, а также для применения non-in vivo (не in vivo), которое, в частности, включает применение in vitro. Производные стероидов в особенности подходят для оплодотворения млекопитающих in vitro и для оплодотворения млекопитающих in vivo, в особенности, для оплодотворения человека.

Исключительные свойства новых соединений могут быть отнесены к комбинации структурных признаков соединений, т.е. прежде всего к положению двойных связей в стероидном скелете и наличию тиоморфолиновой группы в боковой цепи, присоединенной к атому углерода С¹⁷ стероидного скелета через метиленовый спейсер, а также к наличию группы С²⁰-R²⁰.

Предпочтительными фармацевтически приемлемыми соединениями согласно настоящему изобретению являются соли производного стероидов общей формулы I. Примеры таких солей перечислены в: Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 et seq. (1977), включено в текст настоящей заявки в качестве ссылки. Примеры таких солей включают соли органических кислот, таких как муравьиная кислота, фумаровая кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная (-оксипропионовая) кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, янтарная кислота, яблочная (оксиянтарная кислота), винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, метансульфоновая кислота и подобные кислоты. Подходящие неорганические кислоты для получения фармацевтически приемлемые соли включают хлороводородную кислоту, бромоводородную кислоту, серную кислоту, фосфорную кислоту и подобные кислоты.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, включающие по меньшей мере одно тиоморфолиновое производное стероида общей формулы I и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, выбранный из группы наполнителей, хорошо известных из предшествующего уровня техники. Наполнитель может, например, представлять собой по меньшей мере один носитель, разбавитель, усилитель абсорбции, консервант, буфер, агент для регулировки осмотического давления и реологии лекарственного средства, если фармацевтическая композиция будет представлена как жидкость, и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, растворитель, средство, способствующее распаду таблетки, микрокапсулу, наполнитель, добавку, способствующую скольжению, подкрашивающий агент, агент, способствующий улучшению вкуса и запаха и другой ингредиент. Эти общеизвестные соединения обычно используют таким образом, как это известно из предшествующего уровня техники. Тиоморфолиновые производные стероидов согласно настоящему изобретению предпочтительно входят в состав фармацевтических композиций в эффективном количестве.

Примерами твердых носителей являются карбонат магния, стеарат магния, декстрин, лактоза, сахар, тальк, желатина, пектин, крахмал, силикагель, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, низкоплавкие воски и масло какао.

Жидкие композиции включают стерильные растворы, суспензии и эмульсии, которые можно вводить, например, перорально, посредством назального введения или в виде мази. Такие жидкие композиции также могут быть пригодными для инъекций или для применения в связи с употреблением ex vivo или in vivo. Для перорального введения жидкость может содержать фармацевтически приемлемое масло и/или липофильный агент, поверхностно-активное вещество и/или растворитель, который смешивается с водой. В этой связи можно сослаться на опубликованную заявку WO 97/21440 А1.

Жидкие композиции также могут содержать другие ингредиенты, которые принято использовать, как известно из предшествующего уровня техники, некоторые из них упомянуты в приведенном выше перечне. Дополнительно композиция для трансдермального введения соединения согласно настоящему изобретению может быть представлена в виде пластыря. Композиция для назального введения может быть представлена в виде назального спрея в жидкой или порошкообразной форме.

Для того чтобы повысить биодоступность тиоморфолинового производного стероида, эти соединения также могут быть представлены в виде клатратов с циклодекстрином, с этой целью соединения смешивают с -, – или -циклодекстрином или его производными.

Бальзамы, мази, лосьоны и другие жидкости, предназначенные для наружного введения, должны находиться в таком виде, чтобы тиоморфолиновые производные стероидов согласно настоящему изобретению могли быть доставлены пациенту, нуждающемуся в регулировании мейоза, в достаточном количестве. Для этого лекарственное средство содержит вышеуказанные наполнители, предназначенные для регулирования реологии лекарственного средства, и другие добавки, дополнительные соединения для увеличения проницаемости через кожу и защищающие кожу вещества, такие как кондиционеры и регуляторы влажности.

Лекарственное средство также может содержать другие активные агенты, предназначенные для усиления или регулирования эффективности тиоморфолиновых производных стероидов или для достижения лекарственным средством других необходимых эффектов.

Для парентерального введения производные стероидов могут быть растворены или суспендированы в фармацевтически приемлемом разбавителе. Масло очень часто используют в комбинации с растворителями, поверхностно-активными веществами, суспендирующими или эмульгирующими агентами, например, такими как оливковое масло, арахисовое масло, соевое масло, касторовое масло и подобные агенты. Для получения лекарственного средства для инъекций может быть использован любой жидкий носитель. Такие жидкости также часто содержат агенты для регулирования вязкости, а также агенты для регулирования изотоничности жидкости.

Тиоморфолиновое производное стероида, кроме того, может быть введено в виде депо или в виде имплантата, который может быть введен, например, подкожно, таким образом чтобы было возможно замедленное высвобождение тиоморфолиновых производных стероидов. Для этого могут быть использованы различные методики, например, введение через депо, которое включает мембрану, содержащую активное соединение, или введение через медленно растворяющееся депо. Имплантаты могут содержать, например, биологически разлагаемые полимеры или синтетические силиконы в качестве инертного вещества.

Доза используемого тиоморфолинового производного стероида будет определяться лечащим врачом и будет зависеть, среди прочего, от конкретного вида используемого производного стероида, от способа введения и цели применения. Как правило, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению получают посредством тщательного перемешивания активного соединения с жидкими или твердыми вспомогательными веществами и затем, если необходимо, придания композиции необходимой формы.

Обычно млекопитающим, например человеку, вводят не более чем 3000 мг, предпочтительно не более чем 350 мг, и в некоторых предпочтительных случаях не более чем 30 мг производного стероида, в день.

Настоящее изобретение также относится к применению тиоморфолиновых производных стероидов общей формулы I для получения композиции, пригодной для регулирования репродукции, например, мейоза. Такую композицию предпочтительно применяют как лекарственное средство.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению новых тиоморфолиновых производных стероидов общей формулы I для получения контрацептивного средства или лекарственного средства, повышающего фертильность.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению тиоморфолинового производного стероида общей формулы I для применения non-in vivo (не в организме).

Настоящее изобретение также относится к способу регулирования репродукции, например мейоза, включающему введение пациенту, нуждающемуся в таком регулировании, эффективного количества по меньшей мере одного тиоморфолинового производного стероида общей формулы I.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу повышения способности ооцитов к развитию внутри организма млекопитающего, включающему контактирование ооцита, выведенного из организма млекопитающего организма млекопитающего с тиоморфолиновым производным стероида общей формулы I.

Термин «регулирование репродукции», например, мейоза, используется в тексте настоящей заявки для того, чтобы показать, что соединения согласно настоящему изобретению особенно подходят для стимулирования репродукции, например мейоза ооцитов у млекопитающих, в частности у человека, таким образом, что эти соединения представляют собой агонистические аналоги встречающегося в природе активирующего мейоз соединения (FF-MAS), соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы при лечении бесплодия, которое является следствием недостаточного стимулирования мейоза у мужчин и женщин.

Способ введения композиций, содержащих соединение согласно настоящему изобретению, может представлять собой любой способ, который эффективно обеспечивает транспортировку активного производного стероида к месту его действия.

Таким образом, в том случае, когда производные стероида нужно ввести млекопитающему, такие соединения удобно использовать в составе фармацевтической композиции, которая включает по меньшей мере одно тиоморфолиновое производное стероида согласно настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Для перорального применения такие композиции предпочтительно использовать в виде таблеток или капсул.

Тиоморфолиновые производные стероидов могут быть синтезированы по аналогии с синтезом известных соединений. Поэтому синтез производного стероидов формулы I может проходить согласно хорошо известным синтетическим подходам, описанным в разнообразной литературе, посвященной стерину и стероидам. Следующие литературные источники могут быть использованы как ключевая информация для проведения синтеза: L.F.Fieser & М.Fieser: Steroids, Reinhold Publishing Corporation, N.Y., 1959; Rood’s Chemistry of Carbon Compounds (ed.: S.Coffrey): Elsevier Publishing Company, 1971; и в особенности: Dictionary of Steroids (eds.: R.A.Hill, D.N.Kirk, H.L.J.Makin, G.M.Murphy), Chapman & Hall, эти источники информации включены в текст настоящей заявки в качестве ссылки. Последний источник информации содержит обширный перечень оригинальных статей, опубликованных за период вплоть до 1990 года.

Настоящее изобретение также специально относится к способу получения (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола (соединение IA), способ включает следующие стадии:

использование в качестве исходного соединения (20S)-20-гидроксиметил-прегна-4-ен-3-она;

введение двух алкильных групп в С⁴ посредством алкилирования;

восстановление кетогруппы в гидроксигруппу;

защиту полученной гидроксигруппы ацильной группой, предпочтительно бензоильной группой;

введение двойной связи ⁷ посредством бромирования/дегидробромирования;

изомеризацию диена ^5,7 в диен ^8,14 посредством нагревания в присутствии кислоты;

окисление 20-гидроксигруппы в альдегидную группу;

восстановительное аминирование альдегидной группы тиоморфолином и удаление бензоильной группы посредством реакции восстановления.

Соответствующая схема синтеза для первого способа синтеза приведена на фиг.1 (схема 1). В соответствии с этим, сначала гидроксигруппу в боковой цепи (20S)-20-гидроксиметил-прегна-4-ен-3-она 1 защищают введением группы силилового простого эфира, например, такой как группа триизопропил-силилового (TIPS) простого эфира, получая при этом соединение 2 (стадия способа а). Для того чтобы получить соединение 3, две метильные группы вводят посредством алкилирования с использованием метилиодида в присутствии основания, например, такого как трет-бутоксид, калия, в С⁴ стероидного скелета (стадия способа б). На следующей стадии 3-кетогруппу восстанавливают, используя обычный восстанавливающий агент, например, такой как литийалюминийгидрид или боргидрид натрия (стадия способа в). Полученный спирт 4 затем защищают, например, как бензоат (соединение 5; стадия способа г). После этого вводят вторую двойную связь посредством последовательного бромирования/дегидробромирования (стадия способа д). Полученную ^5,7-диеновую систему соединения 6 затем подвергают изомеризации в ^8,14-диеновую систему посредством нагревания в присутствии хлороводородной кислоты с получением при этом соединения 7 (стадия способа д). На этой катализируемой кислотой стадии снимается защита только гидроксильной группы в боковой цепи и при этом получают соединение 7. В результате селективного окисления гидроксигруппы в боковой цепи периодинаном Десс-Мартина (Dess-Martin-Periodinane) получают альдегид 8 (стадия способа ж), который служит промежуточным соединением для введения тиоморфолинового фрагмента в боковой цепи посредством восстановительного аминирования. Для этой цели могут быть использованы различные восстанавливающие агенты, например, такие как боргидрид натрия или трис-(ацетокси)-боргидрид. После восстановительного аминирования снятие защиты – 3-бензоатной группы осуществляют в восстановительных условиях с использованием LiAlH₄ в одну стадию (стадия способа з). В результате получают производное стероида I согласно настоящему изобретению.

Вместо получения бензоата на стадии способа г) возможно осуществлять введение другой защитной ацильной группы, например, такой как ацетильная группа. В том случае, когда происходит промежуточное образование ацетата вместо бензоата, удаление защиты гидроксигруппы на стадии способа д) происходит не только в боковой цепи, но также и при С³. В этом случае селективное окисление в соответствующий альдегид должно быть проведено осторожно, для того чтобы предотвратить окисление гидроксигруппы при С³. Если вместо этого на стадии способа г) образуется бензоат, то окисление может протекать только по гидроксигруппе в боковой цепи. Вследствие того, что после стадии способа г) полученный продукт кристаллизуется, если использована бензоатная защитная группа, возможна более простая очистка промежуточного соединения 8. Кроме того, это позволяет проводить меньше стадий очистки. Таким образом, образование бензоата является предпочтительным.

В отношении синтеза производного стероидов без метильной группы у С⁴ и/или с другим расположением двойных связей в стероидном скелете, можно указать опубликованную международную заявку WO 02/079220 А2, которая входит в текст настоящей заявки в качестве ссылки.

Для более подробного описания настоящего изобретения приводятся примеры.

Пример 1: (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол (соединение IA)

а) (20S)-20-[((Триизопропилсилил)окси)метил]прегна-4-ен-3-он

(Стадия способа а)

К раствору 30 г (20S)-20-[(гидроксиметил]прегна-4-ен-3-она и 13,5 г имидазола в 300 мл дихлорметана добавляют по каплям 26 мл триизопропилсилилхлорида при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 20 часов при той же температуре и затем выливают в воду. Водный слой экстрагируют этилацетатом. Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором соли, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая при этом 45,4 г неочищенного (20S)-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-4-ен-3-он в виде коричневого маслянистого вещества, которое используют без дополнительной очистки.

Масс-спектр (CI+): 487 (М+Н).

б) (20S)-4,4-Диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5-ен-3-он

(Стадия способа б)

Раствор 45,4 г неочищенного (20S)-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-4-ен-3-она в 320 мл тетрагидрофурана добавляют к раствору 42,3 г трет-бутипата калия в 950 мл трет-бутанол при температуре 50°С. Полученную смесь перемешивают в течение 10 минут при той же самой температуре. Затем добавляют 50 мл метилиодида и перемешивание продолжают в течение 1 часа. Реакционную смесь выливают в воду и экстрагируют этилацетатом. Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором соли, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией, получая при этом 27,3 г (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5-ен-3-она в виде бледно-желтого кристаллического вещества.

Масс-спектр (CI+): 515 (М+Н).

в) (20S)-4,4-Диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5-ен-3-ол

(Стадия способа в)

К раствору 27,3 г (208)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)-окси)метил]прегна-5-ен-3-она в 500 мл тетрагидрофурана осторожно небольшими порциями добавляют 1,24 г литийалюминийгидрида при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение одного часа и затем охлаждают до 0°С. Добавляют последовательно 2,5 мл воды, 2,5 мл 1 Н раствора гидроксида натрия и 7,5 мл воды. Полученную смесь фильтруют через целит. Полученный фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией, получая при этом 18,2 г (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5-ен-3-ола в виде бледно-желтого твердого вещества.

Масс-спектр (CI+): 517 (М+Н).

г) Ацетат (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5-ен-3-ола

(Стадия способа г)

К раствору 18,2 г (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)-окси)метил]прегна-5-ен-3-ола в 175 мл пиридина добавляют 6,24 мл ангидрида уксусной кислоты при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 20 часов и затем выливают в смесь льда и хлороводородной кислоты. Затем проводят экстракцию этилацетатом. Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором соли, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая при этом 16,2 г ацетата (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5-ен-3-она в виде белого твердого вещества, которое используют без дополнительной очистки.

Масс-спектр (CI+): 559 (М+Н).

д) Ацетат (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5,7-диен-3-ола

(Стадия способа д)

К раствору 16,2 г ацетата (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5-ен-3-ола в смеси 100 мл бензола и 100 мл гексана добавляют порциями 4,93 г 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин при 70°С. Через 30 минут полученную смесь охлаждают до 0°С и фильтруют. Фильтрат упаривают в вакууме.

К полученному остатку добавляют 160 мл толуола и 7,8 мл 2,4,6-триметилпиридина. Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2,5 часов. После охлаждения реакционную смесь промывают 1 Н раствором хлороводородной кислоты, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором соли. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают в вакууме. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией, получая при этом 12,5 г ацетата (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5,7-диен-3-ола в виде белого твердого вещества.

Масс-спектр (CI+): 557 (М+Н).

д) (20S)-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-3,21-диол

(Стадия способа д)

Смесь 16,1 г ацетата (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)-окси)метил]прегна-5,7-диен-3-ола, 210 мл этанола, 28 мл бензола и 28 мл концентрированной хлороводородной кислоты кипятят с обратным холодильником в течение 6 часов. После охлаждения полученную смесь выливают в насыщенный раствор бикарбоната натрия, экстрагируют этилацетатом и промывают насыщенным раствором соли. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток перекристаллизовывают из дихлорметана и метанола, получая при этом 4,48 г (20S)-21-гидрокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-3-ола.

Масс-спектр (EI+): 358 (М).

ж) (20S)-3-Гидрокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-21-аль

(Стадия способа ж)

К раствору 1 г (20S)-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-3,21-диола в 10 мл дихлорметана добавляют 5,4 мл 0,5 М раствора периодинана Десс-Мартина при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивают в течение одного часа, выливают в насыщенный раствор бикарбоната натрия, экстрагируют этилацетатом и промывают насыщенным раствором соли. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией, получая при этом 230 мг (20S)-3-гидрокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-21-аля в виде белого твердого вещества.

Масс-спектр (EI+): 356 (М)

з) (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол

(Стадия способа з)

38 мг трис-(ацетокси)боргидрида натрия добавляют к раствору 42 мг (20S)-3-гидрокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-21-аля и 20 мкл тиоморфолина в 3 мл тетрагидрофурана при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивают в течение двух часов, выливают в насыщенный раствор бикарбоната, экстрагируют этилацетатом и промывают насыщенным раствором соли. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией, получая при этом 15 мг (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола в виде белого твердого вещества.

Масс-спектр (EI+): 443 (М)

ЯМР-спектры соответствуют указанной структуре соединения.

Структуру соединения также подтверждают данными рентгеновского структурного анализа.

Пример 2: Взаимодействие согласно схеме реакции 1, фиг.1

Реакции согласно примеру 1 повторяют, используя бензоатный аналог промежуточного соединения для соединений 5, 6, 7 и 8. Для этого условия проведения реакции на нескольких стадиях модифицируют следующим образом:

Стадия способа a): TIPSCl, имидазол, СН₂Cl₂, комнатная температура, время реакции 4 часа.

Стадия способа б): трет-бутилат калия, метил иодид, трет-бутапол, комнатная температура, время проведения реакции 30 минут.

Стадия способа в): LiAlH₄, тетрагидрофуран, комнатная температура, время проведения реакции 30 минут.

Стадия способа г): бензоилхлорид, пиридин, 0°С, время проведения реакции 1 час; кристаллизация; выход 52% для 4 стадий.

Стадия способа д): 1,3-дибром-5,5-диметил-имидазолин-2,4-дион, бензол, гексан, 70°С, время проведения реакции 30 минут; затем 2,4,6-триметилпиридин, толуол, кипячение с обратным холодильником, время проведения реакции 2 часа.

Стадия способа д): HCl, этанол, кипячение с обратным холодильником, время проведения реакции 4 часа, хроматография; выход 70% для 2 стадий.

Стадия способа ж): периодинан Десс-Мартина, СН₂Cl₂, комнатная температура.

Стадия способа з): тиоморфолин, NaBH(OAc)₃, тетрагидрофуран, комнатная температура, время проведения реакции 6 часов;

затем взаимодействие LiAlH₄, комнатная температура; время проведения реакции 18 часов, хроматография и кристаллизация из этанола (2×), выход: 19% для 2 стадий, очистка (чистота >93%).

Суммарный выход для этой последовательности реакций составляет 6,9% для восьми стадий.

подробное описание последовательности реакций и условий проведения реакций приводятся ниже:

а-г) (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5-ен-3-ол бензоат (соединение 5, см. схему, представленную на фиг.1)

(Стадии способа а, б, в и г)

Это соединение синтезируют по аналогии с синтезом ацетатного производного, описанным в примере 1, стадии способа а, б, в и г, методика синтеза также описана в: Organic Letters, 5, 1837-1839 (2003). После бензоилирования проводится только одна стадия очистки – кристаллизация. Суммарный выход на стадиях а, б, в и г составляет 52%.

д) (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)окси)метил]прегна-5,7-диен-3-ол бензоат (соединение 6, см. схему, представленную на фиг.1)

(Стадия способа д)

К раствору 30,0 г (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропилсилил)-окси)метил]прегна-5-ен-3-ол бензоата в смеси 160 мл бензола и 160 мл гексана 9,81 г добавляют порциями 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин при 70°С. Через 30 минут полученную смесь охлаждают до 0°С и фильтруют. Полученный фильтрат упаривают в вакууме.

К полученному остатку добавляют 280 мл толуола и 12,7 мл 2,4,6-триметилпиридина. Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2,5 часов. После охлаждения реакционную смесь промывают 0,5 Н раствором хлороводородной кислоты, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором соли. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают в вакууме, получая при этом 31,8 г неочищенного (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропил)окси)метил]прегна-5,7-диен-3-ол бензоата, который используют без дополнительной очистки.

д) (20S)-3-бензоилокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-21-ол (соединение 7, см. схему, представленную на фиг.1)

(Стадия способа д)

Смесь 31,8 г (20S)-4,4-диметил-20-[((триизопропил)окси)метил]прегна-5,7-диен-3-ол бензоата, 467 мл этанола, 67 мл бензола и 67 мл концентрированной хлороводородной кислоты кипятят с обратным холодильником в течение в течение 5 часов. После охлаждения полученную смесь выливают в насыщенный раствор бикарбоната натрия, экстрагируют дихлорметаном и промывают насыщенным раствором соли. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией, получая при этом 15,7 г (20S)-3-бензоилокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-21 -ола.

ж) (20S)-3-бензоилокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-21-аля (соединение 8, см. схему, представленную на фиг.1)

(Стадия способа ж)

К раствору 17,6 г (208)-3-бензоилокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-21-ола в 470 мл тетрагидрофурана и 4,1 мл пиридина 17,3 мл добавляют периодинан Десс-Мартина при 0°С. Полученную смесь перемешивают в течение 30 минут, нагревают до комнатной температуры, выливают в цитратный буфер с рН 7, экстрагируют дихлорметаном и промывают насыщенным раствором соли. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая при этом 17,6 г неочищенного (20S)-3р-бензоилокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-21-аля, который используют без дополнительной очистки.

з) (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол (соединение I, см. схему, представленную на фиг.1)

(Стадия способа з)

3,9 г трис-(ацетокси)боргидрида натрия добавляют к раствору 8,8 г неочищенного (20S)-3-бензоилокси-4,4,20-триметил-прегна-8,14-диен-21-аля и 2,7 мл тиоморфолина в 400 мл тетрагидрофурана при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивают в течение двух часов, затем добавляют порциями 10,56 г литийалюминийгидрида, останавливают реакцию добавлением NaOH и воды, экстрагируют этилацетатом и промывают насыщенным раствором соли. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной хроматографией и проводят две последовательных перекристаллизации из этанола, получая при этом 1,67 г (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4,-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола в виде белого твердого вещества (1,43 г + 0,24 г, получают две партии после перекристаллизации).

Все соединения характеризуют посредством ¹Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектроскопии. Окончательным подтверждением структуры (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола (соединение IA) являются полученные данные рентгеноструктурного анализа.

Химические и физико-химические характеристики и композиции (растворимость)

Можно показать, что введение азотсодержащей боковой цепи повышает растворимость соединений в воде (измерение проводится посредством турбодиметрии).

Растворимость FF-MAS в воде, как было установлено, составляет только <0,1 мг/л. Растворимость (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола (соединение IA) в воде, по данным измерений, составляет ˜ 4 мг/л.

Созревание ооцитов in vitro и оплодотворение (система биологических тестов)

а) Исследование ооцитов, окруженных кумулюсом (совокупностью оболочек):

Подробное описание теста:

Активация ооцитов, задержка которых вызвана MI, может быть установлена посредством оценки исчезновения зародышевого пузырька (GV) (GV – сокр. от англ. germinal vesicle). Исчезновение зародышевого пузырька, называемое разрывом зародышевого пузырька (GVB) (GVB – сокр. от англ. germinal vesicle breakdown) происходит после выделения первого полярного тельца (РВ – сокр от англ. polar body) (С.Grendahl, J.L.Ottesen, M.Lessi, P.Faarup, A.Murray, FC Grenvald, C.Hegele-Hartung, I.Ahnfelt-Renne, ” Meiosis-activating sterol promotes resumption of meiosis in mouse ovocytes cultured in vitro in contrast to related oxy sterols”, Biol. Reprod., 58, 1297-1302 (1998); С.Hegele-Hartung, J.Kuhnke, M.Lessi, C.Grendahl, J.Ottesen, H.M.Beier, S.Eisner, U.Eichenlaub-Ritter, “Nuclear and cytoplasmic maturation of mouse ovocytes after treatment with synthetic meiosis-activating sterol in vitro”, Biol. Reprod., 61, 1362-1372 (1999)).

Ооциты, окруженные кумулюсом (СЕО), получают от незрелых мышей-самок (C57BL/6J × DBA/2J F1), масса тела которых составляет 13-16 граммов, мышей-самок содержат при контролируемых температуре (20-22°С), освещении (освещение от 6.00 до 18.00) и относительной влажности (50-70%). Мыши получают внутрибрюшинную инъекцию 0,2 мл гонадотропинов, содержащую 20 межд. Ед, (IU) FSH (фолликулостимулирующий гормон). Через 48 часов животных умерщвляют цервикальной дислокацией. Яичники иссекают и ооциты выделяют в Нх-среду (см. ниже) под стереомикроскопом посредством выполняемого вручную разрушения фолликулов с использованием пары игл 27 размера. Ооциты, окруженные кумулюсом, представляющие неповрежденный зародышевый пузырек, помещают в -минимальную эссенциальную среду (-МЕМ без рибонуклеозидов, поддерживаемую 8 мг/мл сывороточного альбумина человека (HSA), 0,23 мМ пирувата, 2 мМ глутамина, 100 межд. Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Для того, чтобы содержать ооциты на стадии зародышевого пузырька, эту среду поддерживают, используя 3 мМ гипоксантина, такую среду обозначают как Нх-среда.

Готовят разбавления (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола (соединение IA), исходя из исходного раствора с концентрацией 1 мг/мл, раствор в этаноле. Добавление этанола (3,8 мкл/мл) к контрольным растворам не влияет на контрольный уровень. Ооциты, окруженные кумулюсом (35-45 СЕО в 0,4 мл Нх-среды) культивируют во влажной атмосфере с 5% СО₂ в воздушной среде 24 часа при 37°С. При культивировании всегда имеется одна контрольная лунка без добавления тестируемых соединений (идентичная среда без добавления тестируемых соединений).

К концу периода культивирования подсчитывают количество ооцитов, окруженных кумулюсом (СЕО) с зародышевым пузырьком (GV), количество разрывов зародышевого пузырька (GVB) и количество полярных телец (РВ), соответственно. Подсчитывают % GVB, определяемый как процент ооцитов, окруженных кумулюсом (СЕО), претерпевающих разрыв зародышевого пузырька (GVB) от суммарного числа ооцитов, окруженных кумулюсом (СЕО) в этой лунке, следующим образом:

% GVB = (количество GVB + количество РВ / суммарное количество СЕО) × 100

Значение % РВ определяют как процент ооцитов, окруженных кумулюсом (СЕО) и выделяющих одно полярное тельце по отношению к суммарному количеству ооцитов, окруженных кумулюсом (СЕО) в этой лунке.

Результаты

На фиг.2 показана активация мейоза при воздействии соединения (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол (соединение IA) на ооциты, окруженные кумулюсом (СЕО), контролируемая посредством оценки GVB и РВ (n=5; *p<0,05). Новое соединение IA значительно увеличивает активацию мейоза при концентрации 1 мкМ (p<0,01; n=10), при концентрации 3 мкМ (p<0,05; n=7) и при концентрации 10 мкМ (p<0,001; n=6).

Те же самые эксперименты повторяют с другими новыми соединениями:

IБ: (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8(14)-ен-3-ол,

IB: (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-5-прегна-8,14-диен-3-ол,

IГ: (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-прегна-5,7-диен-3-ол и

IД: (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-5-прегна-8(14)-ен-3-ол.

Полученные результаты относительно активации мейоза в присутствии гипоксантина (Нх) в ооцитах, окруженных кумулюсом (СЕО), приведены в таблице 1. Для каждого соединения проводили два эксперимента и полученные данные сравнивали с данными для системы Нх-среда, используемой в качестве контроля, и с данными для FF-MAS при концентрации, составляющей 10 мкМ.

В дополнение, зависящую от концентрации активацию мейоза в в СЕО присутствии Нх определяют с использованием соединения IД, которое, в дополнение к соединению IA, является наиболее эффективным протестированным соединением. Зависящую от концентрации соединения активацию мейоза сравнивают с данными для системы Нх-среда, для FF-MAS и для соединения (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол (описано в опубликованной международной заявке WO 02/079220 А2 как соединение №2), полученные данные приведены в приведены в таблице 2.

б) Оплодотворение in vitro (IVF)

Для того чтобы исследовать воздействие соединения (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол (соединение IA) на соотношение оплодотворения ооцитов, окруженных кумулюсом, in vitro, ооциты, окруженные кумулюсом, подвергали созреванию in vitro в присутствии или при отсутствии этого нового соединения с последующим оплодотворением in vitro (IVF). Соединение FF-MAS и соединение (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол (описано в опубликованной международной заявке WO 02/079220 А2 как соединение №2) используют в качестве контрольных соединений. Поскольку среда для созревания in vitro в клинических условиях не будет содержать гипоксантина, новые соединения не используют в какой-либо среде, которая может приводить к почти 100%-ной активации мейоза ооцитов вследствие спонтанного мейотического созревания. Таким образом, вероятно, что изменения в последующем оплодотворением in vitro (IVF – сокр. от англ. in vitro fertilization) будут результатом воздействия тестируемых соединений на цитоплазматическое созревание.

Незрелых мышей-самок (C57BL/6J × DBA/2J F1) в возрасте 21-24 дня используют в качестве доноров ооцитов. Животные получают i.p. (внутрибрюшинную) инъекцию 10 межд. Ед. (IU) гонадотропина из сыворотки жеребой кобылы (PMSG – сокр от англ. pregnant mare serum gonadotropin) для индуцирования роста фолликулов. Через 48 часов животных умерщвляют цервикальной дислокацией и иссекают яичники. В качестве доноров спермы использовали мышей-самцов в возрасте восемь недель (C57BL/6J × DBA/2J F1).

Ооциты выделяют из яичников посредством выполняемого вручную разрушения фолликулов с использованием пары игл 27 размера. Сферические голые (лишенные кумулюса) ооциты (NkO – сокр. от англ. spherical naked oocyte) и ооциты, окруженные кумулюсом (СЕО), представляющие неповрежденный зародышевый пузырек (GV) отбирают и помещают в -миниальную эссенциальную среду (-МЕМ без рибонуклеозидов, фирма «Gibco BRL», Гейтерсбург; номер по каталогу 22561), поддерживаемую 8 мг/мл сывороточного альбумина человека (HSA), 0,23 мМ пирувата, 2 мМ глутамина, 100 межд. Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Ооциты промывают три раза культуральной средой без маслянистого поверхностного слоя в 4-луночных планшетах, содержащих 0,4 мл соответствующей культуральной среды. Ооциты культивируют при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂, на воздухе в присутствии (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола (соединение IA), соединения FF-MAS и (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола, соединения, указанные последними, служат для сравнения.

Содержащую ооциты культуральную среду поддерживают 6,4%-ной фетальной телячьей сыворотки (ФТС). Растворы нового соединения IA и двух соединений, служащих для сравнения и указанных выше, получают из исходного раствора, содержащего 1 мг/мл соединения, растворенного в абсолютном этаноле. Контрольную группу культивируют с соответствующим количеством этанола.

После культивирования в течение 18-19 часов ооциты дополнительно подвергают оплодотворению in vitro. Под «созревшими in vitro» понимают только такие ооциты, которые претерпели либо GVB или РВ. Ооциты быстро промывают, не используя какие-либо тестируемые соединения, и затем переносят в заранее подготовленные чашки Петри для проведения оплодотворения, которые содержат приблизительно 600000 подготовленных сперматозоидов на 500 мкл IVF-среды (получены из эпидидимиса мышей-самцов). Чашки Петри затем инкубируют в заданных условиях (5% СО₂ в воздушной атмосфере) при 37°С в модифицированной -МЕМ IVF-среде, поддерживаемой 8 мг/мл сывороточного альбумина человека (HAS), 0,23 мМ пирувата, 100 межд. Ед. пенициллина/мл и 100 мкг стрептомицина/мл, как описано выше для созревания ооцитов.

Исследование ооцитов проводят через 22-24 часа после оплодотворения для того, чтобы установить оплодотворение и зарегистрировать количество пронуклеуса (PN – сокр от англ. pronucleus) и эмбрионов на стадии 2 клеток. Соотношение оплодотворения определяют как количество ооцитов, которые достигли стадию PN или стадию 2-клеточного эмбриона, по отношению к суммарному количеству случаев оплодотворения.

Результаты:

На фиг.3 показано повышение коэффициента оплодотворения ооцитов мышей, которые были обработаны новыми соединением IA и двумя вышеуказанными соединениями, (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол (соединение №2) или FF-MAS, по сравнению с контролем с растворителем (*p<0,05; ***p<0,001; n=18). На фиг.3а приведены значения в процентах от суммарного числа ооцитов, использованных в эксперименте (приблизительно 100 ооцитов на группу для каждой из групп, участвовавших в эксперименте). На фиг.3б приведены данные для стимуляции, нормализованной по отношению к группе, получавшей только наполнитель.

Исследование обратного переноса

Оплодотворение in vitro осуществляли таким образом, как описано выше для эксперимента по оплодотворению in vitro (IVF/

За день перед обратным переносом реципиентов – мышей-самок (приемные матери), находящихся на стадии проэструса (предтечки) спаривали с подвергнутыми вазэктомии мышами-самцами для того чтобы вызвать мнимую беременность. Через один день проводили вагинальное исследование. Животных с положительной, не содержащей спермы пробой (успешное спаривание) использовали для проведения исследования. Этот день обозначали как день 0 беременности (= день 0 после стерильной копуляции, день 0 р.с.). Восемнадцать 2-клеточных эмбрионов переносят в правую трубу приемной матери в день 0 после стерильной копуляции под анестезией. Расположенную напротив латеральную трубу оставляют неиспользованной (проверка в отношении мнимой беременности). Приемных матерей умерщвляют на 19-й день беременности. Плод удаляют и подвергают исследованию. Яичники и матки сразу же удаляют для того, чтобы зарегистрировать количество участков имплантации, живых и мертвых плодов и резорбции. Матки явно не беременных особей помещают в 10%-ный водный раствор сульфида аммония на приблизительно 10 мин для того, чтобы окрасить возможные участки имплантации в эндометрии (слизистой оболочке матки). Живые плоды по отдельности взвешивают и определяют их пол посредством исследования их гонад.

При исследовании фертильности 269 мышей случайным образом разделяют на 6 групп и имплантируют 7-10 in vitro фертилизованных зрелых яйцеклеток. Оплодотворение in vitro происходит в присутствии растворителя (группа 1) или соединения (группы 2-6). Группы распределились таким образом, как показано в таблице 3.

Эффект повышения фертильности при воздействии соединений по сравнению с контролем с растворителем представляет собой главный интерес. Кроме того, также изучалось улучшение по сравнению с соединением FF-MAS.

Переменные, представляющие первоочередной интерес – количество участков имплантации и количество живых плодов.

Методы

Данные относительно участков имплантации и живых плодов, как рассматривается, имеют двоичное представление, т.е. они могут быть выражены как коэффициент или как количество успешных исходов и неудач по отношению к перенесенным зрелым яйцеклеткам. Подходящие методы анализа данных представлены в: D. Collett: “Modelling Binary Data”, 2^nd edition, Chapman & Hall / CRC, Boca Raton.

Поскольку для интерпретации полученных данных используется перевес успешных исходов в одной группе по сравнению с перевесом успешных исходов в другой группе, анализ сконцентрировался на вычислении соотношений перевеса. Соотношение перевеса одной группы по сравнению с другой группой определяют следующим образом:

соотношение перевеса (группа 1, группа 2) (обозначается как or_1,2):

or_1,2=перевес (группа 1)/перевес (группа 2)

где перевес группы может быть может быть определен как количество успешных исходов, поделенное на количество неудачных исходов в данной группе.

Для установления статической значимости каких-либо данных вычисляли 95%-ные доверительные интервалы для соотношений перевеса следующим образом:

[exp(log(or_1,2)/1,96·se(log(or_1,2))); exp(log(or_1,2)+1,96·se(log(or_1,2)))]

где se(log(or_1,2)) представляет собой стандартную ошибку логарифма (log) соотношения перевеса (см: D.Collett (2003) в отношении соответствующей формулы).

Перевес одной группы может рассматриваться как значительно больший, чем перевес в другой группе, если нижний доверительный предел составляет более чем 1.

Сравнение с контролем с растворителем

В качестве основы для вычисления соотношений перевеса для всех групп рассчитывали количество успешных исходов (т.е. количество участков имплантации для числа живых плодов) и неудачных исходов (т.е. количество перенесенных зрелых яйцеклеток минус количество участков имплантации или количество живых плодов). В таблице 4 приведены эти величины и полученный перевес для исследованных шести групп.

Соотношения перевеса для пяти групп по сравнению с контролем с растворителем и соответствующие доверительные интервалы показаны в таблице 5.

В отношении количество участков имплантации соединение IA характеризуется значительным улучшением перевеса для обеих концентраций. Это новое соединение в концентрации, составляющей 1 мкМ, увеличивает перевес успешной имплантации до 51%, в то время как соединение в концентрации 10 мкМ приводит к 55% шансу удачной имплантации. Ни FF-MAS, ни соединение №2 ((20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол) не проявляют значительного улучшения перевеса.

Перевес успешных исходов в показателях жизнеспособных плодов повышается до 70% при использовании соединения IA в более низкой концентрации. Ни одна другая группа не проявляет значительных различий по сравнению с контролем с растворителем.

Сравнение с FF-MAS:

Соотношение перевеса для групп 3-6 по сравнению с FF-MAS (группа 2) и соответствующие доверительные интервалы показаны в таблице 6.

Поскольку все доверительные интервалы включает значение 1, не могут быть выявлены значительные различия между группами в отношении четырех соединений и FF-MAS.

На фиг.4 показано соотношение имплантации для перенесенных 2-клеточных эмбрионов, достигающее высоких значений для обработки соединением FF-MAS (10 мкМ) и новыми соединениями IA при концентрации 1 мкМ и 10 мкМ. Количество живых плодов показано на фиг.5. И в этот раз количество живых плодов регистрировали после обработки соединением FF MAS и новым соединением IA (1 мкМ и 10 мкМ). Соотношение беременности для каждой группы показано на фиг.6.

Примечательно, что новое соединение IA проявляет благотворное воздействие на соотношение 2-клеточных эмбрионов и бластоцистов уже в концентрации 0,1 мкМ, причем такой воздействие даже выше при концентрации 1 мкМ.

Необходимо отметить, что примеры и варианты осуществления изобретения, описанные в тексте настоящей заявки, приведены только в качестве иллюстрации, специалист в данной области техники на основе изложенного сможет осуществить различные модификации и видоизменения изобретения, а также комбинации признаков в объеме изобретения, определяемом приведенной далее формулой изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в тексте настоящей заявки, включены только в качестве ссылки.

Таблица 2 Активация мейоза в окруженных кумулюсом ооцитах (СЕО) в присутствии Нх
Активация мейоза [%]
Соединение IД			Нх (контроль)	FF-MAS	Соединение №2*)
1 мкМ	3 мкМ	10 мкМ		10 мкМ	10 мкМ
44	24	60	17	24	48
*) (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол

Таблица 3
Номер группы	Описание
1	Контроль с растворителем
2	FF-MAS, 10 мкМ
3	Соединение №2*), 1 мкМ
4	Соединение №2*), 10 мкМ
5	Соединение IА, 1 мкМ
6	Соединение IА, 10 мкМ
*) (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегнаA8,14-диен-3-ол

Таблица 4 Успешные исходы, неудачные исходы и перевес на группу
Переменная	Номер группы	Описание	Успешные исходы	Неудачные исходы	Перевес
Количество участков имплантации	1	Контроль с растворителем	86	344	0,25
	2	FF-MAS, 10 мкМ	100	335	0,30
	3	Соединение №2*), 1 мкМ	97	357	0,27
	4	Соединение №2*), 10 мкМ	90	332	0,27
	5	Соединение IA, 1 мкМ	120	317	0,38
	6	Соединение IA, 10 мкМ	123	317	0,39
Количество живых плодов	1	Контроль с растворителем	31	399	0,08
	2	FF-MAS, 10 мкМ	45	390	0,12
	3	Соединение №2*), 1 мкМ	32	422	0,08
	4	Соединение №2, 10 мкМ	37	385	0,10
	5	Соединение IA, 1 мкМ	51	386	0,13
	6	Соединение IA, 10 мкМ	40	400	0,10
*) (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол

Таблица 5 Соотношения перевеса и доверительные пределы по сравнению с контролем с растворителем
Переменная	Номер группы	Описание		95%-ный доверительный предел
			Соотношение перевеса	Вехний	Нижний
Количество участков	2	FF-MAS, 10 мкМ	1,19	0,86	1,65
Переменная участков имплантации	Номер группы	Описание		95%-ный доверительный предел
			Соотношение перевеса	Вехний	Нижний
	3	Соединение №2*), 1 мкМ	1,09	0,78	1,51
	4	Соединение №2*), 10 мкМ	1,08	0,78	1,51
	5	Соединение IA, 1 кМ	1,51	1,10	2,08
	6	Соединение IA, 10 мкМ	1,55	1,13	2,13
Количество живых плодов	2	FF-MAS, 10 мкМ	1,49	0,92	2,40
	3	Соединение №2*), 1 мкМ	0,98	0,58	1,63
	4	Соединение No, 2*), 10 мкМ	1,24	0,75	2,03
	5	Соединение IA, 1 мкМ	1,70	1,07	2,71
	6	Соединение IA, 10 мкМ	1,29	0,79	2,10
*) (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол

Таблица 6 Соотношения перевеса и доверительные пределы по сравнению с соединением FF-MAS
Переменная	Номер группы	Описание		95%-ный доверительный предел
			Соотношение перевеса	Верхний	Нижний
Количество участков имплантации	3	Соединение №2*), 1 мкМ	0,91	0,66	1,25
	4	Соединение №2*), 10 мкМ	0,91	0,66	1,25
	5	Соединение IA, 1 мкМ	1,27	0,93	1,72
	6	Соединение IA, 10 мкМ	1,30	0,96	1,76
Количество живых плодов	3	Соединение №2*), 1 мкМ	0,66	0,41	1,06
	4	Соединение №2*), 10 мкМ	0,83	0,53	1,32
	5	Соединение IА, 1 мкМ	1,15	0,75	1,75
	6	Соединение IА, 10 мкМ	0,87	0,55	1,36
*) (20S)-20-[(пиперидин-1-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол

Формула изобретения

1. Тиоморфолиновое производное стероида общей формулы I

в которой во фрагменте I’ соединения I

каждая связь между С⁵ и С⁶, между С⁶ и С⁷, между С⁷ и С⁸, между С⁸ и С⁹, между С⁸ и С¹⁴ и между С¹⁴ и С¹⁵ независимо представляет собой простую связь или двойную связь, причем по меньшей мере одна из этих связей представляет собой двойную связь, при условии, что отсутствует двойная связь в стероидном скелете исключительно между С⁵ и С⁶, и

где R⁴ и R^4′ независимо выбирают из группы, включающей водород и метил, при условии, что оба R⁴ и R^4′ одновременно не обозначают водород.

2. Производное стероида по п.1, где во фрагменте общей формулы I’ присутствует одна двойная связь между С⁸ и С¹⁴, или присутствуют две двойные связи между С⁸ и С⁹ и между С¹⁴ и С¹⁵, или присутствуют две двойные связи между С⁵ и С⁶ и между С⁷ и С⁸.

3. Производное стероида по любому из пп.1 и 2, выбранное из группы, включающей следующие соединения:

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ол:

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-5-прегна-8,14-диен-3-ол:

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-прегна-5,7-диен-3-ол:

(20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-5-прегна-8(14)-ен-3-ол:

4. Фармацевтическая композиция для активирования мейоза, включающая по меньшей мере одно тиоморфолиновое производное стероида общей формулы I по любому из пп.1-3 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, включающая производное стероида общей формулы I в эффективном количестве.

6. Применение тиоморфолинового производного стероида общей формулы I по любому из пп.1-3 для получения фармацевтической композиции, пригодной для регулирования репродукции, в частности, мейоза.

7. Применение по п.6 для применения non-in vivo (не в организме).

8. Применение тиоморфолинового производного стероида общей формулы I по любому из пп.1-3 для получения контрацептивного средства или средства, способствующего фертильности.

9. Способ регулирования репродукции, в особенности, мейоза, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком регулировании, эффективного количества по меньшей мере одного тиоморфолинового производного стероида общей формулы I по любому из пп.1-3.

10. Способ повышения способности ооцитов к развитию, включающий контактирование ооцита, извлеченного из организма млекопитающего, с тиоморфолиновым производным стероида по любому из пп.1-3.

11. Способ получения (20S)-20-[(тиоморфолин-4-ил)метил]-4,4-диметил-5-прегна-8,14-диен-3-ола, включающий:

а) использование в качестве исходного соединения (20S)-20-гидроксиметил-прегна-4-ен-3-она;

б) введение двух алкильных групп в С⁴ посредством алкилирования;

в) восстановление кетогруппы в гидроксигруппу;

г) защиту полученной гидроксигруппы ацильной группой;

д) введение двойной связи ⁷ посредством бромирования/дегидробромирования;

д) изомеризацию диена ^5,7 в диен ^8,14 посредством нагревания в присутствии кислоты;

ж) окисление 17-гидроксигруппы в альдегидную группу;

з) восстановительное аминирование альдегидной группы тиоморфолином и удаление ацильной группы посредством реакции восстановления.

12. Способ по п.11, где ацильная группа представляет собой бензоатную группу.

РИСУНКИ