Патент на изобретение №2349330

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к хроматографическому выделению биофлавоноидов. Проводят получение раствора дигидрокверцетинсодержащего сырья в водном растворе алифатического спирта C₁-С₃, по меньшей мере, один цикл хроматографии с нанесением пробы полученного раствора на колонку, заполненную гидрофобным сорбентом, и элюирование сорбента подвижной фазой, причем нанесение пробы осуществляют при концентрации спирта в растворе 1-20% об., в качестве подвижной фазы используют водный раствор того же спирта при его концентрации в растворе, по меньшей мере, на 3% превышающей концентрацию спирта в растворе, из которого осуществлено нанесение пробы, но не выше 30% об., полученный при хроматографии элюат подвергают упариванию и осадок высушивают. Изобретение позволяет обеспечить получение продукта высокой степени чистоты с высоким выходом. 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области хроматографического выделения биофлавоноидов и может быть использовано для получения высокоочищенного дигидрокверцетина, предназначенного для медицинских и фармацевтических целей, производства биологически активных добавок, в пищевой и косметической промышленности.

Известен способ выделения антоцианидов из растительного сырья путем экстракции с последующей хроматографической очисткой на бромированных полистирольных сорбентах с использованием 70% этилового спирта.

(US 6780442, 2004)

Известен способ выделения флавоноидов из растительного сырья путем экстракции с последующей хроматографической очисткой на стиролдивинилбензольном сорбенте с использованием в качестве элюента водно-спиртовых растворов.

(US 5912363, 15.06.1999)

Однако указанные способы предназначены для выделения комплекса биофлавоноидов, а не их отдельных компонентов.

Известен способ выделения биофлавоноидного комплекса из древесины лиственницы, в котором раствор дигидрокверцетинсодержащего сырья пропускают через полиамидный сорбент, осуществляют промывку разбавленным этиловым спиртом, сорбент сушат и элюируют этиловым спиртом.

(RU 2186097, 27.07.2002)

Однако данный способ не позволяет выделить дигидрокверцетин в качестве самостоятельного компонента.

Известен способ, в котором экстракт сырца, полученный в процессе переработки древесины, растворяют в смеси этилацетат/вода, полученный раствор наносят на колонку, заполненную сорбентом – мочевиной, затем, элюируют колонку сложным эфиром или кетоном элюент подвергают упариванию с получением в осадке кристаллического продукта, кристаллы промывают и сушат.

(RU 2258225, 20.08.2005).

Недостатком способа является использование в качестве элюентов сложных эфиров и кетонов, жестко нормируемых в субстанциях, что требует введения дополнительных стадий очистки. Кроме того, способ позволяет получать дигидрокверцетин только в смеси с дигидрокемферолом. Необходимость перезаполнения колонки сорбентом после каждого хроматографического цикла и низкие нагрузочные характеристики сорбента (отношение количества сырья к массе сорбента 1:100) вследствие низкой его удельной поверхности, осложняет его использование в промышленных масштабах.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения высокоочищенного дигидрокверцетина, включающий очистку водно-ацетонового экстракта жидкостной хроматографией на обращенно-фазовых сорбентах с размером частиц 5-10 мкм с использованием в качестве подвижной фазы раствора ацетона с добавкой трифторуксусной кислоты. Способ позволяет выделять продукт с чистотой более 99% для получения стандартных образцов.

(RU 2114631, 10.07.1998)

Недостатком способа является его сложность и использование дорогостоящих ВЭЖХ сорбентов, что не позволяет эффективно его масштабировать для промышленной наработки высокоочищенного дигидрокверцетина.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения высокоочищенного монокомпонентного дигидрокверцетина из дигидрокверцетинсодержащего сырья с высоким выходом и чистотой целевого продукта с возможностью его масштабирования.

Поставленная задача решается описываемым способом получения высокоочищенного дигидрокверцетина, включающим получение раствора дигидрокверцетинсодержащего сырья в полярном растворителе, по меньшей мере, один цикл хроматографии с нанесением пробы полученного раствора на колонку, заполненную гидрофобным сорбентом, и элюированием сорбента подвижной жидкой фазой, упаривание элюата, сушку полученного продукта, причем в качестве полярного растворителя используют водный раствор алифатического спирта С₁-С₃, нанесение пробы осуществляют при концентрации спирта в растворе не выше 20% об., при этом в качестве подвижной фазы используют водный раствор того же спирта при его концентрации в растворе, по меньшей мере, на 3% превышающей концентрацию спирта в растворе, из которого осуществлено нанесение пробы, но не выше 30% об.

Предпочтительно, нанесение пробы на колонку осуществляют при концентрации спирта в растворе 1-20% об., а элюирование осуществляют при концентрации спирта в растворе 12-30% об.

При осуществлении цикла хроматографии после элюирования колонку промывают спиртом и уравновешивают водным раствором спирта с концентрацией, соответствующей концентрации спирта в растворе для нанесения пробы, и осуществляют следующий цикл хроматографии.

Предпочтительно, хроматографию осуществляют в термостатируемой колонке при температуре 30-50°С.

Выбранные концентрации спирта обусловлены следующим.

При концентрации спирта менее 1% растворимость дигидрокверцетина снижается и обусловливает снижение нагрузочной емкости колонки. При увеличении концентрации спирта выше 20% дигидрокверцетин плохо удерживается на сорбенте, что снижает нагрузочную емкость колонки или приводит к проскоку уже на стадии нанесения.

Концентрация спирта при элюировании не превышает 30%, так как в этом случае происходит одновременное элюирование сопутствующих дигидрокверцетину биофлаваноидов.

Уменьшение разницы в концентрации спирта между раствором для нанесения и раствором для элюирования менее 3% значительно увеличивает время элюирования и снижает производительность процесса.

Выбранный температурный интервал обусловлен следующим.

При температуре ниже 30°С растворимость дигидрокверцетина недостаточна для высоких нагрузок. При температуре выше 50°С также снижаются нагрузочные характеристики и селективность из-за снижения сорбционного связывания.

Способ получения высокоочищенного дигидрокверцетина иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1.

6 г лавитола, содержащего 4,2 г дигидрокверцетина, растворяют в 12 мл этанола на мешалке при комнатной температуре в течение 20-30 мин. разбавляют дистиллированной водой до 190 мл, центрифугируют 10 мин при 4000 g, отделяют супернатант от осадка смол и термостатируют при 30°С.

На колонку размерами 22×180 мм, объемом 70 мл, заполненную гидрофобным сорбентом Диасорб-130-Фенил на основе силикагеля с удельной поверхностью 280-350 м²/г с привитыми фенильными группами с размером частиц 40-60 мкм, термостатированную при 30°С и уравновешенную 6,3%-ным водным этанолом (6,3% объемных в расчете на 96% этиловый спирт), наносят пробу со скоростью 20 мл/мин. Элюирование осуществляют 10%-ным раствором этилового спирта. Объем элюированной пробы составляет 500 мл.

Элюат упаривают, затем охлаждают до 4-7°С, выпавший осадок отбрасывают на стеклянный фильтр и сушат в сушильном вакуумном шкафу. Получают 3,75 г продукта с чистотой 98,5% по данным ВЭЖХ. Выход – 89%.

Колонку промывают 96%-ным этанолом (2-3 объема колонки) и уравновешивают 10%-ным раствором этанола в воде перед нанесением следующей пробы.

Пример 2.

3 г биофлавоноидного комплекса Сибел, содержащего 2,7 г дигидрокверцетина, растворяют в 10 мл метанола на мешалке при комнатной температуре в течение 20-30 мин, разбавляют дистиллированной водой до 1000 мл, центрифугируют 10 мин при 4000 g, отделяют супернатант от осадка смол и термостатируют при 50°С.

На колонку размерами 22×180 мм, объемом 70 мл, заполненную гидрофобным сорбентом Диасфер-СТ-500 на основе стиролдивинилбензола с удельной поверхностью 600-1000 м²/г с размером частиц 150-300 мкм, термостатированную при 50°С и уравновешенную 1%-ным водным метанолом, наносят пробу со скоростью 20 мл/мин. Элюирование осуществляют 11%-ным раствором метилового спирта. Объем элюированной пробы составляет 400 мл.

Элюат упаривают, охлаждают до 4-7°С, выпавший осадок отбрасывают на стеклянный фильтр и сушат в сушильном вакуумном шкафу. Получают 2,4 г продукта с чистотой 99,5% по данным ВЭЖХ. Выход – 90%.

Колонку промывают метанолом (2-3 объема колонки) и уравновешивают 1%-ным раствором метанола в воде перед нанесением следующей пробы.

Пример 3.

6 г лавитола, содержащего 4,2 г дигидрокверцетина, растворяют в 20 мл изопропилового спирта на мешалке при комнатной температуре в течение 20-30 мин, разбавляют дистиллированной водой до 100 мл, центрифугируют 10 мин при 4000 g, отделяют супернатант от осадка смол и термостатируют при 40°С.

На колонку размерами 22×180 мм, объемом 70 мл, заполненную обращенно-фазовым сорбентом Диасфер-130-C8 на основе силикагеля с удельной поверхностью 280-350 м²/г размером частиц 60-100 мкм, термостатированную при 40°С и уравновешенную 20%-ным водным изопропанолом, наносят пробу со скоростью 20 мл/мин. Элюирование осуществляют 30%-ным раствором изопропилового спирта. Объем элюированной пробы составляет 300 мл.

Элюат упаривают, охлаждают до 4-7°С, выпавший осадок отбрасывают на стеклянный фильтр и сушат в сушильном вакуумном шкафу. Получают 3,9 г продукта с чистотой 97,1% по данным ВЭЖХ. Выход – 93%.

Колонку промывают чистым изопропиловым спиртом (2-3 объема колонки) и уравновешивают 20%-ным раствором изопропилового спирта в воде перед нанесением следующей пробы.

Формула изобретения

1. Способ получения высокоочищенного дигидрокверцетина, включающий получение раствора дигидрокверцетинсодержащего сырья в полярном растворителе, по меньшей мере, один цикл хроматографии с нанесением полученной пробы на колонку, заполненную гидрофобным сорбентом, и элюированием сорбента подвижной фазой, упаривание элюата, сушку полученного продукта, отличающийся тем, что в качестве полярного растворителя используют водный раствор алифатического спирта C₁-С₃, хроматографию осуществляют в термостатированной колонке при 30-50°С, нанесение пробы осуществляют при концентрации спирта в растворе 1-20 об.%, при этом в качестве подвижной фазы используют водный раствор того же спирта при его концентрации в растворе, по меньшей мере, на 3% превышающей концентрацию спирта в растворе, из которого осуществлено нанесение пробы, но не выше 30 об.%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование осуществляют при концентрации спирта в растворе 12-30 об.%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что после элюирования колонку промывают спиртом и уравновешивают водным раствором спирта с концентрацией, равной его концентрации в растворе для нанесения пробы, и осуществляют следующий цикл хроматографии.