Патент на изобретение №2348692

(54) АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НАЙРОБИ (NAIROBI SHEEP DISEASE VIRUS)

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к аттенуированным штаммам вируса болезни Найроби (ВБН). Аттенуированный культуральный штамм вируса болезни Найроби (Nairobi sheep disease virus), депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ, инв. №2589. Изобретение может быть использовано для разработки и изготовления вакцинных препаратов против болезни Найроби в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности. 3 табл.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к аттенуированным штаммам вируса болезни Найроби (ВБН), и может быть использовано для разработки и изготовления вакцинных препаратов против болезни Найроби в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности.

В настоящее время в неблагополучных районах Африканского континента для профилактики болезни Найроби (БН) используют вирус-вакцины, изготовленные на основе аттенуированных штаммов вируса болезни Найроби, полученных из мозга новорожденных белых мышей.

В 1980 г. во ВНИИВВиМ Сафоновым Г.А. и Чистовым Ю.В. был получен вакцинный штамм ММ вируса БН путем серийного пассирования (134 пассажа) вирулентного вируса на белых мышах, активность которого составляла 6,5-7,0 lg MicLD₅₀/мл. Штамм MM в дозе 3,25 lg MicLD₅₀/мл защищал овец на 70-80% от контрольного заражения вирулентным вирусом до шести месяцев и был рекомендован для разработки живой вирус-вакцины.

Живые вирус-вакцины, полученные на основе культуральных вирусных штаммов, имеют ряд преимуществ перед применением вирус-вакцин, полученных из мозга новорожденных мышей: во-первых, можно гарантировать отсутствие в вакцине чужеродного вируса, во-вторых, концентрация вируса в таких вакцинах возрастает от серии к серии, что приводит к уменьшению дозировки и значительному снижению количества вводимого неспецифического антигенного материала, в-третьих, разработаны методы получения серий вакцин в больших объемах, что является более экономичным, к тому же риск контаминации в данном случае меньше, чем при получении вирус-вакцин из мозга мышей. Полученная таким путем вакцина дешевле из-за большого масштаба производства, так как для проверки значительного объема достаточно одного испытания на иммуногенность и отсутствие токсичности.

Целью изобретения является получение нового культурального аттенуированного штамма вируса БН, пригодного для разработки и изготовления вакцинных препаратов против этого заболевания.

Поставленная цель достигается путем клонирования и адаптации аттенуированного мозгового штамма ММ вируса БН к первично-трипсинизированной культуре клеток почки ягненка (ПЯ) и перевиваемой линии культур клеток почки сайги (ПС).

Полученный аттенуированный культуральный штамм вируса БН обозначен как штамм «ММ/К-05» и депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ под №2589 от 16.06.06 г.

Новый культуральный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства: при электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают вирусные частицы округлые или немного овальной формы, в ультратонких срезах иногда плеоморфные, диаметром 80-120 нм. Вирионы состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки толщиной 10-12 нм, на поверхности которой имеются выступы длиной 5-10 нм.

Культуральные свойства: штамма «ММ/К-05» вируса БН размножается в перевиваемых культурах клеток почки сайги (ПС) и почки овцы (ПО-ВНИИВВиМ) и в первично-трипсинизированной культуре клеток почки ягненка (ПЯ) с характерными для вируса БН цитоплазматическими изменениями с последующей деструкцией монослоя.

Способ выращивания: Штамм «ММ/К-05» культивируют в монослое перевиваемой культуре клеток ПС в стационарным и роллерным методом. При оптимальных условиях максимальное накопление вируса в перевиваемых культурах клеток составляет 6,5-7,0 lg ТЦД₅₀см³ достигается через 2-3 суток культивирования. Титр вируса в первично-трипсинизированной культуре клеток ПЯ 4,5-5,0 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве поддерживающей среды используют среду Игла MEM с 2% сыворотки КРС.

Инфекционная активность: инфекционную активность определяют титрованием в культурах клеток ПС и ПО-ВНИИВВиМ, а также путем интрацеребрального заражения мышей-сосунов.

Антигенные свойства: при подкожном введении овцам и козам штамм «ММ/К-05» вызывает образование вируснейтрализующих, преципитирующих и комплементсвязывающих антител.

Специфичность вируса: специфичность вируса определяют методом прямой иммунофлуоресценции с помощью диагностического ФИТЦ-глобулина.

Патогенностъ для человека: вирус не патогенен для человека.

Вирулентность для восприимчивых животных: штамм «ММ/К-05» безвреден для коз и овец при подкожном и внутримышечном введении.

Безвредность для лабораторных животных; для лабораторных животных (кроликов, морских свинок) не является патогенным, у белых мышей при интрацеребральном заражении вызывает гибель.

Контагиозностъ: штамм «ММ/К-05» не передается от привитых не иммунным овцам и козам при их совместном содержании.

Реактогенностъ: штамм слабореактогенен для овец и коз при подкожном введении в дозе 3,0-5,0 lg ТЦД₅₀/см³. У некоторых привитых животных отмечали повышение температуры тела до 40,1-40,5°С в течение 2-3 суток.

Иммуногенные свойства: штамм «ММ/К-05» при подкожном введении в дозе 3,0 lg ТЦД₅₀/см³. У привитых овец и коз создает иммунитет на 21 день после прививки.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами: лиофилизированный штамм «ММ/К-05» 9 пассажа в культуре клеток ПС от 16.12.05 г. не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков: Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 15 пассажей (срок наблюдения) культивирования в перевиваемой культуре клеток ПС и ПО.

Способ и срок хранения, периодичность пассажей: штамм «ММ/К-05» хранят в лиофилизированном состоянии при температуре минус 40°С и «освежают» пассированием в культуре клеток ПС один раз в пять лет.

Пример 1. Культивирование штамма «ММ/К-05» ВБН в монослое перевиваемых культур клеток ПС и ПО-ВНИИВВиМ, выращенных в матрасах.

В результате выполненных исследований были отработаны оптимальные параметры культивирования штамма, которыми являлись:

– множественность заражения – 0,01-0,05 ТЦД₃₀/кл’,

– содержание сыворотки КРС в поддерживающей среде Игла MEM-2%;

– рН среды – 7,2-7,4;

– длительность культивирования 3-4 суток;

– температурный режим 37,0±0,5°С;

– объем заполнения 1,5 л матрасов 0,2-0,25 литра.

Данные режимы культивирования позволяли получать вируссодержащий материал с активностью 6,5-7,0 lg ТЦД₅₀/см³ · Результаты наработки вирусного сырья 3 опытных серий на основе штамма «ММ/К-05» вируса БН представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы, активность 3-х серий вирусного сырья, полученного стационарным методом в культурах клеток ПС и ПО-ВНИИВВиМ, составляла 6,75-7,0 lg ТЦД₃₀/см³.

Пример 2. Сохраняемость лиофилизированного штамма «ММ/К-05» ВБН при различных температурных режимах.

Вируссодержащий материал культурального штамма «ММ/К-05» ВБН 9 пассажа в культуре клеток ПС был лиофилизирован с пептоно-лактозным стабилизатором.

Активность опытного образца после высушивания при интрацеребральном заражении мышей-сосунов составляла 6,2 lg MicLD₅₀/см³, в культуре клеток ПС 6,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Результаты исследований биологической активности штамма «ММ/К-05», хранящегося при различных температурах, представлены в табл.2.

Как видно из табл.2, лиофилизированный штамм «ММ/К -05» ВБН сохранял исходную активность в течение 12 месяцев хранения при температуре минус 40±0,5°С. При температуре хранения 2,0±2,0°С инфекционная активность вируса снижалась на 1,3 lg MicLD₅₀/см³. При температуре (37,0±0,5)°С вирус не обнаруживали уже через 1 месяц.

Полученные результаты подтверждают литературные данные о нестабильности ВБН во внешней среде при хранении выше 0°С. Оптимальными условиями хранения лиофилизированного штамма «ММ/К-05» вируса БН является температура минус 40°С.

Пример 3. Проверка реверсибельности штамма «ММ/К-05» вируса БН.

С этой целью проводят 5 пассажей штамма «ММ/К-05» на восприимчивых животных. При проведении первого пассажа культуральный вирус вводили овце 8-месячного возраста в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/см³(100 ПВД) подкожно в подмышечную область. На 7 сутки отбирали пробу крови и вводили следующему животному аналогичным образом в объеме 1,0 см (второй пассаж). Аналогично проводили третий, четвертый и пятый пассаж.

У опытных животных отсутствовала клиническая реакция на прививку, они не заболевали болезнью Найроби в течение 21 суток наблюдения после введения материала. Это указывает на то, что штамм «ММ/К-05» вируса БН не реверсибелен.

Пример 4. Проверка иммунобиологических свойств штамма.

При изучении иммунобиологических свойств за 1 прививную дозу принимали 3,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Безвредность штамма изучали на четырех овцах и двух козах 6-12 месячного возраста. Штамм «ММ/К-05» ВБН вводили подкожно в бесшерстный участок подмышечной области. Две овцы и две козы прививали вирусом в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ (100 ПВД), остальных животных (две овцы) в дозе 4,0 lg ТЦД₅₀/см³ (100 ПВД).

В течение 21 суток иммунизированные животные оставались клинически здоровыми. У трех привитых животных в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/см на 4-9 сутки отмечали повышение температуры тела до 40,1-40,5°С в течение 2-4 суток (табл.3).

Иммуногенность штамма определяли по результатам контрольного заражения привитых животных вирулентным штаммом вируса БН в дозе 1000 LD₅₀.

С этой целью двух овец и одну козу 7-9 месячного возраста прививали вирусом БН в дозе 3,0 lg ТЦД_50/см³ (1 ПВД). У одной овцы после прививки отмечали повышение температуры тела до 40,4°С.

Через 21 сутки после вакцинации всех привитых животных и одного контрольного заражали вирулентным штаммом. Вместе с этими животными заражали овец и коз, используемых в опыте по определению безвредности. Перед заражением у животных в сыворотках определяли уровень ВН-антител, накопление которых составляло 1:8-1:32.

Результаты опыта представлены в табл.3.

Контрольная овца погибла на 17-е сутки после заражения с клиническими признаками БН (температура тела 42°С, диарея, угнетение), тогда как привитые животные оставались клинически здоровыми в течение всего периода наблюдения.

Полученные данные показывают, что адаптированный к перевиваемой культуре клеток ПС штамм «ММ/К-05» создает через 21 сутки у животных, привитых в дозе 3,0 lg ТЦД₅₀/см³ иммунитет против вирулентного вируса болезни Найроби. Штамм слабореактогенен и безвреден для овец, привитых в дозах 4,0 и 5,0 lg ТЦД₅₀/см³, не реверсибелен и индуцирует образование ВН-антител.

Формула изобретения

Аттенуированный культуральный штамм вируса болезни Найроби (Nairobi sheep disease virus), депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ, инв. №2589 от 16.06.06 г., пригодный для разработки и изготовления вакцинных препаратов.