Патент на изобретение №2348038

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ НА ДОКЛИНИЧЕСКОЙ СТАДИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к нефрологии и эндокринологии. Способ диагностики доклинической стадии диабетической нефропатии у детей с инсулинозависимым сахарным диабетом при отсутствии белка при общеклиническом исследовании мочи характеризуется тем, что исследуют белковые фракции мочи, разделенные с помощью электрофореза в градиентном 8-25%-ном полиакриламидном геле с детергентом додецилсульфатом и при определении на уропротеинограмме единственной фракции альбумина молекулярной массой 67 кДа в количестве до 26 мг/л состояние пациента интерпретируют как норму; при обнаружении дополнительно к альбумину протеинов с молекулярной массой 58-156 кДа: трансферрина, гаптоглобина, IgG, постальбумина и преальбумина диагностируют клубочковую дисфункцию; при обнаружении протеинов с молекулярной массой от 10 до 58 кДа: рибонуклеазы, мономерного гемоглобина, ретинол-связывающего белка, легких цепей IgG, -микроглобулина, 1-кислого гликопротеида – диагностируют канальцевую дисфункцию; при наличии белков с молекулярной массой от 10 до 156 кДа – диагностируют сочетанное поражение. Изобретение обеспечивает диагностику нефропатии у больных сахарным диабетом на доклинической стадии, в период функциональных изменений, когда терапевтические мероприятия способствуют устранению этих изменений. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к нефрологии и эндокринологии. Способ обеспечивает диагностику нефропатии у больных сахарным диабетом на доклинической стадии, в период функциональных изменений, когда терапевтические мероприятия способствуют устранению этих изменений.

Механизмы развития поражения почек при сахарном диабете (СД) до конца неясны. В патогенезе диабетической нефропатии (ДН) имеет значение сочетание многих факторов: генетических, метаболических, иммунологических, гемодинамических, действие которых взаимосвязано и взаимообусловлено [Дедов И.И., Шестакова М.В., Миленькая Т.М. Сахарный диабет: ретинопатия, нефропатия. М.: Медицина, 2001; 175; Ракова Н.Г. Патогенез и лабораторная диагностика диабетической нефропатии (обзор литературы). Клин. лаб. диагностика 1998; 5: 3-9.]. Частота поражения почек у больных сахарным диабетом составляет 40%-50%, и у 48% из них смерть от хронической почечной недостаточности (ХПН) возникает в возрасте до 20 лет [Viberti G.C., Mackintosh D., Bilous R.W. and al. Proteinuria in diabetes mellitus: role of spontaneous and experimental variation of glycemia. Kidney Int. 1982; 21: 714-720; Пермитина М.В., Воробьева В.А., Бабаш Г.Б., Плоткина В.А., Азова Е.А. Диагностика диабетической нефропатии у детей и подростков. Рос.педиатр. журнал 2005; 6: 44-47.]. В последние годы ДН становится одной из ведущих причин ХПН во многих странах Западной Европы, США, Японии [Rychlik I., Milenberger-Miltenyi G., Ritz E. The drama of the continuous increase in end-stage renal failure in patients with type II diabetes mellitus. Nephrol. Dial. Transplant. 1998; 13: 6-10].

Выявление ДН напрямую зависит от длительности заболевания. Считается, что в течение 5 лет от начала болезни ДН не развивается. Максимальный пик развития нефропатии приходится на 15-20 лет стажа диабета. Наиболее ранний клинический признак ДН – транзиторная и, затем, постоянная протеинурия – обнаруживается на IV стадии при уже необратимых изменениях в почках [Mogensen C.E., Christensen C.K., Vittinghus E. The stages in diabetic renal disease with emphasis on the stage of incipient diabetic nephropathy. Diabetes 1983; 32: 64-78].

Третья стадия (начинающаяся ДН) проявляется микроальбуминурией. Микроальбуминурия указывает уже на необратимый патологический процесс в почках. Хотя на ранней стадии развития, она может быть ликвидирована коррекцией гипергликемии. Рациональная инсулинотерапия в течение недели снижает почечный кровоток, клубочковую фильтрацию и ликвидирует микроальбуминурию. Однако обратному развитию гипертрофии почечной ткани способствует только длительная (более 3-х месяцев) адекватная инсулинотерапия [Mogensen C.E., Christensen C.K. Predicting diabetic nephropathy in insulin-dependent patients. N. Engl. J. Med. 1984; 311: 84-93; Mogensen C.E., Christensen C.K. Blood pressure change and renal function in incipient and overt diabetic nephropathy. Hypertension 1985; 7: 64-73; Mogensen C.E. Microalbuminuria as a predictor of clinical diabetic nephropathy. Kidney Int. 1987; 31: 673-689; Rudberg S., Ullman E., Oahlquist G. Relationship between early metabolic control and the development of microalbuminuria – a longitudinal study in children with type I (insulin-dependent) diabetes mellitus. Diabethol. 1993; 36: 1309-1314].

Четвертая стадия ДН характеризуется постоянной протеинурией и повышением артериального давления. Изучение отношений структуры – функции показали, что увеличение мезангиального матрикса, потеря зарядо- и размероселективности базальной мембраны клубочков строго соотносятся с клинической манифестацией ДН [Prete D.D., Anglani F., Ceol М. and al. Molecular biology of diabetic glomerulosclerosis. Nephrol. Dial. Transpl. 1998; 13: 20-25].

С появлением клинических признаков нефропатии прогноз для жизни больного ухудшается. Морфологически выявляется диабетический гломерулосклероз. Пятая стадия ДН проявляется ХПН, и через 2-5 лет при отсутствии рациональной терапии больной погибает. Обычно от начала ДН до смерти проходит от 5 до 15 лет [Дедов И.И., Шестакова М.В., Миленькая Т.М. Сахарный диабет: ретинопатия, нефропатия. – М.: Медицина, 2001; 175].

Существующие на сегодняшний день методы лабораторной диагностики в большинстве своем не дают возможности выявлять доклинические стадии диабетической нефропатии (ДН). До настоящего времени остается открытым вопрос о том, что первично при развитии ДН – изменения клубочков или канальцев.

Однако недостатком данных способов является то, что они не позволяют диагностировать ДН на доклинической стадии, когда экскреция альбумина остается нормальной, так как именно в этот период функциональных изменений необходимо начинать лечебные мероприятия, способствующие снижению скорости прогрессирования нефропатии. Все это делает весьма актуальным разработку новых способов лабораторной диагностики поражения почек у больных инсулинозависимым сахарным диабетом (ИЗСД), тем более, что биопсия почек производится у этих больных крайне редко.

Цель настоящего изобретения является диагностика доклинической стадии диабетической нефропатии у детей с инсулинозависимым сахарным диабетом.

Технический результат достигается благодаря использованию метода автоматизированного электрофореза в градиентном полиакриламидном геле.

На основании анализа уропротеинограмм были выделены клубочковый, канальцевый и смешанный типы протеинурии. К маркерам клубочковой протеинурии относят белки с молекулярной массой более 60 кДа (альбумин, пре- и постальбумины, трансферрин, гаптоглобин, димерный альбумин, IgG). Канальцевую протеинурию определяют низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 58 кДа – рибонуклеаза, лизоцим, 2-микроглобулин, ретинол-связывающий белок, легкие цепи IgG, 1-микроглобулин, 1-кислый гликопротеид). Смешанная протеинурия представлена клубочковыми и канальцевыми протеинами.

Достоверность технического результата подтверждается исследования 203-х пациентов с сахарным диабетом I типа (112 мальчиков и 91 девочка) в возрасте от 3 до 16 лет, наблюдавшихся в эндокринологическом отделении областной детской клинической больнице №1 г.Воронежа с 1995 по 2003 год.

Всем пациентам проводилось клинико-лабораторное обследование по плану больных диабетологического и нефрологического профилей. Было выделено 2 группы: I группу составили 183 ребенка со стажем диабета 1-5 лет, не имевших эпизодов протеинурии в общеклинических анализах мочи в течение заболевания; II группу – группу сравнения – 48 детей со стажем сахарного диабета более 5 лет, имевших протеинурию (транзиторную (58,3%) или персистирующую (41,7%)) в общеклинических анализах мочи. У пациентов II группы была диагностирована ДН. В связи с длительностью наблюдения 28 больных вошли как в I, так и во II группы. Сравнительная характеристика детей приведена в таблице 1.

Как видно из таблицы, группы больных СД были сопоставимы по полу, наследственной предрасположенности и стадии заболевания, но различались по возрасту, давности болезни, по показателям биохимического анализа крови, обще клинического анализа мочи, уровню артериального давления.

Контрольную группу составили 20 здоровых детей от 3 до 16 лет, не имевших изменений в анализах крови и мочи, не болевших в течение месяца до исследования УПГ респираторно-вирусной инфекцией.

При статистической обработке результатов исследования для определения достоверности различий показателей использовался критерий t Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Было проведено исследование 251 уропротеинограммы: у 20 здоровых детей (контрольная группа), 183 больных сахарным диабетом 1 группы и 48 пациентов – II группы. На основании анализа УПГ было идентифицировано 15 белковых фракций,табл.2.

Уропротеинограммы всех обследованных в 100% случаев в своем составе имели альбумин. Альбумины, являясь основным компонентом белкового спектра плазмы крови, составляют основу и белков мочи. Уропротеинограммы здоровых детей (контрольной группы) были представлены единственной фракцией альбумина, концентрация альбумина в моче у здоровых детей не превышала 26 мг/л, в среднем 13,2±5,05 мг/л, что было определено как физиологический тип УПГ.

В I группе больных СД (без ДН, с давностью болезни 1-5 лет) частота встречаемости идентифицированных белковых фракций, кроме альбумина, не превышала 42%. Наиболее часто определялись клубочковые протеины – трансферрин (42,1%), иммуноглобулин G (41,5%), постальбумин (39,9%) и преальбумин (26,3%). Из канальцевых белков чаще выявлялись легкие цепи IgG (38,8%).

Во II группе больных (с ДН, со стажем диабета более 5 лет) все вышеперечисленные белковые фракции определялись практически у всех пациентов, достоверно чаще по сравнению с I группой (р<0,001). Обращает на себя внимание тот факт, что частота встречаемости клубочковых протеинов в обеих исследованных группах значительно превышала встречаемость канальцевых белков. У единичных детей как I, так и II группы определялись низкомолекулярные уропротеины (-следовой протеин, 2-микроглобулин, мономерный гемоглобин, ретинол-связывающий белок) без значимых различий друг с другом.

В зависимости от качественно-количественного состава белковых фракций в уропротеинограмме было выделено 4 типа протеинурии:

1 – физиологический – на УПГ определялась единственная фракция альбумина (молекулярная масса 67 кДа) в количестве до 26 мг/л;

2 – клубочковый – на УПГ, кроме альбуминовой фракции, определялись протеины с молекулярной массой 58-160 кДа, относящиеся к маркерам поражения клубочков (трансферрин, гаптоглобин, IgG);

3 – канальцевый – на УПГ, кроме альбуминовой фракции, определялись белки с молекулярной массой 10-57,9 кДа, относящиеся к маркерам поражения канальцев (рибонуклеаза, лизоцим, 2-микроглобулин, легкие цепи IgG, 1-микроглобулин, 1-кислый гликопротеид);

4 – смешанный – наличие на УПГ белков с молекулярной массой от 10 до 160 кДа (клубочковые и канальцевые протеины).

Частота встречаемости различных типов протеинурии в исследованных группах детей представлена в таблице 3.

У пациентов I группы (без ДН, со стажем диабета 1-5 лет, при отсутствии патологии в общеклинических анализах мочи) физиологическая протеинурия наблюдалась только у половины детей (47,5%), что было, тем не менее, достоверно чаще по сравнению с патологическими типами протеинурии (р<0,01-0,001). У трети больных определялась смешанная протеинурия (30,6%), у пятой части – изолированная клубочковая протеинурия (19,1%) и у единичных детей – канальцевая (2,7%).

Анализ уропротеинограмм больных I группы показал, что экскреция альбумина у 100% обследованных не превышала 27 мг/л. В случаях, когда уропротеинограмма была представлена единственной фракцией альбумина (физиологический тип протеинурии), его экскреция составляла в среднем 12,1±2,5 мг/л. При сочетании альбумина с другими белковыми фракциями его концентрация в моче была в среднем 22,4±3,3 мг/л (р<0,001).

У больных II группы (со стажем диабета более 5 лет и при наличии диабетической нефропатии) определялись 2 типа протеинурии: клубочковый и смешанный. В большинстве случаев наблюдался смешанный тип (85,4%), у седьмой части пациентов – клубочковый (14,6%), р<0,001.

Между сравниваемыми группами больных с СД значимых различий не было только по отношению к клубочковому типу протеинурии, физиологический и изолированный канальцевый типы наблюдались достоверно чаще в I группе пациентов (соответственно р<0,001 и р<0,05), смешанный тип – во II группе (р<0,001).

Некоторым больным исследование уропротеинограммы было проведено в динамике заболевания.

Пример: Наташа Г., 11 лет. Истории болезни: №3349, 6838.

Страдает ИЗСД с 1996 года, в 1998 году (в 11 лет) проходила очередное контрольное обследование в эндокринологическом отделении областной детской клинической больницы г. Воронежа. В анализе мочи по Каковскому-Аддису: белок – (-), лейкоциты – 0,3×10⁶/л, эритроциты – (-); в пробе по Зимницкому – диурез 1370 мл, удельный вес – 1014; артериальное давление до 110/70 мм рт.ст.

Уропротеинограмма была представлена клубочковыми (альбумин, постальбумин, трансферрин, иммуноглобулин G) и канальцевыми (легкие цепи иммуноглобулина G, 1-кислый гликопротеид) протеинами, концентрация альбумина составила 18 мг/л.

На фоне отсутствия патологии со стороны общего и биохимического анализов крови, клинических анализов мочи, ультразвукового исследования почек, на уропротеинограмме определялся смешанный тип протеинурии, о чем свидетельствовала повышенная экскреция с мочой некоторых клубочковых и канальцевых протеинов.

При очередном обследовании в 2002 году (давность болезни составила 6,5 лет) в клинических анализах мочи была выявлена протеинурия 0,66 г/л, диагностирована диабетическая нефропатия. При повторном исследовании уропротеинограммы вновь был определен смешанный тип протеинурии: были идентифицированы клубочковые (альбумин, пре- и постальбумины, трансферрин, гаптоглобин, иммуноглобулин G) и канальцевые (легкие цепи иммуноглобулина G, 1-микроглобулин, 1-кислый гликопротеид) протеины. Качественный состав белковых фракций мочи за 4,5 года практически не изменился, увеличилась количественная характеристика отдельных протеинов, на уропротеинограмме появились такие белковые фракции как преальбумин, гаптоглобин, 1-микроглобулин.

Данный пример показывает, что, несмотря на отсутствие признаков развивающейся диабетической нефропатии при стандартном обследовании пациентов ИЗСД, данные уропротеинограмм позволили диагностировать ДН на доклинической стадии уже через 2 года после дебюта заболевания.

Исследование уропротеинограммы в динамике болезни позволило зафиксировать сохранение патологического качественного состава белка мочи, определяемого в доклинической стадии, и в развернутой стадии ДН.

В последние годы повышенный интерес к изучению микроальбуминурии связан с тем, что новые методы исследования позволяют определять повышенные цифры экскреции альбумина с мочой при отсутствии белка в общеклинических анализах мочи. В течение длительного времени, и, прежде всего в диабетологии, под микроальбуминурией понимали экскрецию с мочой альбумина от 30 до 300 мг/сутки или 20-200 мг/мин [Deferrari G., Repetto M., Calvi С.et al. Diabetic nephropathy: from micro- to macroalbuminuria. Nephrol Dial Transplant 1998; 13: 11-15]. Дальнейшее изучение этого вопроса показало, что экскреция альбумина с мочой уже более 20 мг/сут часто предшествует сосудистым осложнениям у диабетиков [Ruilope L.M., Alcazar J.M., Hemander E. et al. Long-term influences of anti-hypertensive therapy on microalbuminuria in essential hypertension. Kidney Int 1994; 45: S171-173].

Подтвержденный клиническими исследованиями технический результат позволяет утверждать, что даже при нормальной экскреции альбумина у больных сахарным диабетом в половине случаев в конечной моче присутствуют маркеры поражения клубочков и/или канальцев. Поэтому более уместно в случае экскреции альбумина более 30 мг/л говорить о микропротеинурии.

Учитывая тяжесть и быстрое прогрессирование уже возникших изменений почек, более важным и актуальным остается диагностика доклинических стадий ДН, когда экскреция альбумина остается нормальной, так как именно в этот период функциональных изменений необходимо начинать лечебные мероприятия, способствующие снижению скорости прогрессирования нефропатии. Метод автоматизированного электрофореза белка мочи в ПААГ, благодаря своей чувствительности, обладает высокой информативностью, позволяя диагностировать доклинические стадии развития ДН уже в первые годы болезни.

Таким образом, положительный эффект изобретения заключается в своевременном выявлении патологии почек у больных ИЗСД на доклинической стадии ДН в период функциональных изменений нефрона, а также определение уровня дисфункции нефрона, что особенно важно для пациентов, у которых проведение биопсии затруднено.

Библиография

1. Базарова А.В. Характеристика функций канальцев почек у больных с сахарным диабетом: Автореф. дис.(канд. мед. наук. – М., 1993. – 21 с.

2. Дедов И.И. Сахарный диабет: ретинопатия, нефропатия / И.И.Дедов, М.В.Шестакова, Т.М.Миленькая. – М.: Медицина, 2001. – 175 с.

Таблица 1.
Общая характеристика больных сахарным диабетом.
Показатели	I группа ДН(-) n=183	II группа ДН(+) n=48	Достоверность различий, р
Возраст, годы, M±	11,95±3,28	14,26±2,14	<0,001
Давность болезни, годы, М±	2,94±1,29	8,74±2,51	<0,001
Пол, n – %:
мальчики	98-53,55	27-56,25	–
девочки	85-46,45	21-43,75	–
Место жительства, n – %:
город	102-55,74	18-37,5	<0,05
село	81-44,26	30-62,5	<0,05
Наследственность, n – %:
спорадический СД	124-67,8	30-62,5	–
семейный СД	59-32,2	18-37,5	–
Стадии болезни, n – %:
субкомпенсация	11-6,01	2-4,17	–
декомпенсация без кетоза	140-76,50	40-83,33	–
декомпенсация с кетозом	32-17,49	6-12,5	–
Общий анализ крови, М±:
гемоглобин, г/л	124,1±13,2	126,6±9,35	–
лейкоциты, ·109/л	4,8±1,1	4,9±1,06	–
СОЭ, мм/ч	6,5±4,8	9,7±6,71	<0,05
Б/х анализ крови, М±:
общий белок, г/л	72,6±6,6	71,0±7,5	–
холестерин, мМ/л	4,8±1,0	5,9±1,3	0,01
В-липопротеиды, мг %	396,3±109,9	549,4±160,8	<0,001
мочевина, мМ/л	5,3±1,2	4,9±1,33	–
креатинин, мг/%	0,87±0,13	0,97±0,23	<0,05
Общий анализ мочи, М±:
белок, г/л	–	0,216±0,433	<0,05
лейкоциты, в п/зр	2,4±2,0	2,9±2,5	–
эритроциты, в п/зр	–	–	–
Артериальное давление,
М±:	107,2±10,7	120,0±17,0	<0,001
систолическое, мм рт.ст.	65,2±8,6	76,2±12,5	<0,01
диастолическое, мм рт.ст.	79,2±8,5	90,8±13,5	<0,001
среднее, мм рт.ст.

Таблица 2.
Частота встречаемости отдельных белковых фракций в исследованных группах детей.
Белковые фракции, кДа	I группа ДН(-) n=183, n – %	II группа ДН(+) n=48, n – %	Контрольная группа n=20, n – %
-следовой протеин, 10,5	–	1 – 2,08	–
2-микроглобулин, 11,7	–	3 – 6,25	–
Рибонуклеаза, 13,8	7-3,83	6-12,50	–
Мономерный Нв, 15,2	4-2,19	4-8,33	–
Ретинол-связывающий белок, 21,2	1-0,55	3 – 6,25
Легкие цепи IgG, 22	71-38,80	40-83,33***	–
1-микроглобулин,31	6-3,28	20-41,67***	–
1-кислый гликопротеид, 44	14-7,65	29-60,42***	–
Преальбумин, 58	48 – 26,23	42-87,50***	–
Альбумин, 67	183 -100,0	48 -100,0	20-100,0
Постальбумин, 72	73-39,89	47-97,92***	–
Трансферрин,76	77-42,08	47-97,92***	–
Гаптоглобин, 88	20-10,93	18-37,50**	–
Димерный альбумин, 128	2-1,09	5-10,42*	–
Иммуноглобулин G, 156	76-41,53	46-95,83***	–
* – pI-II -<0,05; ** – pI-II -<0,01; *** – pI-II -<0,001.

Формула изобретения

Способ диагностики доклинической стадии диабетической нефропатии у детей с инсулинозависимым сахарным диабетом при отсутствии белка при общеклиническом исследовании мочи, характеризующийся тем, что исследуют белковые фракции мочи, разделенные с помощью электрофореза в градиентном 8-25%-ном полиакриламидном геле с детергентом додецилсульфатом, и при определении на уропротеинограмме единственной фракции альбумина молекулярной массой 67 кДа в количестве до 26 мг/л состояние пациента интерпретируют как норму; при обнаружении дополнительно к альбумину протеинов с молекулярной массой 58-156 кДа: трансферрина, гаптоглобина, IgG, постальбумина и преальбумина диагностируют клубочковую дисфункцию; при обнаружении протеинов с молекулярной массой от 10 до 58 кДа: рибонуклеазы, мономерного гемоглобина, ретинол-связывающего белка, легких цепей IgG, 1-микроглобулина, 1-кислого гликопротеида диагностируют канальцевую дисфункцию; при наличии белков с молекулярной массой от 10 до 156 кДа диагностируют сочетанное поражение.