Патент на изобретение №2346699

(54) СПОСОБ НЕМЕДИКАМЕНТОЗНОГО СНИЖЕНИЯ ГИПЕРЛИПИДЕМИИ

(57) Реферат:

Способ относится к медицине, а именно к терапии, и касается немедикаментозного снижения гиперлипидемии. Для этого в состав пищевого рациона вносят продукты глубинного культивирования грибов класса Basidiomycetes рода Trametes вида Trametes ochracea. Использование биомассы базидиальных грибов Trametes ochracea, a также экстракта из нее позволяет снижать уровень общего холестерина и триглицеридов в крови, повышать уровень ЛПВП в крови, снижать уровень общего холестерина и активировать метаболизм холестерина в печени. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”рода Trametes. Прикладная биохимия и микробиология. – 2006, т.42, №6, найдено 05.06.2008 из Интернет на: www.infomag.ru/jonals/j0444r/26251.html.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается использования грибов класса Basidiomycetes рода Trametes, a именно использования биомассы грибов вида Trametes ochracea или экстрактов из биомассы в составе пищевого рациона для снижения уровня холестерина и триглицеридов в крови, увеличения липидов высокой плотности в крови и активации метаболизма холестерина в печени при гиперлипидемии.

Известны способы снижения гиперлипидемии путем использования средств на основе растительного сырья, RU №2173161 С1, A61K 35/78, А61Р 3/06, 2001.09.10; RU №2246964 С1, A61K 35/78, А61Р 3/06, 2005.02.27.

Известны способы снижения гиперлипидемии на основе использования микромицетов разных родов, в частности из рода Aspergillus, US №4231938.

Известны способы получения глубинного мицелия гриба рода Trametes (син. Coriolus), SU №718018 A3, C12K 1/00, C12D 13/04; 1980.02.25, SU №1090261 A3, C12N 1/00, C12R 1/645, 1984.04.30; SU №1403990 A3, C08B 37/00,1988.06.15.

Известна противоопухолевая и гипогликемическая композиция на основе активных ингредиентов из Basidiomycotina, обнаруженных в том числе в культуре грибов Trametes (син. Coriolus) versicolor, RU №2274465 C2, A61K 36/07, A61K 36/25, 2006.04.20.

Данное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения.

Мицелий гриба Trametes versicotor ближайшего аналога используют в качестве противоопухолевого средства.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи, позволяющей выявить из базидиальных грибов рода Trametes вид гриба, снижающий уровень гиперлипидемии, определить и расширить возможности осуществления способа.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии заключается в использовании грибов класса Basidiomycetes рода Trametes.

Из рода Trametes используют грибы вида Trametes ochracea.

Продукты глубинного культивирования грибов вида Trametes ochracea вносят в состав пищевого рациона.

В качестве продукта глубинного культивирования используют биомассу грибов вида Trametes ochracea.

Биомассу грибов вида Trametes ochracea используют при минимальном количестве 2% от пищевого рациона.

В качестве продукта глубинного культивирования используют экстракт из биомассы грибов вида Trametes ochracea.

Экстракт из биомассы грибов вида Trametes ochracea используют при минимальном количестве 0,002% от пищевого рациона.

В качестве экстракта используют этилацетатный экстракт.

Заявителями не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

За счет реализации отличительных признаков изобретения (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) достигаются важные новые свойства объекта.

В роде Trametes выявлен базидиальный гриб вида Trametes ochracea, продукты глубинного культивирования которого снижают уровень гиперлипидемии.

Использование в качестве продукта глубинного культивирования биомассы базидиального гриба Trametes ochracea или экстракта из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea существенно снижает уровень гиперлипидемии.

Внесение биомассы при минимальном количестве 2% или экстракта из биомассы при минимальном количестве 0,002% от пищевого рациона обеспечивает осуществление способа.

Использование биомассы базидиального гриба Trametes ochracea или экстракта из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea, в частности этилацетатного экстракта, расширяет возможности осуществления способа.

Заявителям не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителей, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом.

Для немедикаментозного снижения гиперлипидемии используют базидиальный гриб Trametes ochracea.

Продукты глубинного культивирования базидиального гриба Trametes ochracea вносят в состав пищевого рациона.

В качестве продуктов глубинного культивирования используют биомассу или экстракт из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

Биомассу базидиальных грибов Trametes ochracea используют в количестве 2% от пищевого рациона.

Экстракт из биомассы базидиальных грибов Trametes ochracea используют в количестве 0,002% от пищевого рациона.

В качестве экстракта может быть использован этилацетатный экстракт.

Культура Trametes ochracea выделена из плодовых тел дереворазрушающего гриба Trametes ochracea (Pers.) Gilb. et Rivarden, собранных в северо-восточной пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга. Плодовые тела (син. базидиомы) собраны, охарактеризованы и индуцированы в чистую культуру авторами.

Для осуществления способа используют культуру Trametes ochracea ТИ-15 из коллекции культур высших базидиальных грибов кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета).

В коллекции культуру Trametes ochracea поддерживают на косяках сусло-агара (пивное сусло 4° по Баллингу, агар 20%) и хранят в рефрижераторе при +4±2°С.

Достоверное снижение уровня гиперлипидемии подтверждено в эксперименте.

Эксперимент проведен на белых беспородных крысах-самцах массой 140-160 г, полученных из питомника «Рапполово РАМ» г.Санкт-Петербурга.

Модель гиперлипидемии белых беспородных крыс-самцов выбрана на основании опыта Института Экспериментальной Медицины РАМН (г.С.-Петербург) и зарубежных работ (Климов А.Н., Рыженков В.Е., Экспериментальное изучение гиполипидемических и антиатеросклеротических средств. Методические рекомендации, М., 1988, 18 с.: Staprans I., Rapp J.H., Pan X-M. et al., Oxidized lipids in the diet accelerate the development of fatty streaks in cholesterol-fed rabbits, Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol., 1996, v 16, N4, 533-538).

ПРИМЕР 1.

Получение биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

Предварительно готовят посевной материал, выращивая культуру Trametes ochracea в стационарных условиях на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): глюкоза 20; пептон 4; KH₂PO₄ 0,6; K₂HPO₄ 0,4; MgSO₄ 0,5; ZnSO₄·7H₂O 0,001; FeSO₄·7H₂O 0,005; MnSO₄ 0,003; CaCl₂ 0,05; кукурузный экстракт 1,0 (по сухому весу); рН среды до стерилизации 5,8-6,0. Стерилизацию среды проводят при 0,5*10³ Па в течение 30 минут.

Посевной материал выращивают в течение 7-10 дней при 25-28°С, диспергируют и используют в качестве инокулюма для получения биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

Глубинное культивирование базидиального гриба Trametes ochracea проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл глюкозопептонной среды указанного состава и суспензию посевного материала в количестве 10% от объема среды. Культивирование проводят на роторной качалке при 120-160 об/мин в течение 7 суток при 25-28°С. Указанный температурный интервал является оптимальным для активного роста культуры Trametes ochracea.

Выросшую при глубинном культивировании биомассу базидиального гриба Trametes ochracea отделяют от нативного раствора, сушат при температуре 40-50°С и измельчают в порошок.

Примечание:

Глубинное культивирование базидиального гриба Trametes ochracea аналогичным способом можно проводить и на натуральной среде, в состав которой входят пивное сусло (4° по Баллингу) и соевая мука (1%), рН среды 5,8-6,0.

Для глубинного культивирования могут быть использованы и другие известные питательные среды.

ПРИМЕР 2.

Получение этилацетатного экстракта из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

15 г порошка биомассы базидиального гриба Trametes ochracea замачивают в 900 мл воды и выдерживают в течение 30 мин. Доводят рН до 7,7, используя 4% NaOH. Добавляют 150 мл метанола и 300 мл этилацетата. Процесс экстракции в двухфазной системе растворителей Н₂О:МеОН:этилацетат (при соотношении 3:0.5:1) проводят на магнитной мешалке в течение 30 мин. Раствор центрифугируют при 5000 об/мин и 4°С в течение 10 мин и отбирают этилацетатный экстракт.

Отобранный раствор упаривают под вакуумом при температуре 40-45°С и подвергают последующей кристаллизации охлаждением.

Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в потоке воздуха при 40°С.

Примечание:

Можно использовать водно-спиртовой экстракт, а также экстракты, полученные с применением других экстрагентов.

ПРИМЕР 3.

Проведение эксперимента.

Экспериментально индуцированную гиперлипидемию создавали у животных (белых беспородных крыс-самцов) путем использования в качестве их ежедневного пищевого рациона специальной гиперлипидемической диеты в течение трех недель (21 день).

Животные были разделены на несколько групп. Интактная группа (12 животных) получала стандартный сухой корм и водопроводную воду ad libitum. Контрольная группа (7 животных) получала гиперлипидемический корм и воду. Животные опытных групп №1 и №2 (по 7 животных в каждой группе) наряду с гиперлипидемическим кормом получали добавку исследуемых грибных материалов.

Гиперлипидемическая диета в качестве основы включала овсяные хлопья, в качестве атерогенных компонентов – сухой кристаллический холестерин – 5%, свиной жир – 25%, подсолнечное масло – 18%, витамин D (эргокальциферол) – 200 тыс. МЕ/сутки.

Животные опытных групп №1 и №2 получали per os добавку исследуемых грибных компонентов, смешанных с основной массой корма в количестве 2% и 0,002% от пищевого рациона. В качестве грибных добавок опытная группа №1 животных получала сухую биомассу базидиального гриба Trametes ochracea (2%), опытная группа №2 – сухой этилацетатный экстракт из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea (0,002%).

Примечание:

Внесение добавок исследуемых грибных компонентов в виде сухой биомассы базидиального гриба Trametes ochracea при минимальном количестве 2% от пищевого рациона и в виде сухого этилацетатного экстракта из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea при минимальном количестве 0,002% от пищевого рациона является оптимальным.

Определение общего холестерина, холестерина ЛПВП и триглицеридов в крови.

По истечении 21 дня у животных, предварительно наркотизированных уретаном, проводили забор крови.

Забор крови осуществляли при декапитации самотеком с последующим центрифугированием.

Содержание общего холестерина и холестерин ЛПВП определяли с помощью набора «Ольвекс диагностикум» (Санкт-Петербург, Россия).

Метод основан на сочетании ферментативной реакции с реакцией окисления. Образующаяся в результате этих реакций перекись водорода взаимодействует под действием пероксидазы с 4-аминофеназоном и фенолом с образованием окрашенного продукта – хинонимина.

Определение триглицеридов проводили в сыворотке крови с применением энзиматического колориметрирического метода с использованием набора реагентов для определения триглицеридов в сыворотке или цельной крови человека «ВИТАЛ ДИАГНОСТИКС» (Санкт-Петербург, Россия).

Содержание общего холестерина, холестерина ЛПВП и триглицеридов в крови животных интактной группы, контрольной группы и опытных групп №1 и №2 представлены в таблице.

Из таблицы видно, что у животных контрольной группы, получавших гиперлипидемическую (атерогенную) диету наблюдается характерное изменение в содержании атерогенных соединений в сыворотке крови – увеличивается концентрация общего холестерина на 77% и содержание триглицеридов на 130%. Концентрация антиатерогенных липидов (ЛПВП) в сыворотке контрольных животных была выше по сравнению с интактными животными (2,05 ммоль/л по сравнению с 1,43 ммоль/л). Известно, что у крыс спонтанный атеросклероз не встречается, и большая часть холестерина крови находится в составе липидов высокой плотности. Увеличение у них ЛПВП па фоне гиперлипидемической диеты является компенсаторной реакцией организма (Климов А.П. Антиатерогенная функция липопротеинов высокой плотности. С.34-54; в кн: Атеросклероз. Проблемы патогенеза и терапии. Изд. «Медицинская литература», СПб., 2006. С.246).

У животных опытной группы №1, получавших наряду с гиперлипидемической диетой грибную добавку в виде сухой биомассы базидиального гриба Trametes ochracea, уровень гиперхолестеринемии был выше, чем у интактной группы только на 41% (в контрольной группе на 77%). Содержание общего холестерина в сыворотке крови животных опытной группы №1 было на 20% ниже, чем у животных контрольной группы.

Уровень триглицеридов в сыворотке крови животных опытной группы №1 повышался по сравнению с интактной группой только на 8%, (у контрольной группы на 130%). Содержание в крови триглицеридов по сравнению с контрольной группой снижалось на 53%.

Концентрация липопротеидов высокой плотности («хорошего холестерина» – ЛПВП) в крови животных опытной группы №1 практически не отличалась от аналогичных данных контрольной группы, но была значительно выше, чем у животных интактной группы – 2,03 ммоль/л по сравнению с 1,43% ммоль/л.

В клинической практике принято рассчитывать коэффициент атерогенности (КА), который выражают через отношение разницы между содержанием общего холестерина и холестерина ЛПВП к содержанию ЛПВП (Климов, 2006). Коэффициент атерогенности позволяет судить о степени угрозы развития атеросклеротического процесса в организме.

Из таблицы видно, что в норме у животных интактной группы КА очень низкий – 0,2, что естественно, т.к. крысы относятся к группе животных, устойчивых к развитию атеросклероза. Однако на фоне индуцированной гиперлипидемии у животных контрольной группы этот коэффициент возрастает до 0,5. У животных опытной группы №1, получавших наряду с гиперлипидемическим кормом грибную добавку в виде биомассы базидиального гриба Trametes ochracea, КА не только снизился по сравнению с контрольной группой, но и вернулся к норме животных интактной группы – 0,2.

Общая тенденция к снижению уровня гиперлипидемии в крови животных опытной группы №1 подтверждается и у животных опытной группы №2, получавших наряду с гиперлипидемическим кормом не биомассу, а этилацетатный экстракт из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

Из таблицы видно, что уровень гиперхолестеринемии у животных опытной группы №2 был выше, чем у интактной группы на 32% (в контрольной группе на 77%). Содержание в крови общего холестерина снижалось по сравнению с контрольной группой на 25%, т.е. сходным образом с животными опытной группы №1.

Уровень триглицеридов в сыворотке крови животных опытной группы №2 повышался по сравнению с интактной группой на 120% (р>0,05). Содержание триглицеридов снижалось по отношению к контрольной группе на 4%.

Уровень холестериновой фракции ЛПВП у животных опытной группы №2 был наиболее высоким – 2,12 ммоль/л, соответственно коэффициент атерогенности был наименьшим – 0,1.

Представленные выше в таблице данные характеризуют картину снижения индуцированной гиперлипидемии в сыворотке крови животных.

Картина снижения гиперлипидемии в сыворотке крови опытных животных, представленная в таблице, дополнена данными но оценке содержания холестерина в печени этих животных.

Оценка содержания общего холестерина в печени.

По истечении 21 дня у животных определяли содержание общего холестерина в печени.

В печени исследованных животных анализ содержания общего холестерина (ммоль/л) показал следующее: интактная группа – 0,076, контрольная группа – 0,101, опытная группа №1 – 0,043. Внесение в гиперлипидемический корм животных грибной биомассы из культуры Trametes ochracea приводило к снижению уровня холестерина в печени по сравнению с контрольной группой на 58%. Эти данные не только подтверждают наблюдаемое в сыворотке крови гипохолестерольное действие биомассы базидиального гриба Trametes ochracea, но и свидетельствуют об активации метаболизма холестерина в печени животных под влиянием грибной добавки.

Кроме того, исследовали биомассу двух других видов лигнотрофных грибов из рода Trametes, культуры которых имеются в коллекции культур высших базидиальных грибов кафедры микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). Биомассу культур видов Trametes versicolor и Trametes hirsuta получали глубинным способом и исследовали на животных аналогичным образом, как в случае биомассы культуры Trametes ochracea. Было установлено, что внесение в рацион этих животных биомассы базидиальных грибов Trametes versicolor и Trametes hirsuta приводило к достоверному снижению содержания только общего холестерина в сыворотке крови и печени животных. Пределы снижения были меньше, но почти сходны с уровнем снижения, наблюдаемым при использовании биомассы базидиального гриба Trametes ochracea (15-20% против 20% в сыворотке крови и 35-40% против 58% в печени). Содержание триглицеридов снижалось значительно меньше – всего на 18-20% по сравнению с 53% в случае использования биомассы базидиального гриба Trametes ochracea. Кроме того, и это особенно важно, содержание ЛПВП в крови этой группы животных резко снижалось, почти в 2 раза по сравнению с контрольной группой, в то время как при использовании биомассы базидиального гриба Trametes ochracea содержание «хороших липидов» (ЛПВП) оставалось на уровне контрольной группы. В результате индекс атерогенности такого корма повышался до 1,0 (в случае использования биомассы базидиального гриба Trametes ochracea он составлял всего 0,2, как у животных интактной группы).

Предложенный способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии, относящийся к микробиологической промышленности, включающий использование базидиальных грибов Trametes ochracea и проведение экспериментальных исследований, подтверждающих снижение гиперлипидемии, проведенный в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П.Павлова и Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете), обусловливает, по мнению заявителей, соответствие его критерию «промышленная применимость».

Использование предложенного способа позволяет:

– использовать базидиальные грибы Trametes ochracea для снижения уровня холестерина и триглицеридов в крови, повышения уровня ЛПВП в крови, снижения уровня холестерина и активации его метаболизма в печени, что в целом приводит к существенному снижению уровня гиперлипидемии,

– расширить возможности осуществления способа, за счет внесения в состав пищевого рациона биомассы базидиальных грибов Trametes ochracea и экстрактов из биомассы в лечебных и профилактических целях.

Формула изобретения

1. Способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии, заключающийся в использовании грибов класса Basidiomycetes рода Trametes, отличающийся тем, что из рода Trametes используют грибы вида Trametes ochracea, продукты глубинного культивирования которого вносят в состав пищевого рациона.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве продукта глубинного культивирования используют биомассу при минимальном количестве 2% от пищевого рациона.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве продукта глубинного культивирования используют экстракт из биомассы при минимальном количестве 0,002% от пищевого рациона.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве экстракта используют этилацетатный экстракт.