Патент на изобретение №2346043

(54) СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО И ЛЕЧЕБНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ИНВАЗИИ И МЕТАСТАЗИРОВАНИИ РАКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой олигопептид, способный блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток, содержащий олигопептидную последовательность (приведена в заявке) или ее фрагмент, также представляет собой фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения дегенеративных заболеваний, или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР), диагностическую композицию для выявления дегенеративных заболеваний или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР). Также изобретение представляет собой вакцину для лечения или предупреждения дегенеративных заболеваний, или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР). Данное изобретение обеспечивает олигопептиды, которые могут эффективно блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток и которые полезны для предупреждения или лечения дегенеративных заболеваний или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса металлопротеиназами матрикса. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к синтетическим пептидам, обнаруживающим ингибирующую активность в отношении инвазии и метастазирования рака. Пептиды изобретения включают пептид PRKPKWDK (SEQ ID NO: 2), соответствующий аминокислотам 85-92 металлопротеиназы-2 матрикса (ММР-2), и фрагменты, аналоги и гомологи SEQ ID NO: 2. Изобретение также относится к применениям таких пептидов в качестве ингибиторов инвазии и метастазирования рака у человека, а также к лечебному применению при предупреждении и лечении рака и других патологических состояний, ассоциированных с разрушением внеклеточного матрикса ММР.

Уровень техники

Различные патологические состояния, в том числе неопластические болезни связаны с повышенной активностью металлопротеиназ матрикса (ММР). ММР являются группой сериновых протеиназ, которые могут разрушать внеклеточный матрикс (ЕСМ). ММР секретируются во внеклеточный матрикс в своей зимогенной форме. После активации ММР ферментативная активность становится действенной и расщепляет ЕСМ-процесс, который, как показано, играет главную роль в метастазировании рака.

В семействе протеиназ ММР существует, по меньшей мере, пять членов, и к ним относятся ММР-1, ММР-2, ММР-3, ММР-8, ММР-9 и ММР-13. При раке ММР-2 вовлечен в первичный рост опухоли, а также в метастазирование опухоли. Эта конкретная ММР способна расщеплять коллаген и другие белки внеклеточного матрикса (ЕСМ), что является предпосылкой к распространению рака для его инвазии и метастазирования.

Хотя много усилий направляется на создание и испытание противораковых средств, сохраняется потребность в нетоксичном лечебном средстве, которое может эффективно блокировать ММР-опосредованное расщепление ЕСМ, причем посредством этого ослабляется распространение рака и других заболеваний.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к синтетическим пептидам, которые могут эффективно блокировать инвазию раковых клеток. Преимуществом таких средств и антител к ним является полезность при клинических применениях для блокирования инвазии и метастазирования рака.

Целью настоящего изобретения является обеспечение синтетического олигопептида с аминокислотной последовательностью, аналогичной специфичной аминокислотной последовательности метиллопротеиназы 2 матрикса (85-92), эффективного при блокировании инвазии и метастазирования рака.

Целью настоящего изобретения является обеспечение синтетических пептидов, применяемых при блокировании инвазии и метастазирования рака, имеющих аминокислотную последовательность PRKPKWEDK.

Другой целью настоящего изобретения является способ применения синтетических пептидов, раскрываемых в данной заявке, для предупреждения и лечения раковых заболеваний. Другой аспект воплощения состоит в том, что используют эффективное количество синтетических пептидов для того, чтобы добиться блокады инвазии и метастазирования рака.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение олигопептида, содержащего последовательность PRKPKWEDK (SEQ ID NO: 2).

Предпочтительно олигопептид содержит от примерно 6 до примерно 20 остатков. Наиболее предпочтительно олигопептид содержит от примерно 8 до примерно 10 остатков.

Предпочтительно концентрация синтетического пептида колеблется от 1 мкМ до 500 мкМ. Наиболее предпочтительно концентрация синтетического пептида колеблется от 50 мкМ до 200 мкМ.

Другой целью настоящего изобретения является иммуногенный олигопептид, который включают в фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и олигопептиды. Олигопептид можно использовать как вакцину. Фармацевтическую композицию, содержащую олигопептид, можно использовать для того, чтобы вызвать иммунную реакцию против белка, содержащего эпитоп с последовательностью олигопептида (например, SEQ ID NO: 2).

Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы композиции и способы осуществлять как in vivo, так и in vitro.

Настоящее изобретение обеспечивает синтетический олигопептид с аминокислотной последовательностью, аналогичной ММР-2 человека.

Настоящее изобретение также относится к модификации олигопептидов, блокирующих инвазию и метастазирование раковых клеток путем исключения одного или нескольких аминокислотных остатков из N-конца.

Настоящее изобретение относится к модификации олигопептидов, блокирующих инвазию и метастазирование раковых клеток путем исключения одного или нескольких аминокислотных остатков из С-конца.

Настоящее изобретение относится к модификации олигопептидов, блокирующих инвазию и метастазирование раковых клеток путем исключения одного или нескольких аминокислотных остатков из N-конца и С-конца.

Настоящее изобретение относится к модификации олигопептидов, блокирующих инвазию и метастазирование раковых клеток путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в данной последовательности без учета заряда и полярности заменяющего остатка.

Настоящее изобретение относится к модификации олигопептидов, блокирующих инвазию и метастазирование раковых клеток путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в данной последовательности на аминокислотные остатки со сходным зарядом и/или полярностью.

Настоящее изобретение относится к модификации олигопептидов, блокирующих инвазию и метастазирование раковых клеток путем исключения одного или нескольких аминокислотных остатков из данной последовательности.

Настоящее изобретение относится к модификации олигопептидов, блокирующих инвазию и метастазирование раковых клеток с помощью двух или большего числа модификаций.

Настоящее изобретение относится к модификации олигопептидов, блокирующих инвазию и метастазирование раковых клеток путем повторения последовательности олигопептида один или несколько раз, причем каждая из них ковалентно связана с одним или несколькими олигопептидными повторами.

Другой целью настоящего изобретения является применение синтетических пептидов в качестве иммуногена для получения антител, так что полученные антитела могут эффективно блокировать инвазию и метастазирование рака.

Настоящее изобретение относится к профилактическому и лечебному применению одного или нескольких олигопептидов для прямого и конкурентного ослабления или блокирования метаболического действия или взаимодействия ММР-2 путем введения внутривенно или другим терапевтически приемлемым способом.

Настоящее изобретение относится к профилактическому и лечебному применению одного или нескольких олигопептидов для непрямого ослабления или блокирования метаболического действия или взаимодействия ММР путем применения их как вакцин способом подкожного введения или другим приемлемым способом для того, чтобы стимулировать специфическую иммунную реакцию, которая может частично или полностью блокировать метаболическое воздействие ММР. Предпочтительное воплощение включает ММР-2.

Настоящее изобретение относится к профилактическому и лечебному применению одного или нескольких олигопептидов, где олигопептиды конъюгируют с гаптенами, для усиления иммунной реакции и посредством этого терапевтической эффективности.

Настоящее изобретение относится к профилактическому или лечебному применению одного или нескольких олигопептидов, функционирующих как регуляторы с обратной связью, специфически предупреждающие или снижающие скорость синтеза белков ММР-2 на клеточном уровне.

Настоящее изобретение относится к одному или нескольким олигопептидам, которые могут блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток, как вакцинам для получения специфических антител для диагностики заболевания с участием ММР-2 или клинического мониторинга развития или регрессии такого заболевания.

Настоящее изобретение относится к применению одного или нескольких олигопептидов, которые могут блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток, для предупреждения или лечения рака.

Настоящее изобретение относится к применению одного или нескольких олигопептидов, которые могут блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток, где указанные олигопептиды можно применять пациенту как вакцину, в виде инъекций, инфузий, ингаляций, суппозиториев или других фармацевтически приемлемых носителей и/или способов доставки.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 отображает аминокислотную последовательность фермента ММР-2. Аминокислотные последовательности, выбранные для исследования ингибирующей активности, заключены в рамку для облегчения идентификации. Аминокислотную последовательность TMRKPRCGNPDVAN (также заключенную в рамку), которая, как показано другими исследователями (Loitta and Associates), подавляет активность ММР-2, использовали в качестве образца для сравнения.

Фиг.2 отображает сравнительное ингибирующее действие различных испытанных олигопептидов. Олигопептид PRKPKWDK является высокоэффективным при блокировании инвазии раковых клеток при использовании анализа в Matrigel с раковыми клетками меланомы человека А2058.

Фиг.3 отображает ингибирующее действие олигопептида PRKPKWDK при блокировании инвазии раковых клеток при использовании анализа в Matrigel с раковыми клетками меланомы человека А2058.

Фиг.4 отображает ингибирующее действие олигопептида PRKPKWDK при блокировании инвазии раковых клеток при использовании анализа в Matrigel с клетками рака молочной железы человека А2058.

Осуществление изобретения

Определения

Используемый в данном описании термин “пептид” относится к органическим соединениям, содержащим два или большее число аминокислот, ковалентно связанных пептидными связями; пептиды могут представлять собой дипептиды (содержащие два аминокислотных остатка), трипептиды (содержащие три аминокислотных остатка) и т.д.

Используемый в данном описании термин “олигопептид” относится к пептиду, который содержит обычно менее 30 остатков в длину. Длина олигопептида не является критическим параметром для изобретения до тех пор, пока сохраняется правильный эпитоп.Желательно, чтобы олигопептид был настолько коротким, насколько это возможно, в то время, пока все еще сохраняется, по существу, вся биологическая активность большого олигопептида и он эффективен при блокировании инвазии и метастазирования раковых клеток.

В данной заявке используемые термины “олигопептид” и “синтетический пептид” являются взаимозаменяемыми. Используемый в данном изобретении олигопептид является “изолированным”, но “биологически чистым” синтетическим пептидом.

Используемые в данном описании для аминокислотных остатков однобуквенные символы обозначают: А – аланин, R – аргинин, N – аспарагин, D – аспарагиновую кислоту, Q – глутамин, Е – глутаминовую кислоту, G – глицин, Н – гистидин, I – изолейцин, L – лейцин, К – лизин, М – метионин, F – фенилаланин, Р – пролин, S – серин, Т – треонин, W – триптофан и Y – тирозин.

Аминокислотные замены обычно касаются отдельных остатков. Можно комбинировать замены, делеции, вставки или любые их сочетания для того, чтобы придти к олигопептиду. Замены консервативных аминокислот заключаются в замене одной или нескольких аминокислот на аминокислоты с подобными характеристиками заряда, размера и/или гидрофобности, такой как, например, замена глутаминовой кислоты (Е) на аспарагиновую кислоту (D). Неконсервативные замены заключаются в замене одной или нескольких аминокислот на аминокислоты, имеющие другие заряд, размер и/или гидрофобность, такой как, например, замена глутаминовой кислоты (Е) на валин (V). Подразумевается, что настоящее изобретение охватывает консервативные изменения в олигопептиде в смысле замен, делеций, вставок или любого их сочетания до тех пор, пока эффективность блокирования инвазии и метастазирования раковых клеток является, по существу, неизменной.

Rath et al. (J. Applied Nutr., 44:62-69, 1992; J. Orthomolecular Med., 8:11-20, 1993) постулируют, что последовательности олигопептидов с высокими максимумом и конформацией гидрофильности и электрическим зарядом опосредуют патогенез множества заболеваний. Согласно постулату выбранная аминокислотная последовательность в ферменте ММР может блокировать действие фермента путем собственного связывания с комплементарной последовательностью в субстрате. Такая концепция совершенно отличается от концепции, подробно описанной Liotta с соавторами (пат. США №5372809), согласно которой олигопептид блокирует молекулу цинка в ферменте. Экспериментальные данные, показывающие, что комплексы разного типа белков в клетках могут модифицировать активность белков в клетке (Gavin and Associates, Nature, 415:141-147, 2002), являются, по существу, подтверждением постулата. Ссылки, цитированные в данном описании, включены в него в своей полноте путем отсылки.

В настоящем изобретении идентифицированы возможные олигопептидные последовательности в аминокислотной последовательности ММР-2, и с использованием в качестве экспериментальной модели инвазии ЕСМ раковыми клетками in vitro обнаружено, что такие олигопептидные последовательности эффективно препятствуют функциональной активности ММР-2.

Не ограничиваясь какой-либо теорией или механизмом действия, настоящее изобретение обеспечивает олигопептиды, которые могут эффективно блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток.

Один из механизмов действия может состоять в том, что ММР-2 связывается с молекулой-мишенью ЕСМ через специфические сайты связывания. Поэтому блокирование таких сайтов связывания может предотвращать связывание ММР-2 с его молекулами-субстратом в ЕСМ, ингибировать разрушение ЕСМ и посредством этого предотвращать распространение рака и других заболеваний в организме.

Некоторые потенциальные сайты связывания в белке ММР-2 были идентифицированы; настоящее изобретение предусматривает, что синтетические аналоги таких олигопептидных последовательностей эффективны для предупреждения разрушения ЕСМ. Одним из лечебных олигопептидов является PRKPKWDK, который, как показано, ингибирует инвазию раковых клеток примерно на 90%.

Настоящее изобретение также относится к лечебному применению олигопептида при других ММР-ассоциированных заболеваниях. Поскольку ММР-2 может использовать те же самые сайты для связывания со своими молекулами-мишенями в ЕСМ, олигопептид, раскрываемый в настоящем изобретении, может подобным образом препятствовать другим заболеваниям. Таким образом, профилактическое и лечебное применение синтетических олигопептидов, заявляемое в данной заявке, не ограничивается раком, но также может распространяться на сердечно-сосудистые заболевания и другие патологические состояния, ассоциированные с разрушением ЕСМ ММР. Такие олигопептиды можно применять пациенту как вакцину, в виде инъекций, инфузий, ингаляций, суппозиториев или других фармацевтически приемлемых носителей и/или способов доставки.

Для введения полипептидов и композиций настоящего изобретения используют любой способ введения из ряда известных путей, такой как пероральное, внутривенное (IV), подкожное, чрескожное и местное введение. В предпочтительном способе настоящего изобретения используют фармацевтическую композицию для парентерального введения.

Настоящее изобретение относится к олигопептидам, которые можно применять как вакцины для получения антител для проведения анализов, используемых при диагностике заболеваний с участием ММР (в частности, ММР-2), а также для клинического мониторинга развития или регрессии данного заболевания путем анализов крови или в других подходящих диагностических анализах.

Настоящее изобретение относится к синтетическим пептидам, эффективным в блокировании инвазии раковых клеток. Преимущества таких средств и антител к ним заключаются в полезности при клинических применениях для предупреждения и лечения инвазии и метастазирования рака. Предпочтительно при блокировании инвазии и метастазирования рака пригодными являются синтетические олигопептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Предпочтительнее синтетические пептиды включают в фармацевтическую композицию для блокирования инвазии и метастазирования рака.

Олигопептид может содержать от примерно 6 до примерно 20 остатков. Наиболее предпочтительно олигопептид содержит от примерно 8 до примерно 10 остатков. Наиболее предпочтительно синтетический олигопептид содержит 8 аминокислотных остатков в длину.

Предпочтительно концентрация синтетических пептидов находится в диапазоне от 1 мкМ до 500 мкМ. Наиболее предпочтительно концентрация синтетических пептидов находится в диапазоне от 50 мкМ до 200 мкМ.

Другой целью настоящего изобретения является применение синтетических пептидов в качестве иммуногена для получения антител, так что полученные антитела могут эффективно блокировать инвазию и метастазирование рака.

Предпочтительно синтетический олигопептид содержит 8 аминокислотных остатков в длину. Другой целью настоящего изобретения является иммуногенный олигопептид, который включают в фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и олигопептиды. Олигопептид можно использовать как вакцину. Фармацевтическую композицию, содержащую олигопептид, можно использовать для того, чтобы вызвать иммунную реакцию против белка, содержащего эпитоп с последовательностью олигопептида (например, SEQ ID NO: 2).

Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы композиции и способы осуществлять как in vivo, так и in vitro.

Настоящее изобретение обеспечивает синтетический олигопептид с аминокислотной последовательностью, аналогичной аминокислотной последовательности в белке ММР-2 человека.

Амино- и/или карбоксиконцы синтетического олигопептида могут содержать аминогруппу (-NH;) или карбоксигруппу (-СООН) соответственно. С другой стороны, аминоконец олигопептида может, например, представлять гидрофобную группу, в том числе карбобензильную, дансильную, трет-бутоксикарбонильную, деканоильную, нафтоильную или другую углеводную группу; ацетильную группу; 9-фторенилметоксикарбонильную (FMOC) группу или модифицированный не встречающийся в природе аминокислотный остаток, или другую группу. С другой стороны, карбоксиконец синтетического олигопептида может, например, представлять амидогруппу, трет-бутоксикарбонильную группу или модифицированный не встречающийся в природе аминокислотный остаток. С другой стороны, настоящее изобретение охватывает синтетические олигопептиды, которые блокируют инвазию и метастазирование раковых клеток, у которых удален аминокислотный остаток из N-конца или С-конца. Настоящее изобретение также относится к модификации олигопептидов, которые блокируют инвазию и метастазирование раковых клеток путем замены аминокислотного остатка в данной последовательности без учета заряда и полярности заменяемого остатка.

Следует иметь в виду, что настоящее изобретение также относится к пептидным аналогам, где одна или несколько амидных связей при необходимости заменены связью иной, чем амидная, предпочтительно замещенной амидной или изостерной амидной связью. Таким образом, хотя аминокислотные остатки в пептидах, как правило, описываются в смысле аминокислот, и примерами предпочтительных воплощений изобретения являются пептиды, специалист в данной области техники поймет, что в воплощениях без амидных связей термины “аминокислота” или “остаток”, используемые в данном описании, относятся к другим бифункциональным молекулам, содержащим группы, подобные по строению боковым цепям аминокислот. Кроме того, аминокислотные остатки могут быть блокированными или неблокированными.

Настоящее изобретение относится к модификации олигопептидов, которые могут блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток путем повторения олигопептидной последовательности один или несколько раз, причем каждая из них ковалентно связана с одним или несколькими олигопептидными повторами.

Настоящее изобретение относится к профилактическому и лечебному применению одного или нескольких олигопептидов для прямого и конкурентного ослабления или блокирования метаболического действия или взаимодействия ММР-2 путем внутривенного введения или другим терапевтически приемлемым способом.

Настоящее изобретение относится к профилактическому или лечебному применению одного или нескольких олигопептидов для непрямого ослабления или блокирования метаболического действия или взаимодействия ММР путем применения их как вакцин способом подкожного введения или другим приемлемым способом для того, чтобы стимулировать специфическую иммунную реакцию, которая может частично или полностью блокировать метаболическое воздействие ММР. Предпочтительное воплощение включает ММР-2.

Настоящее изобретение относится к профилактическому и лечебному применению одного или нескольких олигопептидов, где олигопептиды конъюгированы с гаптенами для усиления иммунной реакции и посредством этого терапевтической эффективности.

Настоящее изобретение относится к профилактическому или лечебному применению одного или нескольких олигопептидов, функционирующих как регуляторы с обратной связью, специфически предупреждающие или снижающие скорость синтеза белков ММР-2 на клеточном уровне.

Настоящее изобретение относится к одному или нескольким олигопептидам, которые могут блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток, как вакцинам для получения специфических антител для диагностики заболевания с участием ММР-2 или клинического мониторинга развития или регрессии такого заболевания.

Настоящее изобретение относится к применению одного или нескольких олигопептидов, которые блокируют болезнь человека, в том числе, но не только, инвазию и метастазирование раковых клеток для предупреждения или лечения рака, например предупреждения или лечения инфекционных болезней, сердечно-сосудистых заболеваний и дегенеративных болезней.

Настоящее изобретение относится к применению одного или нескольких олигопептидов, которые блокируют инвазию и метастазирование раковых клеток, для предупреждения или лечения болезней с участием ММР-2.

Настоящее изобретение относится к применению одного или нескольких олигопептидов, которые блокируют инвазию и метастазирование раковых клеток, где указанные олигопептиды можно применять пациенту как вакцину, в виде инъекций, инфузий, ингаляций, суппозиториев или других фармацевтически приемлемых носителей и/или способов доставки.

Композиции настоящего изобретения могут находиться в форме пептида или пептидов в сочетании с, по меньшей мере, одним другим веществом, таким как стабилизатор, которые можно вводить в любом стерильном биологически совместимом фармацевтическом носителе, включая, но не ограничиваясь только ими, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, глюкозу и воду. Композиции можно вводить пациенту сами по себе или в сочетании с другими веществами, лекарственными средствами или гормонами. Фармацевтически приемлемые носители также могут содержать эксципиенты и вспомогательные вещества, облегчающие переработку активных соединений в препараты, которые можно использовать в фармацевтических целях. Другие подробности способов получения композиций и введения можно найти в последнем издании “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pa., включенном в данное описание в своей полноте путем отсылки. Фармацевтическая композиция может быть представлена в виде соли и может быть образована со многими кислотами, в том числе соляной, серной, уксусной, молочной, винной, яблочной, янтарной и другими кислотами. Соли имеют склонность лучше растворяться в водных или других протонных растворителях, чем соответствующие свободные основания.

Настоящее изобретение относится к олигопептидам, которые также можно применять как вакцины для получения антител для проведения анализов, используемых для диагностики заболеваний с участием ММР (в частности, ММР-2), а также для клинического мониторинга развития или регрессии данного заболевания путем анализов крови или в других подходящих диагностических анализах.

Приведенные далее примеры предназначаются для иллюстрации осуществимости данного изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Олигопептидные последовательности

Аминокислотную последовательность ММР-2 в отношении участков с высокими максимумами гидрофильности, обогащенных заряженными аминокислотами, идентифицируют с помощью компьютерной программы. Олигопептиды настоящего изобретения можно синтезировать или получить способами, хорошо известными в данной области (см., например, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., включено в данное описание в своей полноте путем отсылки). Олигопептиды, полученные и используемые в настоящем изобретении, перечислены в табл.1.

Ингибирующее действие указанных олигопептидов на инвазию в Matrigel и миграцию через мембрану Matrigel различных раковых клеток оценивают с использованием “Improved Matrigel Invasion Chamber” (Becton Dickinson, USA). Олигопептид TMRKPRCGNPDVAN, который, как показали Liotta and Associates, обладает активностью против ММР-2, используют в качестве стандартного образца сравнения для олигопептидов.

Общие условия экспериментов

Идентифицированные олигопептиды синтезируют специально. Затем их используют для исследований инвазии в Matrigel.

(a) Исследования инвазии в Matrigel

Исследования проводят с использованием “Improved Matrigel Invasion Chamber” (Becton Dickinson, USA).

В исследованиях с клетками меланомы человека фибробласты человека NHDF (Clontech) высевают на вкладыш “Matrigel” и оставляют до достижения конфлюэнтности. Это делают для того, чтобы хорошо имитировать условия in vivo, окружающие раковые клетки в теле. Затем на вкладыш высевают клетки меланомы человека А2058. В камеру добавляют кондиционированные среды от культуры фибробластов с добавлением разных количеств выбранного олигопептида. Систему инкубируют в течение примерно 24 часов. По окончании указанного периода клетки с верхней поверхности вкладыша удаляют. Клетки, которые проникли в мембрану Matrigel и мигрировали к нижней поверхности вкладыша, окрашивают “быстрым красителем” и подсчитывают под микроскопом. Процент ингибирования вычисляют по числу клеток, которые оказались не способными мигрировать через мембрану по сравнению с контролем (уровень содержания олигопептида “0”). Ингибирующую активность контроля принимают за “0”. Среды после проведения анализов на инвазию сохраняют для исследования с помощью зимограмм.

В исследованиях с клетками рака молочной железы человека MCF7 процедура, по существу, такая же, какую используют в случае клеток меланомы, за исключением того, что используют фибробласты MRC5 (АТСС) вместо NHDF.

В исследованиях с клетками рака молочной железы человека MDA-MB 231 в лунки помещают клетки фибробластов MRC5 (АТСС). В остальном процедура остается такой же, как в исследованиях с клетками MCF7.

(b) Исследования зимограмм

Среды (25-30 мкл) из разных лунок из исследования инвазии наносят на гели для зимограмм “Novex” (Invitrogen). Гели проявляют и окрашивают так, как рекомендует изготовитель. Металлопротеиназы матрикса (ММР) идентифицируют на основании их известных молекулярных масс.

Пример 1

Ингибирующее действие разных олигонуклеотидных последовательностей на инвазию в Matrigel и миграцию клеток меланомы А2058

Семь олигопептидов (их аминокислотные последовательности см. в табл.1) испытывают на ингибирование инвазии раковых клеток меланомы человека. Олигопептиды с аминокислотной последовательностью PRKPKWDK показывают блокирующую активность. Олигопептиды с аминокислотной последовательностью TMRKPRCGNPDVAN показывает примерно 11% ингибирование по сравнению с 73%, которые показывает PRKPKWDK (фиг.1).

Олигопептид VI с аминокислотной последовательностью LPPDVQRVD также обладает некоторой блокирующей активностью (т.е. примерно 20%). Олигопептид “I” с аминокислотной последовательностью GDVAPKTDKE не показывает никакой активности вплоть до концентрации 100 мкМ (на фиг.2 не показано) в отличие от 63%, показанных PRKPKWDK при той же концентрации.

Пример 2

Ингибирующее действие олигопептида PRKPKWDK на инвазию в Matrigel и миграцию клеток меланомы А2058

В данных исследованиях концентрацию PRKPKWDK в среде изменяют от 0 до 150 мкМ. Видно, что олигопептид ингибирует инвазию клетками меланомы по нарастающей (фиг.3) от примерно 37% при концентрации 50 мкМ до 73% при концентрации 150 мкМ.

Мембрана Matrigel является аналогом ЕСМ, и способность раковых клеток к разрушению и миграции на другую сторону мембраны отражает способность раковых клеток метастазировать в организме. Олигопептид способен существенно уменьшать инвазию трех разных типов раковых клеток. В данной тест-системе активность направлена против ЕСМ. Авторы считают, что поэтому их исследования четко показывают, что олигопептид может препятствовать разрушению ЕСМ в организме и посредством этого неблагоприятно воздействовать на развитие заболевания, при котором основным повреждением является разрушение ЕСМ.

Пример 3

В данных исследованиях определяют ингибирующее действие PRKPKWDK на инвазию в Matrigel и миграцию клеток рака молочной железы человека MCF7 (АТСС). Как и в случае клеток меланомы, данный олигопептид ингибирует клеточную инвазию. Ингибирование при концентрации 150 мкМ составляет примерно 70%. Оно повышается до примерно 90% при концентрации 200 мкМ (фиг.4).

Пример 4

В данных исследованиях исследуют ингибирующую активность PRKPKWDK в случае других клеток рака молочной железы человека -MDA-MB 231. Ингибирование при концентрации 150 мкМ составляет примерно 94%.

Пример 5

Затем оценивают, могут ли олигопептиды препятствовать действию фермента после его секреции. Исследования с помощью зимограмм не показывают какого-либо ингибирующего действия PRKPKWDK в отношении количества ММР-2, секретированной различными раковыми клетками (данные не приводятся).

Описан ряд воплощений изобретения. Тем не менее, следует иметь в виду, что можно осуществлять различные модификации, не отклоняясь от сущности и объема изобретения. Соответственно другие воплощения входят в объем настоящего изобретения, описанного в заявке.

Хотя вышеописанное изложено с множеством подробностей, последовательности приводятся для пояснения, но не для ограничения. Модификации и усовершенствования, включая эквиваленты, раскрытой выше технологии, находящиеся в пределах компетенции и возможностей специалистов в данной области техники, включены в объем формулы изобретения, прилагаемой к описанию. Для специалистов в данной области техники будет очевидно, что можно сделать многочисленные модификации, изменения и замены в отношении деталей, изложенных выше в описании, без отхода от изобретательского замысла, изложенного в описании. Например, модификации (или химические или ферментативные) основных последовательностей, описанных в данной заявке, также находятся в пределах содержания настоящего изобретения. Например, раскрытая последовательность может представлять собой дипептид или трипептид. Также раскрытые последовательности можно модифицировать путем включения остатка или в амино-, или в карбоксильный конец пептидов. Последовательности также можно химически модифицировать для повышения их активности (например, амидированием карбокси-концевой части последовательности). Пептиды также можно химически модифицировать для повышения их активности (например, амидированием карбокси-концевой части последовательности или включая остаток глицина или аланина в любой конец). Соответственно понятно, что различные модификации можно осуществить без отхода от сущности и объема изобретения и что такие изменения должны рассматриваться как входящие в объем настоящего изобретения, как изложено ниже в формуле изобретения.

Формула изобретения

1. Олигопептид, способный блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток, содержащий олигопептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

а) олигопептидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 или 6;

б) олигопептидной последовательности длиной от 8 до 10 аминокислотных остатков, включающей любую из последовательностей а);

в) олигопептидной последовательности, включающей любую из последовательностей от а) до б), в которой один или более аминокислотных остатков заменены аминокислотами со сходными зарядом, размером или характеристиками гидрофобности при условии, что олигопептидная последовательность обладает способностью блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток;

г) олигопептидной последовательности, включающей любую из последовательностей от а) до в), в которой аминокислотный остаток на N- или С-конце пропущен при условии, что олигопептидная последовательность обладает способностью блокировать инвазию и метастазирование раковых клеток;

д) олигопептидной последовательности, включающей один или более повторов любой из олигопептидных последовательностей от а) до г), ковалентно связанных друг с другом; и

е) олигопептидной последовательности, включающей любую из последовательностей от а) до д), способной индуцировать иммунный ответ против белка, содержащего эпитоп, имеющий последовательность олигопептида.

2. Олигопептид по п.1, конъюгированный с гаптенами, усиливающими иммунный ответ.

3. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения дегенеративных заболеваний, или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР), включающая олигопептид по п.1 или 2.

4. Диагностическая композиция для выявления дегенеративных заболеваний, или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР), включающая олигопептид по п.1 или 2.

5. Вакцина для предупреждения или лечения дегенеративных заболеваний, или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР), включающая олигопептид по п.1 или 2.

6. Применение олигопептида по п.1 или 2 для получения фармацевтической композиции для предупреждения или лечения дегенеративных заболеваний, или патологических состояний, обусловленных разрушением внеклеточного матрикса (ЕСМ) металлопротеиназами матрикса (ММР).

7. Применение по п.6, в котором указанная фармацевтическая композиция вводится пациенту в качестве вакцины в виде инъекции, инфузии, ингаляции или суппозитория.

8. Применение по п.6 или 7, в котором указанный олигопептид вводят в состав композиции в концентрации, варьирующей от 1 до 500 мкМ или от 50 до 200 мкМ.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 24.01.2009

Извещение опубликовано: 10.07.2010 БИ: 19/2010

NF4A – Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.07.2010

Извещение опубликовано: 27.07.2010 БИ: 21/2010