Патент на изобретение №2346037

(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в пищевой промышленности в производстве продуктов диетического и диабетического назначения и в медицине. Способ предусматривает приготовление питательной среды, содержащей в своем составе (г/л): дрожжевой экстракт – 20; MgSO₄·7H₂O – 0,1; NaCl – 0,01; CaCl₂ – 0,02; KH₃PO₄ – 20; MnSO₄ – 0,01; FeSO₄ – 0,01; сахарозу – 175. Затем приготовленную питательную среду засевают бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды, и культивируют без аэрации в течение 12 часов при температуре 27°С и рН среды 7,0. Изобретение позволяет увеличить выход биомассы бактериальных клеток. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения штаммов – продуцентов изомальтулозосинтазы. Фермент может найти применение в пищевой промышленности в производстве продуктов диетического и диабетического назначения и в медицине.

Техническая задача изобретения – разработка способа культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280, обладающих изомальтулозосинтазной активностью.

Способ культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280, предусматривает приготовление питательной среды, содержащей в своем составе (г/л): дрожжевой экстракт – 20; MgSO₄·7H₂O – 0,1; NaCl – 0,01; CaCl₂ – 0,02; KH₃PO₄ – 20; MnSO₄ – 0,01; FeSO₄ – 0,01; сахарозу – 175, воду – остальное, засев ее бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды, культивирование бактерий без аэрации в течение 12 часов при температуре 27°С и рН 7,0.

Технический результат заключается в повышении изомальтулозосинтазной активности бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280, интенсификации процесса получения фермента, увеличении выхода биомассы бактериальных клеток.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят питательную среду следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт – 20; MgSO₄·7H₂O – 0,1; NaCl – 0,01; CaCl₂ – 0,02; KH₂PO₄ – 20; MnSO₄ – 0,01; FeSO₄ – 0,01; сахароза – 175, вода – остальное, значение рН среды 7,0, засевают бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды, культивирование бактерий ведут без аэрации в течение 12 часов при температуре 27°С. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с объемом питательной среды 200 мл. Культуральную жидкость отделяют центрифугированием от клеток, отбирают 0,1 мл культуральной жидкости и используют для определения активности изомальтулозосинтазы, бактериальные клетки взвешивают для определения выхода биомассы.

С целью определения ферментативной активности используют следующий состав реакционной смеси: 0,2 мл 4% сахарозы, 0,1 мл культуральной жидкости. Реакция протекает при температуре 35°С, время реакции составляет 30 минут. Определение концентрации изомальтулозы, образовавшейся в процессе изомеризации сахарозы, осуществляют по методу Сомоджи-Нельсона с учетом коэффициента пересчета, полученного при построении калибровочного графика. Об активности изомальтулозосинтазы судят по изменению концентрации изомальтулозы, полученной в результате изомеризации сахарозы. Активность изомальтулозосинтазы рассчитывают по формуле

где С_им – концентрация изомальтулозы, мкг/мл;

Mr_им – молекулярная масса изомальтулозы,

– время гидролиза, мин;

n – разведение.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 на среде с содержанием сахарозы в среде 125 г/л.

Готовят питательную среду следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт – 20; MgSO₄·7H₂O – 0,1; NaCl – 0,01; CaCl₂ – 0,02; KH₃PO₄ – 20; MnSO₄ – 0,01; FeSO₄ – 0,01; сахароза – 125, вода – остальное, значение рН среды 7,0, засевают бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды, культивирование бактерий ведут без аэрации в течение 12 часов при температуре 27°С. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с объемом питательной среды 200 мл. Культуральную жидкость отделяют центрифугированием от клеток, отбирают 0,1 мл культуральной жидкости и используют для определения активности изомальтулозосинтазы. Бактериальные клетки взвешивают для определения выхода биомассы. Данные анализа представлены в таблице.

Пример 2.

Продуцент выращивают на питательной среде, аналогичной примеру 1, но сахарозу добавляют в количестве 175 г/л. Культивирование бактерий проводят аналогично примеру 1. Данные анализа представлены в таблице.

Пример 3.

Продуцент выращивают на питательной среде, аналогичной примеру 1, но сахарозу добавляют в количестве 220 г/л. Культивирование бактерий проводят аналогично примеру 1. Данные анализа представлены в таблице.

Как видно из таблицы, способ культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 на питательной среде следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт – 20; MgSO₄·7H₂O – 0,1; NaCl – 0,01; CaCl₂ – 0,02; KH₂PO₄ – 20; MnSO₄ – 0,01; FeSO₄ – 0,01, вода – остальное с содержанием сахарозы 125-220, количеством посевного материала бактерий 8%, температурой культивирования 27°С в течение 12 часов наиболее эффективен для максимального биосинтеза изомальтулозосинтазы.

Предложенный способ культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 позволяет:

– повысить активность изомальтулозосинтазы Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280;

– интенсифицировать процесс получения фермента;

– повысить выход биомассы бактериальных клеток.

Аналоги не обнаружены.

Формула изобретения

Способ культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280, предусматривающий приготовление питательной среды, содержащей в своем составе, г/л: дрожжевой экстракт – 20; MgSO₄·7H₂O – 0,1; NaCl – 0,01; CaCl₂ – 0,02; KH₃PO₄ – 20; MnSO₄ – 0,01; FeSO₄ – 0,01; сахарозу – 175, засев ее бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды и культивирование без аэрации в течение 12 ч при температуре 27°С и рН среды 7,0.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.11.2008

Извещение опубликовано: 10.07.2010 БИ: 19/2010

NF4A – Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.07.2010

Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010