Патент на изобретение №2346036

(54) ПРОБИОТИКИ ДЛЯ НЕРВНО-МЫШЕЧНОЙ ФУНКЦИИ КИШЕЧНИКА

(57) Реферат:

Штамм Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 применяют для предупреждения или лечения нервно-мышечных нарушений кишечника, обусловленных инфекциями кишечника патогенами. Такие нарушения ассоциированы, например, со спастической болью в животе (коликами) у младенцев, болью в кишечнике или дискомфортом кишечника в общем. Штамм Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 применяют для предупреждения или лечения кишечных осложнений после инфекции кишечника патогенами. Пробиотик включает мертвые бактерии, ферментационный субстрат и/или полученный из Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 материал. Это обеспечивает достижение благотворных эффектов за счет способности действовать непосредственно на сократительную способность мышц. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

Область техники

Данное изобретение относится к применению выбранного пробиотика для приготовления питательной композиции или лекарственного средства для предупреждения или лечения боли кишечника или дискомфорта кишечника, моторной дисфункции в кишечнике, нервно-мышечных нарушений кишечника и осложнений после инфекции кишечника.

Данное изобретение относится также к способу предупреждения или лечения боли кишечника или дискомфорта кишечника и персистирующей моторной дисфункции в кишечнике.

Предшествующий уровень техники

Пробиотики обычно определяются как пищевая добавка с живыми микроорганизмами, которая благотворным образом действует на человека-хозяина или животного-хозяина улучшением баланса его кишечной микрофлоры. До настоящего времени сообщались или предполагались несколько различных благотворных действий пробиотиков, таких как вытеснение инфекции Heliobacter (EP 057903), усиление сопротивления колонизации, в частности, в отношении видов Clostridium, уменьшение сывороточного холестерина, влияние на иммунную систему хозяина, например на уровень гуморальной и клеточной иммунной системы.

EP 0768375 описывает Bifidobacteria, которые способны имплантироваться во флоре кишечника для прикрепления к кишечным клеткам и конкурентной элиминации патогенных бактерий на кишечных клетках.

В WO 98/00035 описаны энтеральные композиции, содержащие несколько молочно-кислых бактерий, которые, как было показано, стимулируют иммунную систему, как измерено по количеству Т CD4+ лимфоцитов периферической крови.

Когда люди и млекопитающие животные страдают от дискомфорта кишечника или боли кишечника, эти симптомы часто являются симптомами нарушений перистальтики кишечника или, другими словами, нервно-мышечными нарушениями кишечника.

Индивидуумы любого возраста и во многих обстоятельствах страдают от нервно-мышечных нарушений кишечника. Примерами являются младенцы, страдающие от спастической боли в животе (колик) и абдоминальной повторяющейся боли, женщины, страдающие от боли в кишечнике, вызываемой гормональным циклом, и многие другие.

В контексте синдрома раздраженного кишечника (IBS) предшествующий уровень техники не рассматривал действия пробиотиков на этот конкретный синдром. В недавнем исследовании (Niedzielin К et al. A controlled, double-blind, randomized study on the efficacy of Lactobacillus plantarum 299V in patients with irritable bowel syndrome, European Journal of Gastroenterology & Hepatology 2001, 13:1143-1147) обнаружено, что пробиотики могут играть роль в регуляции перистальтики пищеварительного тракта.

С другой стороны, в статье ОSullivan MA and OMorain (Bacterial supplementation in the irritable bowel syndrome. A randomized double-blind placebo-controlled crossover study, Dig Liv Dis 2000 May; 32(4):302-4) не были обнаружены значимые различия между средними величинами штамма GG Lactobacillus casei и плацебо. Другие сообщения предыдущего уровня подтверждают последнее открытие.

Thompson WG (Probiotics for irritable bowel syndrome: a light in the darkness? Ew. J gastroenterol Hepatol 13:1135-1136, 2001) обсуждает потенциальное лечение IBS пробиотиками.

Целью данного изобретения является облегчение любой боли или любого дискомфорта, связанных с измененной нервно-мышечной регуляцией и измененной моторной функцией в кишечнике.

Данное изобретение имеет главной целью уменьшение и/или ослабление нервно-мышечных нарушений кишечника, ассоциированных с любым возможным обстоятельством в жизни индивидуума.

Краткое описание изобретения

Примечательным является то, что пробиотические микроорганизмы, их метаболиты и/или их субстраты роста влияют на нервно-мышечную регуляцию в кишечнике. В частности, было показано, что специфические пробиотики применимы для уменьшения нервно-мышечных нарушений в желудочно-кишечном тракте, в частности, после инфекции.

Таким образом, в первом аспекте данное изобретение обеспечивает применение выбранного пробиотика или смеси выбранных пробиотиков в приготовлении питательной композиции или лекарственного средства для предупреждения или лечения боли кишечника или дискомфорта кишечника.

Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает применение выбранного пробиотика или смеси выбранных пробиотиков в приготовлении питательной композиции или лекарственного средства для предупреждения или лечения моторной дисфункции в кишечнике.

В третьем аспекте данное изобретение обеспечивает применение выбранного пробиотика или смеси выбранных пробиотиков в приготовлении питательной композиции или лекарственного средства для предупреждения или лечения нервно-мышечных нарушений кишечника.

В четвертом аспекте данное изобретение обеспечивает применение выбранного пробиотика или смеси выбранных пробиотиков в приготовлении питательной композиции или лекарственного средства для предупреждения или лечения осложнений после инфекции кишечника.

В следующем аспекте данное изобретение обеспечивает способ предупреждения или лечения боли кишечника или дискомфорта кишечника введением человеку или животному эффективного количества выбранного пробиотика или смеси выбранных пробиотиков.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ предупреждения или лечения моторной дисфункции или постинфекционной гиперперистальтики в кишечнике, предусматривающий стадию введения эффективного количества выбранного пробиотика или смеси выбранных пробиотиков.

Преимущество данного изобретения заключается в том, что оно обеспечивает возможность лечения или предупреждения нервно-мышечных нарушений кишечника и ассоциированных симптомов, проблем или состояний заболеваний кишечника.

Другое преимущество данного изобретения заключается в том, что оно обеспечивает возможность лечения или предупреждения нервно-мышечных нарушений кишечника без введения фармацевтических лекарственных средств, но на основе пробиотических микроорганизмов или их производных пищевой категории.

Описание чертежей

Фиг.1 показывает площадь под кривой (AUC) интенсивности сокращения мышечной ткани кишечника, взятой из организма-хозяина, который был инфицирован нематодным паразитом и, спустя 10 дней после инфекции, получал в виде корма различные пробиотики, и контроля. Стимуляцию производили карбаколом в различных концентрациях (подробности приведены в примере 2). AUC является мерой интенсивности и неподатливости сокращения мышцы кишечника и мерой степени нервно-мышечного нарушения, развитого во время инфекции. Символы имеют следующее значение: – контроль, – Lactobacillus acidophilus (johnsonii), × – Bifidobacterium longum, * – Bifidobacterium lactis, – Lactobacillus paracasei. Можно видеть, что пробиотики обычно уменьшают AUC, посредством чего различные штаммы имеют более или менее выраженное действие.

Фиг.2 показывает тоническое сокращение (А) и фазовое сокращение (В) мышечной ткани, описанные для фиг.1, но стимулированные электрическим полем, и сравнивает организмы-хозяева, получающие в виде корма пробиотический штамм Lactobacillus paracasei (CNCM 1-2116) в живом состоянии (L.p.), мертвом состоянии (мертвый L.p.) и только супернатант среды (Sn). Термины “тоническое увеличение” и “фазовое сокращение” объясняются в примере 2 и фиг.3. Как можно видеть, все полученные из пробиотика корма (живые или мертвые бактерии, супернатант) имеют явно более низкое тоническое увеличение и фазовое сокращение, чем контроль (MRS).

Фиг.3 поясняет принцип способа, используемого для определения нервно-мышечных нарушений после инфекции. Эта кривая показывает запись стимуляции мышцы in vitro. Перед стимуляцией регистрируют базовый (исходный) тонус (1) и базовое (исходное) фазовое сокращение (4). После стимуляции имеет место сокращение мышцы, которое регистрируется как стимулированный тонус (2) и стимулированное фазовое сокращение (5). Может быть также рассчитана площадь под кривой (AUC) (7). Для статистики сравнивают тоническое сокращение (3), фазовое сокращение (6) и AUC (7) контроля с вариантами обработки.

Подробное описание изобретения

В контексте данного описания слово “содержит” обозначает “включает среди прочего”. Оно не должно рассматриваться как “состоит только из”.

Для цели данного изобретения термин “выбранные пробиотические микроорганизмы” или просто “выбранный пробиотик” обозначает любой микроорганизм, который способен проявлять благотворные действия, сообщенные здесь, или комбинацию, или смесь таких пробиотиков. Таким образом, пробиотик может быть выбран из известных пробиотических штаммов. Однако микроорганизм, о котором до сих пор неизвестно, что он имеет пробиотические свойства, может оказаться имеющим благотворное действие в соответствии с данным изобретением и, следовательно, будет включен в термин пробиотик.

В контексте данного изобретения термин “пищевая композиция” предназначен для охвата любого годного в пищу материала. Таким образом, пищевая композиция может быть продуктом, предназначенным для употребления в пищу людьми, но этот термин включает также продукты, подлежащие употреблению животными, например домашними животными, такими как собаки, кошки, кролики, морские свинки, мыши, крысы, птицы (например, попугаи), пресмыкающиеся и рыбы. Однако этот термин включает также корм, употребляемый в пищу другими прирученными животными, например кормовые продукты для скота, например крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец, коз, буйволов, верблюдов и т.п.

Пищевая композиция может быть пищевым продуктом, предназначенным для употребления в пищу человеком, например напитком, плиткой, снеком, мороженым, молочным продуктом, например охлажденным или стабильным при хранении молочным продуктом, кондитерским изделием, зерновым продуктом, таким как зерновой завтрак, замороженным продуктом, предназначенным для употребления в пищу после нагревания в микроволновой печи или духовке, готовым для еды продуктом, быстрозамороженным пищевым продуктом или питательной смесью.

Питательная смесь включает любую питательную полную или дополнительную смесь. Она может быть обычно применяемой питательной смесью, смесью для детей и младенцев, смесью для пожилых пациентов, для пациентов интенсивной терапии или специально адаптированной смесью для пациентов, страдающих, например, от конкретного заболевания. Например, питательные смеси могут быть адаптированы для пациентов, страдающих от связанных с питанием проблем, таких как болезнь Крона, гипергликемия, ожирение, потеря массы, диарея, понос, фенилкетонурия, гепатит, острая или хроническая почечная недостаточность, среди прочих. Такие смеси могут быть восстанавливаемыми, т.е. находиться в высушенной форме, или готовыми для питья, например в форме жидких смесей.

В контексте данного изобретения термин “кишечные нервно-мышечные нарушения” включает все связанные с болью или дискомфортом симптомы, которые связаны с отклоняющимися от нормы или нарушенными кишечно-мышечными сокращениями, сократимостью или перистальтикой. Например, эти нарушения ассоциированы с беспокоящим вздутием живота или нарушенной дефекацией, со спастическими болями (коликами) у младенцев и/или детей, с инвагинацией кишечника у людей или домашних животных, с нарушенным временем прохождения через кишечник, после инъекции кишечника паразитами, такими как, например, нематоды и патогенные бактерии.

Дополнительные кишечно-нервно-мышечные нарушения в контексте данного изобретения включают нарушения, ассоциированные с грудным возрастом, например, в виде части проблем спастической боли (колик) младенцев, нарушения, ассоциированные с физическими упражнениями, в том числе проявление болезненных судорог, индуцированных упражнением, и нервно-мышечные проблемы, ассоциированные с интенсивными упражнениями и атлетикой, нарушения, ассоциированные с беременностью, и нарушения, ассоциированные с деторождением, нарушения, ассоциированные с клиническими пациентами, имеющими другие, не относящиеся к этому повреждения, травму или инфекции, но клиническое лечение которых или ситуация вызывают потерю кишечной нервно-мышечной регуляции, в том числе антибиотики, иммобилизация и парентеральное или энтеральное кормление, нарушения, ассоциированные со старением и потерей нервно-мышечной регуляции, связанные с уменьшенной активностью, диетами с низким содержанием клетчатки и изменением микрофлоры, нарушения, ассоциированные с необычными диетическими привычками или необычным стилем жизни, в том числе потреблением алкоголя, лекарственных средств, дающих нервно-мышечные побочные действия, измененной силой тяжести астронавтов, сильной жарой или сильным холодом и проблемами регидратации.

“Моторная дисфункция” является эквивалентом кишечных нервно-мышечных нарушений, которые обычно сопровождают инфекцию желудочно-кишечного тракта человека или животного патогенными организмами, такими как нематоды, цестоды и некоторые бактерии, например Helicobacter pylori или Salmonella. Моторная дисфункция может также встречаться во время или после воспаления, обусловленного другими причинами.

Во многих случаях кишечные нервно-мышечные нарушения или моторная дисфункция являются стойкими и продолжаются в течение продолжительного времени.

Предпочтительно применение в соответствии с данным изобретением относится к боли или дискомфорту кишечника, относящимся к мышечным нарушениям кишечника или связанным с мышечными нарушениями кишечника.

“Осложнения” являются нарушениями или отклонениями от здорового состояния, которые сохраняются стойко после инфекции, даже в том случае, если паразиты или другие инфекционные агенты были элиминированы из хозяина. Предполагается, что они являются обычно необратимыми повреждениями, которые индуцированы в хозяине.

“Полученный из пробиотиков материал” в контексте данного изобретения включает живые или мертвые пробиотики, среду, полученную ферментацией с пробиотиком, метаболита, обнаруживаемые в этой среде после ферментации, и ее производные, такие как концентраты, например ферментационный субстрат, супернатант и/или ретентат среды после элиминации пробиотических бактерий, например фильтрованием или центрифугированием.

В одном варианте осуществления данного изобретения боль или дискомфорт кишечника, моторная дисфункция или нервно-мышечные нарушения кишечника вызываются инфекциями кишечника патогенами.

Патогены в контексте данного изобретения включают микроорганизмы, которые могут инфицировать кишечники индивидуумов и вызывать состояния заболевания. Таким образом, термин “патоген” включает паразитов, бактерии, вирусы, многоклеточные организмы, такие как нематоды и другие черви.

Выбор пробиотика

В качестве пробиотика может быть выбран любой подходящий микроорганизм. Предпочтительно, пробиотик в соответствии с данным изобретением выбирают из микроорганизмов, проявляющих благотворное действие на здоровье и самочувствие людей или животных.

В литературе упоминаются некоторые из микроорганизмов, из которых могут быть выбраны пробиотики в соответствии с данным изобретением. Например, ЕР 0862863 А1, в частности, на странице 3 в строчках 25-37 содержит перечень, из которого может быть выбран пробиотик в соответствии с данным изобретением.

Примеры подходящих пробиотических микроорганизмов включают дрожжи, такие как Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia и Torulopsis, плесени, такие как Aspergillus, Rhizopus, Mucor и Penicillium, и бактерии, такие как роды Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Kocuria, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus и Lactobacillus.

Конкретными примерами подходящих пробиотических микроорганизмов являются: Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus coagulans, B. lentus, B. licheniformis, B. mesentericus, B. pumilus, B. subtilis, B. natto, Bacteroides amylophilus, Вас. capillosus, Вас. ruminocola, Вас. Suis, Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. pseudolongum, B. thermophilum, Candida pintolepesti, Clostridium butyricum, Enterococcus cremoris, E. diacetylactis, E. faecium, E. intermedius, E. lactis, E. muntdi, E. thermophilus, Escherichia coli, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus acidophilus, L. alimentarius, L. amylovorus, L. crispatus, L. brevis, L. casei, L. curvatus, L. cellobiosus, L. delbrueckii ss. bulgaricus, L. farciminis, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. lactis, L. plantarum, L. johnsonii, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius, Leuconostoc mesenteroides, P. cereviseae (damnosus), Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Propionibacterium freudenreichii, Prop. shermanii, Saccharomyces cereviseae, Staphylococcus carnosus, Staph. xylosus, Streptococcus infantarius, Strep. salivarius ss. thermophilus, Strep. thermophilus, Strep. lactis.

Например, пробиотические штамм или штаммы могут быть выбраны из группы, состоящей из Bacillus licheniformis (DSM 5749), В. subtilis (DSM 5750), Bifidobacterium lactis (DSM 20215), штаммов Enterococcus faecium (например, NCIMB 10415; NCIMB 11181; NCIMB 30098; DSM 3520; DSM 4788; DSM 4789; DSM 5464; DSM 7134; CECT 4515), E. mundtii (CNCM MA 27/4E), штаммов Saccharomyces cerevisiae (например, BCCM/MUCL 39885; CBS 49394; CNCM 1-1077; CNCM 1-1079; NCYC Sc 47), Lactobacillus casei (NCIMB 30096), L. farciminis (CNCM MA 67/4 R), L. johnsonii (1-1225 CNCM), Lactobacillus paracasei (1-2116 CNCM), L. planterum (CNCM 1-840), L. rhamnosus (DSM 7133), P. acidilactici (CNCM MA 18/5 M), Streptococcus mfantarius (CNCM 1-841), Streptococcus thermophilus (Chr. Hansen) и, например, их смесей.

Дополнительные примеры пробиотических видов с примерными, депонированными штаммами этих видов в соответствии с данным изобретением могут быть выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus reuteri (CNCM 1-2452, CNCM 1-2448, CNCM 1-2450, CNCM 1-2451), Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-2449), Lactobacillus acidophilus (CNCM 1-2453) и их смесей. Штаммы, упомянутые в этом абзаце, могут быть, например, подходящими для домашних животных.

Эффективный пробиотик в соответствии с данным изобретением может быть выбран с помощью скрининга из приведенного выше перечня. Хотя может быть использован потенциально любой способ скрининга, относительно быстрым оказался способ, разработанный в Barbara G., Vallance B.A., Collins S.M. Persistent intestinal neuromuscular dysfunction after acute nematode infection in mice, Gastroenterology 1997; 113: 1224-1232. Эта ссылка описывает модель для измерения интенсивности кишечных нервно-мышечных нарушений.

Таким образом, подходящий пробиотик может быть выбран с использованием стадий:

– выбора, по меньшей мере, одного организма отдельного вида животного или людей, который страдает от кишечных нервно-мышечных нарушений,

– энтерального введения этому организму полученного из пробиотика материала,

– измерения первой сократительной способности с использованием кишечной мышечной ткани этого организма,

– сравнения этой первой сократительной способности со второй сократительной способностью отрицательного контроля и

– выбора пробиотического штамма, который вызвал уменьшенную первую сократительную способность мышечной ткани организма, получившего этот пробиотик, в сравнении с отрицательным контролем.

Термин “отрицательный контроль” в контексте скрининга для выбора специфических пробиотических штаммов обозначает кишечно-мышечную ткань из организма, страдающего от кишечных нервно-мышечных нарушений, которому не вводили энтерально полученный из пробиотика материал.

Этот скрининг предусматривает стадию измерения первой сократительной способности с использованием кишечной мышечной ткани организма и, кроме того, стадию сравнения этой первой сократительной способности со второй сократительной способностью отрицательного контроля.

Сократительная способность может быть измерена любым подходящим способом. Например, используют способ Barbara G., Vallance B.A., Collins S.M. (см. выше). См., в частности, главы “Tissue Preparation for Contractility Studies”, “Measurement of Contraction”, “Parameters of Electrical Field Stimulation”, “Drugs and Solutions” и “Data Expression and Statistical Analysis”, страницы 1225-1226, которые включены здесь в качестве ссылки.

Таким образом, сократительную способность измеряют in vitro, т.е. иссечением сегментов кишечника, например проксимальной тощей кишки, фиксированием этих сегментов в бане для ткани, индуцированием мышечного сокращения, например, химическим или электрическим стимулятором, и регистрацией сокращения с использованием подходящего узла обработки данных.

Измерения базального тонуса (1), стимулированного тонуса (2) и тонического сокращения (тонической судороги) (3), а также базального фазового (4), стимулированного фазового сокращения (5), фазового сокращения (6) и площади под кривой (7), как показано на фиг.3, могут служить в качестве параметров для сократительной способности.

Выбранный пробиотик в соответствии с данным изобретением является пробиотиком, который при вышеуказанном способе скрининга уменьшает кишечную мышечную сократительную способность в организме, страдающем от кишечных нервно-мышечных нарушений, например, в сравнении с отрицательным контролем.

В варианте осуществления данного изобретения выбранный пробиотик является пробиотиком, который способен в мышиной модели действовать на индуцированную патогеном иммунную реакцию таким образом, что он значимо уменьшает количество высвобождаемых Th2 цитокинов. Предпочтительно высвобождаемыми Th2 цитокинами являются IL-4 и/или IL-13.

“Значимое” в контексте данного изобретения обозначает статистически значимое различие в отношении Р<0,1, предпочтительно р<0,05, которое получают при сравнении инфицированных мышей, которые получают пробиотики (вариант обработка), с отрицательным контролем.

Обычно цитокины могут быть измерены в препарате продольной мышцы мышечной оболочки кишечника (LMMP) в заданном периоде после инфекции. Предпочтительно цитокины измеряют в LMMP спустя 14 дней после инфекции. Концентрация цитокинов может быть измерена с использованием коммерчески получаемых наборов и с использованием инструкций изготовителей.

Предпочтительный способ оценки, способен ли пробиотик значимо уменьшать высвобождаемые Th2 цитокины, включает мышиную модель и представлен ниже.

Самкам мышей NIH swiss (в возрасте 6-8 недель) (каждой) вводят ежедневно кормлением через желудочный зонд 375 личинок Trichinella spiralis (см. способ Barbara G. et al, выше).

Для определения влияния пробиотиков инфицированным мышам вводят через желудочный зонд со дня 10 до дня 21 после инфекции 100 мкл 10¹⁰ пробиотических микроорганизмов (бактерий, дрожжей и т.д.) с использованием 100 мкл MRS в качестве отрицательного контроля.

LMMP может быть препарирована иссечением всей тощей кишки, промыванием в холодном стерильном ЗФР и разрезанием на 4 секции. Брызжейку удаляют и кусочки кишки помещают на стеклянный стержень. Мышечный слой соскребают с использованием чистого ватного тампона, быстро замораживают и хранят при -70°С до анализа. Успешное выделение мышцы может быть подтверждено гистологической оценкой. Мышечную ткань помещают в 1 мл лизисного буфера, содержащего 10% NP-40, 10 мг/мл ФМСФ в изопропаноле, 1 мг/мл апротинина и 1 мг/мл лейпептина. После гомогенизации мышечной ткани измеряют общую концентрацию белка (анализ белка Bio-Rad, Hercules, CA, USA), и пробы делят на аликвоты и хранят при -70°С для дополнительного анализа.

Концентрация IL-4 и IL-13 (цитокины Th2) и другие воспалительные медиаторы TGF-1 и PGE2 могут быть измерены в LMMP с использованием коммерческих наборов (Quantikine M Murine, Minneapolis, MN, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя.

В другом варианте осуществления данного изобретения пробиотиком является пробиотик, который способен в мышиной модели влиять на индуцированное патогеном воспаление таким образом, что он значимо уменьшает экспрессию или концентрацию COX-2, TGF-1 или PGE2 в LMMP.

Концентрация TGF-1 или PGE2 может быть измерена анализом LMMP с использованием коммерчески доступных наборов, указанных выше для IL-4 и IL-13.

Предпочтительный способ оценки значимых различий, в частности экспрессии TGF-1 и СОХ-2 в LMMP инфицированных мышей, приведен ниже.

Экспрессию информационной РНК (мРНК) TGF-1 и СОХ-2 измеряют в LMMP спустя 14 дней после инфекции. Общую РНК выделяют из LMMP с использованием одностадийного способа (Chonczynski P., Sacci N. “Single step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction,” Ann Biochem 162: 156-159; 1987).

Обратную транскрипцию и реакции ПЦР выполняют, как описано Verdu E.F. et al. (Modulatory effect of estrogen in two murine models of experimental colitis. Am J Physiol gastrointest Liver Physiol 2000; 283: G27-36).

Используют следующие праймеры. HPRT (гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза, используемая в качестве контроля для стандартизации): смысловой 5-GTT GGA TAC AGG ССА GAC ТТТ GTT G-3, антисмысловой 5-GAT ТСА ACT TGC GCT CAT CTT AGG C-3 (Svetic A, “Cytokine expression after immunization” J Immun 147: 2391-7). TGF: смысловой 5-TCA CCC GCG TGC СТА ATG GT-3 и антисмысловой 5-GGA GCT GAA GCA ATA GTT GG-3 (Derynck R, Rhee L, Nucleic Acid Res 1987; 15: 3187-97); COX-2: смысловой 5 TGG TGC CGG GTC TGA TGA TG-3 и антисмысловой 5-GCA ATG CGG TTC TGA TAC TG-3 (Gustafson-Svard et al., Cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 gene expression in human colorectal adenocarcinomas and azomethan induced colonic tumours in rats. Gut 1996; 38: 79-84).

Для исключения амплификации геномной ДНК, загрязняющей пробы, эксперименты проводили также с использованием РНК в качестве субстрата для ПЦР. После амплификации 15 мкл продуктов ПЦР разделяли электрофоретически в 2% агарозном геле, визуализировали окрашиванием бромидом этидия и фотографировали с использованием Polaroid land film type 55 (Kodak, Rochester, NY). Негативы использовали для денситометрического количественного определения интенсивности полосы с использованием программного обеспечения Kodak Digital Science ID 2.0 Image Analysis. Эти результаты нормализовали относительно гена HPRT “домашнего хозяйства” и выражали в виде отношения экспрессии мРНК цитокинов к мРНК HPRT.

В одном варианте осуществления данного изобретения выбранным пробиотиком является Bifidobacterium. Предпочтительно им является Bifidobacterium lactis или Bifidobacterium longum.

В следующем варианте осуществления данного изобретения выбранным пробиотиком является Lactobacillus paracasei.

Еще в одном варианте осуществления данного изобретения выбранный пробиотик выбран из группы, состоящей из Bifidobacterium longum (CNCM 1-2170), Bifidobacterium lactis (German Culture Collection: DSM20215), Lactobacillus paracasei (CNCM I-2116, CNCM I-1292) и их смеси.

Еще в одном варианте осуществления данного изобретения этот пробиотик включает мертвые пробиотические бактерии, ферментационный субстрат и/или полученный из пробиотика материал.

Необязательно, пробиотики включают также их ферментационный субстрат в качестве пребиотика. Специалисту с квалификацией в данной области обычно известны ферментационные субстраты пробиотиков. Например, Bifidobacteria могут использовать инулин и/или олигофруктозу в качестве ферментационного субстрата.

Получение пробиотиков

Специалисту с квалификацией в данной области известно, как получить выбранный пробиотический микроорганизм. Пробиотики могут быть получены от коммерческих поставщиков или могут быть получены обычно ферментационным процессом и, необязательно, сушкой. Специфические штаммы часто имеют конкретные предпочтения в отношении среды или субстрата, о которых известно специалисту с квалификацией в данной области.

Эти микроорганизмы могут находиться в высушенной форме или, например, в форме спор для микроорганизмов, образующих споры. Сушка микроорганизмов после получения ферментацией известна специалисту с квалификацией в данной области. См., например, ЕР 0818529 (SOCIETE DES PRODUITS NESTLE), где описан способ распылительной сушки, или WO 0144440 (INRA). Обычно бактериальные микроорганизмы концентрируют из среды и сушат распылительной сушкой, сушкой в псевдоожиженном слое, лиофилизацией (сушкой вымораживанием) или другим адекватным процессом сушки. Например, микроорганизмы могут быть смешаны с материалом-носителем, таким как углевод, например сахароза, лактоза или мальтодекстрин, липид или белок, например сухое молоко, во время сушки или перед сушкой.

Однако эти микроорганизмы не должны непременно присутствовать в высушенной форме. Может быть удобным смешивать их непосредственно после ферментации с пищевым продуктом для необязательного выполнения процесса сушки после этого. Такой подход описан в WO 02065840 (SOCIETE DES PRODUITS NESTLE). Подобным образом пробиотики могут, теоретически, употребляться в пищу непосредственно после ферментации. Дальнейшая обработка, например, ради приготовления подходящих пищевых продуктов не является обязательным предварительным условием для благотворных свойств пробиотиков.

Многие пробиотики, подходящие для проведения данного изобретения, являются коммерчески доступными и могут быть получены в порошкообразной форме от многочисленных поставщиков, например, Bifidobacterium lactis (DSM 20215) может быть получен из Ch. Hansen.

Специалисту с квалификацией в данной области известны многочисленные различные поставщики пробиотиков. Некоторые поставщики поставляют пробиотики в специфической инкапсулированной форме для гарантии высокой степени выживания микроорганизмов во время прохождения через желудочно-кишечный тракт или во время хранения или высокого срока годности данного продукта.

Пример продукта, содержащего микроорганизмы, имеющие увеличенную стабильность при хранении без чрезмерной потери, описан в ЕР 0180743, а также в WO 02065840 (SOCIETE DES PRODUITS NESTLE).

Пробиотики в соответствии с данным изобретением могут употребляться энтерально в любой форме. Они могут добавляться к пищевой композиции, такой как пищевой продукт. С другой стороны, они могут употребляться непосредственно, например, в высушенной форме или непосредственно после получения биомассы посредством ферментации.

Пробиотики могут, например, употребляться в форме ферментированного молочного продукта, такого как охлажденный молочный продукт, йогурт или свежий сыр. В этих последних случаях пробиотик может быть использован также непосредственно для приготовления самого ферментированного продукта и, следовательно, имеет, по меньшей мере, двойную функцию: пробиотические функции в контексте данного изобретения и функцию ферментации субстрата, такого как молоко, для получения йогурта.

Если пробиотик добавляют к пищевой смеси, специалисту с квалификацией в данной области будут известны возможности достижения этого. Высушенные, например высушенные распылительной сушкой, бактерии, такие как получаемые посредством процесса, описанного в ЕР 0818529, могут быть добавлены непосредственно к пищевой смеси в порошкообразной форме или к любому другому, необязательно высушенному пищевому продукту. Например, порошкообразный пробиотический препарат может быть добавлен к пищевой смеси, зерновым завтракам, салатам, кусочку хлеба перед употреблением в пищу.

Питательные смеси, содержащие специфические пробиотики, являются в настоящее время коммерчески доступными. Например, смеси для последующего наблюдения, содержащие пробиотики, продаются Nestle, например такой продукт, как “NAN2 или NIDINA2 – with Bifidus”, который специально адаптирован для младенцев, может быть использован для цели данного изобретения, пока обеспечиваются эффективные количества.

Альтернативно, высушенные пробиотики могут добавляться к жидкому продукту, например, безалкогольному напитку или спиртному напитку. Если предполагается употребление бактерий в живом состоянии, жидкий продукт, содержащий пробиотики, должен быть употреблен относительно быстро после добавления пробиотиков. Однако если бактерии добавляют к продукту, стабильному при хранении, быстрое употребление его не является необходимым, пока пробиотики являются стабильными в безалкогольном или спиртном напитке.

WO 9810666 описывает одновременный способ сушки пищевой композиции и культуры пробиотических бактерий. Таким образом, пробиотики могут сушиться одновременно с соками, продуктами на основе молока или растительного молока, например, с получением высушенного продукта, уже содержащего пробиотики. Этот продукт может быть впоследствии восстановлен с использованием водной жидкости. Количество пробиотиков

Хотя это и не является обязательным, пробиотические бактерии могут употребляться в живом состоянии, для того чтобы пробиотические микроорганизмы в интактном виде достигали тонкой и толстой кишки, последняя из которых может быть колонизирована ими. Если это имеет место, достаточная доза живых бактерий обычно потребляется в день для достижения успешной колонизации. Специалисту с квалификацией в данной области известны эти суточные дозы, которые зависят от микроорганизмов, но обычно находятся в диапазоне 10⁶-10¹⁴, предпочтительно 10⁷-10¹³ колониеобразующих единиц (КОЕ) в день.

В контексте данного изобретения эффективное количество живого пробиотика, которое должно вводиться человеку с массой тела приблизительно 65 кг, будет предпочтительно находиться в диапазоне 10¹⁰-10¹⁴, более предпочтительно 10¹¹-10¹³, наиболее предпочтительно 4×10¹² КОЕ в день.

Предпочтительное количество живого пробиотика соответствует приблизительно одному стаканчику 2 дл йогурта в день, приготовленного с пробиотическим штаммом, коммерчески доступным. Одна дневная порция пищевого продукта или, если предпочтительными являются несколько дневных порций, все порции вместе будут обычно обогащены эффективным количеством пробиотиков, указанным выше.

Однако эффекты данного изобретения могут быть также достигнуты с мертвыми пробиотиками, с ферментированными средами или просто с субстратом для пробиотиков, которым обычно является пребиотическая клетчатка.

Таким образом, ферментированные среды, даже если они по существу не содержат пробиотики, но содержат метаболиты пробиотиков, могут быть использованы для работы данного изобретения.

Другими словами, мертвые или живые пробиотики, их среда, субстрат или метаболиты могут быть непосредственно добавлены в пищевые продукты таким же образом или сходным образом, описанным выше для живых пробиотиков более конкретно. Ферментированная среда, субстрат или метаболиты могут быть отделены от бактерий после ферментации, например, центрифугированием или фильтрованием. Супернатант или фильтрат могут быть концентрированы, охлаждены, заморожены, высушены, например, распылительной сушкой или непосредственно использованы для энтерального введения индивидууму. Если ферментированная среда является высушенной, она может быть превращена в порошок и, как описано выше для живых пробиотиков, добавлена в любой пищевой продукт.

Если супернатант или ферментационная среда должны вводиться человеку, эффективное количество находится в диапазоне 0,5-3 дл, предпочтительно 1-2 дл среды для выращивания, собранной после 30-50 часов, предпочтительно 45-50 часов бактериального роста. Когда плотность бактерий оценивают при OD 600 нм, рутинно получают OD 2-7, что представляет соответствующий рост 2-7×10⁸ бактерий на мл. Супернатант может быть введен после удаления бактерий, например, фильтрованием.

Эффективное количество супернатанта соответствует стаканчику 1-2 дл йогурта в день, приготовленного с выбранным пробиотиком, коммерчески доступным.

В случае животных, таких как домашние животные, соответствующее эффективное количество живых бактерий или супернатанта рассчитывают как функцию массы тела.

Можно также гомогенизировать ферментированную среду, включающую пробиотики, и дополнительно обработать обычно разрушенные пробиотики вместе со средой.

Как уже указывалось, субстрат пробиотиков, такой как диетическая клетчатка, которая стимулирует специфические пробиотики, может быть использован для работы данного изобретения. Этот способ является косвенным путем достижения эффектов в соответствии с данным изобретением. Посредством стимуляции роста специфических пробиотических штаммов в кишечном тракте могут быть достигнуты такие же эффекты, как эффекты, сообщенные здесь.

Следующие примеры приводятся только в качестве иллюстрации и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие предмет данной заявки.

Примеры 1 и 2 ниже имеют своей задачей испытать, могут ли нарушения кишечника, которые развиваются после транзиторной инфекции слизистой оболочки кишечника, и кишечные нервно-мышечные нарушения в целом предупреждаться или лечиться пробиотической добавкой.

Для испытания этих вопросов использовали мышиную модель, которая отличается стойкими нервно-мышечными нарушениями после острого случая инфекции Trichinella spiralis.

Таким образом, было обнаружено, что пробиотические бактерии могут обращать стойкие кишечные нервно-мышечные нарушения после кишечной инфекции.

Эти результаты впервые предполагают, что пробиотические бактерии могут препятствовать нагрузке паразитов во время кишечных инфекций, а также что некоторые из долгосрочных желудочно-кишечных осложнений, возникающих вследствие этих инфекций, могут быть обращены пробиотиками, даже в том случае, когда введение начинается после установления паразитарной инфекции. Эти эффекты, как было показано впервые, в высокой степени зависят от конкретного используемого пробиотика.

Пример 1: пробиотики для предупреждения инфекции Т. spiralis в мышах

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для этого эксперимента брали следующие депонированные в “Collection Nationale de Cultures de Microorganismes” (CNCM) штаммы, а также коммерчески доступный штамм пробиотика:

Lactobacillus acidophilus (johnsonii) (CNCM I-1225);

Lactobacillus paracasei (CNCM I-2116);

Bifidobacterium longum (CNCM I-2170);

Bifidobacterium lactis (German Culture Collection: DSM 20215), купленный из Christian Hansen BioSystems A/S (CHL), 10-12 Boge Alle, P.O. Box 407, DK-2970 Horsholm, Denmark.

Препараты пробиотиков и два контроля, среду MRS или PBS вводили через желудочный зонд самкам мышей NIH swiss (n=5 на группу) один раз в день в течение 10 дней перед инфекцией Т. spiralis (375 личинок). Введение пробиотика продолжали на протяжении всего эксперимента. Спустя девять дней после инфекции Т. spiralis мышей умерщвляли для подсчета червей и определения активности миелопероксидазы (МРО).

Вводимые один раз в день через желудочный зонд количества были 1×10⁹ бактерий/100 мкл среды для выращивания /мышь/ день каждой из бактерий и 100 мкл отфильтрованной среды для выращивания/мышь/день в экспериментах только с супернатантом.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Не было различий в количестве червей между мышами, предварительно обработанными MRS или PBS, и, следовательно, все дальнейшие эксперименты использовали MRS в качестве единственной контрольной группы.

Было обнаружено, что мыши, обработанные штаммом Bifidobacterium lactis, имели тенденцию иметь более низкие количества червей, чем мыши, предварительно обработанные MRS и PBS. С другой стороны, штамм Lactobacillus acidophilus, по-видимому, увеличивал нагрузку червей. Остальные штаммы – в течение испытанных периода времени и доз – по-видимому, не оказывали значимого влияния на нагрузку червей.

Таким образом, было обнаружено, что различные штаммы пробиотиков имели дифференциальные эффекты на нагрузку червей при предварительном введении. Конкретные штаммы пробиотиков, например штамм Bifidobacterium lactis, способны уменьшать инфекционную нагрузку кишечными паразитами, такими как нематоды.

Пример 2: пробиотики для лечения осложнений инфекций Т. spiralis в мышах

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Во втором эксперименте мышей сначала инфицировали Trichinella spiralis (375 личинок) и вводили через желудочный зонд один раз в день пять пробиотиков, указанных выше, или MRS со дня 10 до дня 21 после инфекции, затем мышей умерщвляли и брали ткань для экспериментов по сократительной способности in vitro. В модели Т. spiralis несмотря на изгнание паразитов и снятие воспаления слизистой оболочки кишечника спустя 21 день после инфекции сохраняются нервно-мышечные нарушения (гиперсократимость).

Нервно-мышечную функцию оценивали измерениями сократительной способности in vitro после фармакологической (карбакол) или электрической стимуляции (EFS) кишечной ткани, помещенной в бани для мышц. Используемым способом является способ в соответствии с Barbara G. Vallance BA, Collins SM Persistent intestinal newomuscular dysfunction after acute nematode infection in mice, Gastroenterology 1997; 113: 1224-1232. См., в частности, главы “Tissue Preparation for Contractility Studies” и “Measurement of Contraction”.

Таким образом, из мышей извлекали участок тонкой кишки и помещали в оксигенированный (95% O₂/5% CO₂) раствор Кребса при 37°С. Противоположные концы этого участка кишки зажимали. Один конец этой ткани подсоединяли к изометрическому датчику силы (model FT03C; Grass, Quincy, MA), а другой – к обкладке бани. Реакции регистрировали на самописце Grass 7E. Стимуляцию производили при помощи EFS и карбакола (в отношении подробностей см. ссылку выше). Стимулированные сокращения анализировали с использованием компьютера, посредством чего измеряли базовый (исходный) тонус, фазовое сокращение, тоническое сокращение и максимальное напряженное состояние (натяжение) непосредственно после сокращения и рассчитывали площадь под кривой.

Фиг.3 показывает концепции базового (исходного) тонуса (1), стимулированного тонуса (2) и тонического сокращения (3), а также базового (исходного) фазового сокращения (4), стимулированного фазового сокращения (5), фазового сокращения (6) и площади под кривой (7).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Фиг.1 показывает площадь под кривой, которая учитывает период сокращения после стимуляции и натяжение сокращения в пределах этого периода. Обнаружено явное различие (более низкая площадь под кривой) между мышами, получающими штаммы пробиотиков, указанные выше, и контролем, которое показывает, что в первом случае сокращения после стимуляции являются более короткими и/или менее напряженными. Символы на фиг.1 имеют следующее значение: – контроль, – Lactobacillus acidophilus (johnsonii), × – Bifidobacterium longum, * – Bifidobacterium lactis, – Lactobacillus paracasei.

Фиг.2 показывает тоническое сокращение (А) и фазовое сокращение (В) мышечной ткани, описанные для фиг.1, но стимулированные электрическим полем, и сравнивает организмы-хозяева, получающие пробиотический штамм Lactobacillus paracasei (NCM 1-2116) в живом состоянии (L.p.), мертвом состоянии (мертвый L.p.) и только супернатант среды (Sn). Контролем является среда MRS. Можно видеть, что спустя 21 день после инфекции натяжение сокращения является явно уменьшенным в мышцах кишечника из мышей, которые получали полученные из пробиотика подкормки (живой, мертвый, Sn), в сравнении с мышами, подкармливаемыми только MRS. Эти величины приближаются к величинам неинфицированных мышей.

ВЫВОДЫ

Эти результаты привели к заключению, что пробиотики способны нормализовать постинфекционное гиперсократимое состояние мышц кишечника. Другими словами, пробиотики уменьшают осложнения, которые стойко сохраняются после инфекции желудочно-кишечного тракта. Эти эффекты различаются от штамма к штамму, и в данном изобретении были наиболее существенными при использовании штамма пробиотика Lactobacillus paracasei (NSM I-2116) и присутствуют со всеми штаммами Bifidobacterium, которые были выбраны для этого эксперимента.

Общим выводом из данного эксперимента является то, что специфические пробиотические штаммы, такие как Lactobacillus paracasei (NSM I-2116), способны действовать непосредственно на сократительную способность мышц. Это общее открытие имеет следствие, заключающееся в том, что, в общем виде, желудочно-кишечные нервно-мышечные нарушения (кишечные сокращения), которые имеют место во многих случаях на протяжении жизни индивидуума, могут вылечиваться, лечиться и/или предупреждаться введением подходящих пробиотиков.

Отклоняющиеся от нормы сокращения кишечника встречаются у младенцев, подростков и взрослых, страдающих от спастической боли в животе (колик), боли в кишечнике или дискомфорта кишечника и боли, описанной в случае IBS (синдрома раздражения кишечника). Отклоняющиеся от нормы сокращения могут приводить к инвагинациям кишечника у человека и домашних животных, они могут приводить к вздутию кишечника и к неправильному и неприемлемому времени прохождения через кишечник.

Можно сделать вывод, что в этих случаях введением пробиотиков достигается общее ослабление этих симптомов.

Формула изобретения

1. Применение Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 для предупреждения или лечения нервно-мышечных нарушений кишечника, обусловленных инфекциями кишечника патогенами.

2. Применение по любому из п.1, в котором Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 включает мертвые бактерии, ферментационный субстрат и/или полученный из Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 материал.

3. Применение Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 для предупреждения или лечения осложнений после инфекции кишечника патогенами.

4. Применение по п.3, в котором Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 включает мертвые бактерии, ферментационный субстрат и/или полученный из Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 материал.

РИСУНКИ