Патент на изобретение №2346033

(54) СПОСОБ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВОДОРОСЛЕЙ

(57) Реферат:

Способ предусматривает непрерывное культивирование ауксотрофного морского микроорганизма в ферментере при аэробных условиях в культуральной среде при Y (выходе), г/л сухого вещества клеток, CDM. Причем Y составляет 100-300 г/л. Культуральная среда содержит источники углерода и азота, добавляемые постепенно. Источник углерода используют в количестве (Y×h) г/л культурального бульона, где h составляет 1,1-3,0. При этом источник углерода является ограничивающим для образования биомассы. Источник азота используют в количестве (Y×h×f) г/л культурального бульона, где f составляет 0,002-0,2. Время пребывания в ферментере составляет 20-100 ч. По меньшей мере, 40% полученной биомассы состоит из компонентов, способных экстрагироваться смесью хлороформ: метанол. Способ обеспечивает высокий выход полиеновых кислот. Выход полиеновых кислот составляет 0,2 г DHA/л/ч. 12 з.п. ф-лы.

Настоящее изобретение относится к способу культивирования морского микроорганизма в аэробных условиях, причем в непрерывном ферментационном процессе за 20-100 часов продуцируется 100-200 г CDM (клеточное вещество, сухой вес) на 1 л ферментационной среды.

При промышленном получении биомассы или компонентов, составляющих значительную часть этой биомассы, посредством периодического, периодического с подпиткой или непрерывного культивирования микроорганизмов, желательным является достижение наивысшей возможной продуктивности биомассы. Кроме того, ферментационный процесс, представляющий собой по существу непрерывную операцию, имеет преимущество в том, что он требует меньшего участия человека, а возможные требования в отношении контролирования процесса являются низкими. Непрерывные ферментационные процессы основаны на достаточно стабильных штаммах, и когда такие штаммы доступны, использование непрерывных ферментационных процессов обеспечивает возможность процесса производства, позволяющего достичь более высокого постоянства в отношении общих характеристик культурального бульона, в том числе таких как концентрация белка и извлекаемость продукта.

Патент США US 5,244,921 описывает способ получения эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА) с коммерчески приемлемым выходом из диатомовых водорослей, таких как Nitzschia alba, обеспечивающий выход менее 70 г CDM/л за 60 часов.

Патент США US 5,711,983 относится к способу получения докозагексаеновой кислоты (DHA) в коммерчески приемлемых выходах из морских Dinoflagellata, в том числе Crypthecodinium sp. Сообщается о выходах в диапазоне от 23 г CDM/л за 75 часов до 33 г CDM/л за 160 часов.

ЕР 0823475 относится к получению DHA и DPA из рода Scizochytrium SR21. Сообщается, что полученные выходы составили не более 60 г CDM/л за 150 часов.

Патент США 5,518,918 относится к микробной биомассе, содержащей микроорганизм, выбранный из группы, состоящей из Thraustochytrium и Schizochytrium. Полученное CDM составило менее 8 г/л.

WO 01/04338 относится к способу культивирования микроорганизма, Crypthecodinium cohnii, для синтеза полиненасыщенной жирной кислоты. Полученные выходы составили менее 46 г CDM/л за 140 часов.

Патент США 6,582,941 относится к штамму Schizochytrium. Полученные выходы составили менее 60 г CDM/л за 120 часов.

WO 01/54510 относится к эукариотическим микроорганизмам, в частности к микроводорослям порядка Thraustochytriads, культивируемых в периодическом ферментационном процессе с подпиткой, и показывает важность разделения общего ферментационного процесса на две стадии: одну для начального построения биомассы и одну стадию, позволяющую происходить накоплению полиеновых жирных кислот, в условиях ограничения питательных элементов и низкого давления кислорода. Получали более 100 г/л сухого вещества клеток, содержащего, по меньшей мере, 20% вес./вес. липидов, в то время как продуктивность DHA (омега-3 С22:6, докозагексаеновой кислоты) может быть более высокой, чем 0,3 г/л, при периодических ферментационных процессах с подпиткой. Однако, вероятно, вследствие сложной природы участвующего ферментационного процесса, было продемонстрировано, что продуктивность DHA варьировалась на фактор ˜2 в 31 проводимых идентичных ферментационных партиях (см. пример 4). WO 01/54510 также демонстрирует, что выходы до 20 г/л сухого вещества клеток могут достигаться при использовании непрерывного ферментационного процесса (см. пример 9).

Таким образом, способы упрощения ферментационного процесса для культивирования продуцирующих жирные, полиеновые кислоты микроводорослей, при сохранении высоких продуктивностей полиеновых кислот, все еще являются необходимыми.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к такому улучшенному способу культивирования ауксотрофных морских микроорганизмов, приводящему к очень высоким продуктивностям биомассы, в котором выходы 100-300 г/л сухого вещества клеток могут собираться из непрерывно работающего ферментера, для которого время пребывания культурального бульона составляет 20-100 часов, при поддержании содержания липидов около 0,5 г липидов/г биомассы сухого вещества, а продуктивность полиеновой кислоты составляет по меньшей мере 0,2 г DHA/л/ч.

В связи с предыдущим уровнем техники наиболее удивительным является то, что такие высокие продуктивности полиеновой кислоты могут достигаться без нарушения взаимодействия клеточного роста и продуцирования полиеновой кислоты.

В первом аспекте данное изобретение относится к способу непрерывного культивирования ауксотрофного морского микроорганизма в ферментере в аэробных условиях при Y г/л сухого вещества клеток, CDM, где Y составляет 100-300 г/л, предусматривающему культивирование указанного ауксотрофного морского микроорганизма в культуральной среде, содержащей источник углерода, добавляемого постепенно, в количестве (Yxh) грамм/на литр культурального бульона, где h составляет 1,1-3,0, и со временем пребывания в ферментере 20-150 часов, в частности, со временем пребывания 20-100 часов.

При указании диапазона h понятно, что количество источника углерода дается без какой-либо связанной с ним воды. Из следующих параграфов понятно, что количества источника азота даются в виде количества азота.

Хорошо известно, что микроорганизмы требуют источника углерода для роста. Концентрация источника углерода в среде также является важной для конечного выхода сухого вещества клеток.

Неожиданно авторы обнаружили, что увеличением источника углерода в среде, подаваемой к непрерывно действующему ферментационному процессу, можно получать выходы (Y), выраженные в виде сухого вещества клеток (CDM) порядка 100-300 г/л, причем указанное количество биомассы продуцируется за менее чем 100 часов, при культивировании морского микроорганизма в культуральной среде, в которой либо источник углерода, либо источник азота является ограничивающим для образования биомассы, при поддержании высоких продуктивностей липидов и высоких продуктивностей полиеновой кислоты.

Источник углерода должен добавляться в количестве Yxh граммов на литр культурального бульона, где h составляет 1,1-3,0, предпочтительно в диапазоне 1,1-2,5, даже еще более предпочтительно в диапазоне 1,2-2,0.

Азот в форме, например, казаминокислот и/или (NH₄)₂SO₄ должен быть доступен в количествах, которые составляют 0,002-0,2 части количества источника углерода (Y x h x f), предпочтительно в количествах, которые составляют 0,004-0,1 частей количества источника углерода, даже еще более предпочтительно в количествах, которые составляют 0,01-0,04 части количества источника углерода.

Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления, данное изобретение относится к способу непрерывного культивирования ауксотрофного морского микроорганизма в аэробных условиях, где Y г/л сухого вещества клеток, CDM, в конкретной точке может быть собрано из ферментера в пределах 20-100 часов, где Y составляет 100-300 г/л, предусматривающему культивирование указанного морского микроорганизма в культуральной среде, содержащей:

i) источник углерода, добавляемый непрерывно, в количестве (Y x h) граммов на литр культурального бульона, где h составляет 1,1-3,0; и

ii) источник азота, добавляемый непрерывно, в количестве Y x h x f, где f находится в диапазоне 0,002-0,2.

Дополнительные компоненты, такие как соли, минеральные соединения и витамины, необходимые для образования биомассы, также должны поставляться этому микроорганизму добавлением этих компонентов в среду для выращивания. Эти компоненты должны добавляться в таких количествах, что дополнительное добавление этих компонентов не будет оказывать значимого влияния на достигаемые концентрации биомассы.

Схема способа культивирования

Могут быть использованы многие различные схемы способа культивирования. В предпочтительном варианте осуществления, не ограничивающем никоим образом объем данного изобретения, способ культивирования является непрерывным ферментационным процессом, предусматривающим 3 стадии культивирования:

а) начальный периодический процесс, за которым следует

b) периодический процесс с подпиткой, за которым следует

с) непрерывный процесс, в котором среду непрерывно добавляют при постоянной скорости подачи и в котором культуральный бульон непрерывно удаляют таким образом, что поддерживается общая масса бульона, так что авторы данного изобретения заявляют:

Способ непрерывного культивирования ауксотрофного морского микроорганизма в ферментере в аэробных условиях при Y г/л сухого вещества клеток, CDM, где Y составляет 200-300 г/л, предусматривающий культивирование указанного ауксотрофного морского микроорганизма в культуральной среде, содержащей источник углерода, добавляемый постепенно, в количестве (Y x h) граммов на литр культурального бульона, где h составляет 1,1-3,0, и со временем пребывания в ферментере 20-100 часов, где этот непрерывный ферментационный процесс предусматривает 3 стадии культивирования:

а) начальный периодический процесс, за которым следует

b) периодический процесс с подпиткой, за которым следует

с) непрерывный процесс.

Стадия а) и стадия b) служат прежде всего одной цели, заключающейся в том, чтобы позволить концентрации биомассы достичь уровней >50% концентраций биомассы, достигаемой после достижения стационарного состояния в стадии с), что позволяет собирать биомассу из стадии с), первоначально находящуюся при концентрациях, близких к концентрации стационарного состояния биомассы, постепенно достигаемой в стадии с). Состав используемой среды для начальной периодической стадии, а также для периодической стадии с подпиткой должен отражать эту цель.

Перемещение из стадии а) в стадию b) должно происходить до того как источник углерода в стадии а) среды становится истощенным.

Перемещение из стадии b) в стадию (с) должно происходить

i) в момент времени, подходящий для достижения совокупной цели для стадии а) и b), указанной выше, и

ii) в момент времени, зависимый от концентрации источника углерода и азота в подаваемой среде, используемой в стадии b), а также от концентрации источника углерода и азота в среде периодической стадии а).

Должно быть понятно, что именно характеристика этого непрерывного процесса при вступлении в стационарное состояние составляет описание общего процесса относительно достигаемой продуктивности биомассы и спецификаций используемых сред.

Для специалиста с квалификацией в данной области очевидно, что непрерывные ферментационные процессы используют обычно постоянное время пребывания культурального бульона в ферментере. Однако для специалиста с квалификацией в данной области известно также, что варьирование времени пребывания в ферментере может улучшать общую производительность непрерывных ферментационных процессов, и такое варьирование находится в рамках данного изобретения, так что авторы изобретения заявляют следующие два процесса:

Способ по данному изобретению, где время пребывания культурального бульона в непрерывном процессе культивирования поддерживают постоянным и в диапазоне 20-100 часов; и способ по данному изобретению, где время пребывания культурального бульона в непрерывном процессе культивирования варьируют в диапазоне 20-100 часов.

Количество азота может также варьироваться и должно соответствовать количеству источника углерода таким образом, что общая концентрация органического и неорганического азота, N_konc., равна Y x h x f.

При культивировании морских микроорганизмов в соответствии с данным изобретением можно получить продуктивность биомассы в форме CDM, которое может быть собрано из ферментера в диапазоне 0,67-15 г сухого вещества клеток на литр культуральной среды в час, при поддержании содержания липидов около 0,5 г/г сухого вещества биомассы и при поддержании высоких продуктивностей полиеновой кислоты, по меньшей мере, 0,20 г DHA/л/ч, предпочтительно, по меньшей мере, 0,25 г DHA/л/ч, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,30 г DHA/л/ч, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 0,35 г DHA/л/ч.

В предпочтительном варианте осуществления, способ по изобретению может продуцировать полиеновую кислоту в концентрации 0,20-0,40 г DHA/л/ч, предпочтительно в концентрации 0,25-0,4 г DHA/л/ч, более предпочтительно в концентрации 0,30-0,40 DHA/л/ч, наиболее предпочтительно в концентрации 0,35-0,40 DHA/л/ч.

Ферментацию в соответствии с данным изобретением проводят в одном варианте осуществления при уровнях растворенного кислорода более 10% насыщения. Однако проведение ферментации при более низких уровнях, по-видимому, в соответствии с WO 01/54510, еще более увеличивает продуктивность образования полиеновых жирных кислот. Преимущество использования непрерывного ферментационного процесса над периодическими ферментационными процессами с подпиткой, когда одной целью контроля ферментации является поддержание уровня кислорода при низких уровнях, является – для специалиста с квалификацией в данной области – очевидным, так как такой контроль в непрерывных процессах может достигаться просто коррекцией аэрации и скоростей перемешивания при фиксированных уровнях, тогда как такой контроль в периодических процессах с подпиткой должен основываться на точных измерениях растворенного кислорода, которые должны выполняться на протяжении всего ферментационного процесса. Далее, такое точное измерение растворенного кислорода может быть неуспешным.

Таким образом, предлагается способ непрерывного культивирования ауксотрофного морского микроорганизма в ферментере при аэробных условиях при Y г/л сухого вещества клеток (CDM), где Y составляет 100-300 г/л, предусматривающий культивирование указанного ауксотрофного морского микроорганизма в культуральной среде, содержащей источник углерода, добавляемый постепенно, в количестве (Y x h) граммов на литр культурального бульона, где h составляет 1,1-3,0, и со временем пребывания в ферментере 20-100 часов, где этот непрерывный ферментационный процесс предусматривает 3 стадии культивирования:

а) начальный периодический процесс, за которым следует

b) периодический процесс с подпиткой, за которым следует

с) непрерывный процесс

и где уровень давления растворенного кислорода в стадии с) поддерживают ниже 10% насыщения, предпочтительно ниже 5% насыщения, более предпочтительно ниже 1% насыщения.

Ферментацию в соответствии с данным изобретением проводят в одном варианте осуществления при температуре культивирования в диапазоне 20-35°С, предпочтительно в диапазоне 25-30°С.

рН в среде культивирования должен находиться в диапазоне 3,0-9,0, в частности в диапазоне 5,0-7,5.

Ауксотрофные морские микроорганизмы

Предпочтительным ауксотрофным морским микроорганизмом в соответствии с данным изобретением является водоросль, в частности микроводоросль или водоросль-подобный микроорганизм, предпочтительно член группы Stramenopiles, более предпочтительно Hamatores sp., Proteromonads sp., Opalines sp., Developayella sp., Diplophrys sp., Labirinthulids sp., Thraustochytrids sp., Biosecids sp., Oomycetes sp., Hypochytridiomycetes sp., Commation sp., Reticulosphaera sp., Pelargomonas sp., Pelargococcus sp., Ollicola sp., Aureococcus ap., Parmales sp., Diatoms sp., Xanthophytes sp., Phaeophytes sp. (бурые водоросли), Eustigmatophytes sp., Raphidophytes sp., Synurids sp., Axodines sp., Hibberdiales sp. или Chromulinales sp.

Особенно предпочтительным морским микроорганизмом в соответствии с данным изобретением является Thraustochytrids sp., в частности Schizochytrium sp. или Thraustochytrium sp. Наиболее предпочтительным является Schizochytrium sp., в частности, S. limacinum sp., предпочтительно SR21 (FERM BP-5034).

Содержание липидов

Способ по изобретению может быть использован для получения различных липидных соединений, в частности ненасыщенных липидов, предпочтительно полиненасыщенных липидов (например, липидов, содержащих, по меньшей мере, 2 ненасыщенные углерод-углеродные связи, например двойные связи) и более предпочтительно высоко ненасыщенных липидов (например, липидов, содержащих 4 или более ненасыщенные углерод-углеродные связи), такие как омега-3- и/или омега-6-полиненасыщенные жирные кислоты, в том числе докозагексаеновая кислота (т.е. DHA); и другие природно встречающиеся ненасыщенные, полиненасыщенные и высоко ненасыщенные соединения. В данном контексте термин «липид» включает в себя фосфолипиды; свободные жирные кислоты; эфиры жирных кислот; триацилглицериды; стерины и эфиры стеринов; каротиноиды; ксантофиллы (например, оксикаротиноиды); углеводороды; произведенные из изопреноида соединения и другие липиды, известные в данной области. В частности, способ данного изобретения применим в получении полиеновой кислоты (полиеновых кислот).

Содержание липидов в сухом веществе клеток, получаемом способом по данному изобретению, представляет собой компоненты, экстрагируемые смесями хлороформ:метанол, и составляет, по меньшей мере, 40% продуцируемой биомассы, предпочтительно, по меньшей мере, 45% продуцируемой биомассы, более предпочтительно, по меньшей мере, 50% продуцируемой биомассы, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 55% продуцируемой биомассы. Отношение хлороформ:метанол равно в одном варианте осуществления 2:1 (об./об.), предпочтительно отношение хлороформ:метанол равно в одном варианте осуществления 2:1 (об./об.), 0,1% бутилгидрокситолуола.

Некоторые морские микроорганизмы, подобные, например, Thraustochytrids sp., продуцируют желаемые длинноцепочечные полиненасыщенные, жирные кислоты (LC PUFA), подобные эйкозапентаеновой кислоте (ЕРА) и докозагексаеновой кислоте (DHA).

Клинические эффекты обогащения диет человека LS PUFA были широко документированы. Представляющими особенный интерес LS PUFA являются эйкозапентаеновая кислота (ЕРА) и докозагексаеновая кислота (DHA). Однако еще не было достигнуто согласие в отношении оптимального отношения ЕРА:DHA в диетах для взрослых людей и, кроме того, способность Thraustochytrids sp. с высокой эффективностью продуцировать биомассу, липиды и LS PUFA не обязательно совпадала со способностью продуцировать оптимальное отношение ЕРА:DHA в одном штамме.

Таким образом, аспект модификации характеристик видов Thraustochytrids в отношении продуктивности биомассы, липидов и LS PUFA и/или в отношении соотношения ЕРА:DHA в комбинации с данным изобретением мог бы быть крайне выгодным.

Примеры

Пример 1: Криоконсервация штамма Schizochytrium limacinum SR21 (FERM BP-5034):

Культуру, полученную из коллекции культур «National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan” на агаре, переносили во встряхиваемую колбу суспендированием этих клеток на агаре в “1/2TM” (описанной ниже). Эту встряхиваемую колбу (на 500 мл, коническую, со 100 мл среды “OMERK_A”, описанной ниже + 10 мл клеток в суспензии) инкубировали при 28°С и 150 об/мин в термостатически регулируемом ротационном шейкере Unitron, Infors AG в течение 25 часов. Во встряхиваемую колбу добавляли 25 мл стерилизованного нагреванием глицерина. После 40 минут инкубирования при комнатной температуре аликвоты по 1 мл переносили в криопробирки.

Криопробирки (40 pc.) медленно замораживали инкубированием этих криопробирок во flamingo-боксе (20х20 см с 4 см flamingo стенками, крышкой и дном) при -20°С в течение 24 часов и затем переносили эти криопробирки в морозильник на -80°С.

Криопробирки поддерживали в виде исходного материала при -80°С использования.

Используемые культуральные среды

– смешивали вместе.

рН доводили до 7,0 NaOH/HCl.

Объем доводили до 900 мл водопроводной водой.

Стерилизацию нагреванием проводили при 121°С в течение 20 минут.

В конце добавляли 33 г глюкозы·1Н₂О в 100 мл, стерильно-отфильтрованной через фильтры 0,25 микрон, 100 мл асептически переносили в пустую, стерилизованную нагреванием коническую встряхиваемую колбу на 500 мл.

Солюбилизированный в водопроводной воде.

Стерилизацию нагреванием проводили при 121°С в течение 20 минут.

– смешивали вместе, объем доводили до 1,0 л деионизованной водой.

– смешивали вместе, объем доводили до 1,0 л деионизованной водой.

Пример 2: Размножение штамма Schizochytrium limacinum SR21:

Клетки из 1 криопробирки, оттаянные при комнатной температуре, переносили в 10 мл среды “OmePRK_A” и асептически культивировали в среде “OmePRK_A”, содержащейся в цилиндрическом стакане на 40 мл, и инкубировали в течение 24 часов при 28°С и при 150 об/мин (Unitron, Enfors AG).

Полученный таким образом культуральный бульон переносили в 100 мл среды “OmePRK_A” и асептически культивировали в среде “OmePRK_A”, содержащейся в конической встряхивающейся колбе на 500 мл, в течение 24 часов при 28°С и при 150 об/мин (Unitron, Enfors AG).

Полученные таким образом 90 мл культурального бульона использовали для инокуляции ферментера.

Пример 3: Непрерывное культивирование штамма SR21 при 30-35 часах времени пребывания бульона в ферментере:

Использовали стеклянный/из нержавеющей стали ферментер на 2 л типа Porton.

Штамму давали расти на 1,0 л среды “OME8” в течение 20 часов, при поддержании

– рН в диапазоне 6,0-7,0 регулируемым добавлением NaOH/Н₃РО₄,

– температуры при 28°С,

-перемешивания при 300 об/мин, линейно увеличивающихся до 400 об/мин,

– аэрации при 1,0 л/мин,

– давления растворенного кислорода более 10% насыщения.

При 20,1 часах подпитку периодической культуры с подпиткой начинали с использованием среды OBE8a” (описанной ниже) при 0,057 г/мин. Эту скорость подпитки поддерживали до 100 часов.

Перемешивание от 20 до 80 часов увеличивали линейно с 400 об/мин до 500 об/мин; другие параметры процесса поддерживали при ранее установленных величинах.

При 100 часах режим непрерывного культивирования осуществляли изменением среды подачи на “OME17b” (описанной ниже), увеличением скорости подачи до 0,5 г/мин и поддержанием общей массы культурального бульона при 1000 г, позволяя культуральному бульону удаляться из ферментера с использованием откачивания. Далее, скорость перемешивания увеличивали при 100 часах до 800 об/мин. Пенообразование контролировали ручным добавлением виноградного масла.

Как оценено из измерений OD (650 нм, кювета 1 см, 400-кратное разведение бульона в деионизованной воде перед измерением) и из активности дыхания культуры (% О₂ в истощенном воздухе, измеряемый 1313 Fermentation Monitor из Innovo Air Tech. Instruments), стационарное состояние достигалось при ˜160 часах.

При 190 часах брали пробу 50 мл и центрифугировали при 500 об/мин и при комнатной температуре в течение 15 минут в Heraus Labofuge Ae; полученный таким образом осадок осторожно промывали ˜35 мл “1/2 TM”, центрифугирование повторяли и полученный таким образом осадок замораживали при -80°С и затем лиофилизировали на приборе для лиофильной сушки Heto Lab Equipment.

Таким образом можно было определить концентрацию сухого вещества суспендированных твердых веществ, которая была равна 104,1 г/л.

Поскольку все среды состояли исключительно из растворимых компонентов, эта картина берется в качестве концентрации сухой массы клеток.

Остаточная концентрация глюкозы была <<1 г/л от 25 часов и далее – как определено с использованием полосок “Keto-diabur-test 5000” из ACCU-Chek вместе с должным образом разведенными пробами.

В данном примере Y=104,1 г/л и h=1,24 и f=0,021.

– смешивали, рН доводили до 6,5 NaOH/Н₃РО₄ и объем доводили до 700 мл.

Стерилизацию нагреванием этой среды проводили при 121°С в течение 40 минут со средой, содержащейся в ферментере. После стерилизации нагреванием и охлаждения до температуры ниже 40°С 33 г глюкозы·1Н₂О в водопроводной воде с объемом, доведенным до 300 мл перед отдельной стерилизацией нагреванием при 121°С в течение 40 минут, добавляли в ферментер/среду с получением таким образом “OME8”, готовую для доведения рН в ферментере до 6,5 и последующего инокулирования. Во всех случаях использовали водопроводную воду.

“OME8а”:

Все компоненты даются в г/л.

Все компоненты – за исключением глюкозы – стерилизовали нагреванием в 40% об./об. конечного объема среды при 121°С в течение 40 минут после доведения рН до 5,0 NaOH/Н₃РО₄. Глюкозу стерилизовали нагреванием отдельно в 60% об./об. конечного объема среды и затем добавляли к другим компонентам после охлаждения до температуры ниже 40°С.

Во всех случаях использовали водопроводную воду.

Все компоненты даются в г/л.

Все компоненты – за исключением глюкозы – стерилизовали нагреванием в 40% об./об. конечного объема среды при 121°С в течение 40 минут после доведения рН до 5,0 NaOH/Н₃РО₄. Глюкозу стерилизовали нагреванием отдельно в 60% об./об. конечного объема среды и затем добавляли к другим компонентам после охлаждения до температуры ниже 40°С.

Во всех случаях использовали водопроводную воду.

Пример 4: Непрерывное культивирование штамма SR21 при 60-70 часах времени пребывания бульона в ферментере:

Это культивирование проводили, как описано в примере 3, со следующими модификациями. При начале непрерывного режима культивирования при 100 часах скорость потока подпитки устанавливали при 0,25 г/мин.

Далее, при 190 часах среду подпитки изменяли с “OME17b” на “OME17c” (описана ниже).

При 285 часах, 450 часах и 500 часах концентрацию сухой массы клеток 188,6; 152,54; 189,07 и 182,75 г/л определяли, как описано в примере 3.

“OME17c”:

Все компоненты даются в г/л.

Все компоненты – за исключением глюкозы – стерилизовали нагреванием в 40% об./об. конечного объема среды при 121^оС в течение 40 минут после доведения рН до 5,0 NaOH/Н₃РО₄. Глюкозу стерилизовали нагреванием отдельно в 60% об./об. конечного объема среды и затем добавляли к другим компонентам после охлаждения до температуры ниже 40°С.

Во всех случаях использовали водопроводную воду.

Из вышеописанного:

Y = 189 г/л; h = 1,37 и f = 0,021 при 285 часах;

Y = 153 г/л; h = 1,70 и f = 0,021 при 350 часах;

Y = 189 г/л; h = 1,37 и f = 0,021 при 450 часах;

Y = 189 г/л; h = 1,42 и f = 0,021 при 500 часах.

Следует отметить, что варьирование в продуктивности клеток является неожиданно малым (когда h является постоянным, Y также является почти постоянным, как показано результатами при 285 часах и 450 часах соответственно).

Пример 5: Содержание липидов в сухом веществе клеток из непрерывного культивирования с высокой плотностью клеток

Из материала, полученного лиофилизацией, промытую пробу бульона 50 мл тщательно ресуспендировали ⠘40 мл “1/2TM”. Липиды экстрагировали из полученной ресуспендированием суспензии смесью хлороформ:метанол (2:1 об./об., 0,1%, м/об. бутилгидрокситолуол (ВНТ)) и количество липидов (г) определяли после выпаривания смеси хлороформ:метанол. Извлеченные таким образом липиды хранили при -80°С и затем подвергали метилированию при 40°С и анализировали на DHA в соответствии со стандартными процедурами ВЖХ.

Содержание липидов в сухом веществе клеток и продуктивность полиеновых кислот могли быть, следовательно, определены этими способами.

В ферментации, описанной в примере 3 (время пребывания ˜30-35 часов), содержание липидов в сухом веществе клеток при 190 часах было определено как () 47,5% м/м.

В ферментации, описанной в примере 4 (время пребывания ˜60-70 часов), содержание липидов в сухом веществе клеток при 350 часах (перед уменьшением перемешивания/аэрации) было определено как ()60,1% м/м, а содержание полиеновой кислоты 21 (DHA в % м/м общего количества жирных кислот).

В ферментации, описанной в примере 4 (время пребывания ˜60-70 часов), содержание липидов в сухом веществе клеток при 450 часах (перед уменьшением перемешивания/аэрации) было определено как ()56,4% м/м, а содержание полиеновой кислоты 23 (DHA в % м/м общего количества жирных кислот).

В ферментации, описанной в примере 4 (время пребывания ˜60-70 часов), содержание липидов в сухом веществе клеток при 500 часах было определено как ()48,2% м/м, а содержание полиеновой кислоты 25 (DHA в % м/м общего количества жирных кислот).

Таким образом, в ферментации, описанной в примере 4 (время пребывания ˜60-70 часов), продуктивность полиеновой кислоты была 0,30, 0,38 и 0,34 г DHA/л/час при 350 часах, 450 часах и 500 часах соответственно. Следует отметить, что варьирование в продуктивности DHA является удивительно малой.

Таким образом, пример 4 демонстрирует, что можно использовать способ данного изобретения для получения высоких концентраций клеток и высоких концентраций DHA при времени пребывания в ферментере 60-70 часов.

Формула изобретения

1. Способ непрерывного культивирования ауксотрофного морского микроорганизма в ферментере при аэробных условиях при Y г/л сухого вещества клеток (CDM), причем Y составляет 100-300 г/л, предусматривающий культивирование указанного ауксотрофного морского микроорганизма в культуральной среде, содержащей: источник углерода, добавляемый постепенно, в количестве (Y×h) граммов на литр культурального бульона, где h составляет от 1,1 до 3,0, и источник азота, добавляемый постепенно, в количестве (Y×h×f) граммов на литр культурального бульона, где f составляет 0,002-0,2, причем время пребывания равно 20-100 ч, при этом источник углерода является ограничивающим для образования биомассы, а по меньшей мере 40% продуцируемой биомассы состоит из компонентов, способных экстрагироваться смесями хлороформ:метанол.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что h составляет 1,1-2,5, в частности в диапазоне 1,2-2,0.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что f составляет 0,004-0,1, в частности в диапазоне 0,01-0,04.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ауксотрофным морским микроорганизмом является Thraustochytrids sp.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что Thraustochytrids sp.выбран из группы, состоящей из Schizochytrium или Thraustochytrium.

6. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что температура культивирования находится в диапазоне 20-35°С.

7. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что рН культуральной среды составляет 3,0-9,0.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанной смеси хлороформ и метанол используют в соотношении 2:1 (об./об.).

9. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что он обеспечивает выход полиеновой кислоты, по меньшей мере, 0,2 г DHA/л/ч.

10. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что время пребывания культурального бульона в процессе непрерывного культивирования поддерживают постоянным и в диапазоне 20-100 ч.

11. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что время пребывания культурального бульона в процессе непрерывного культивирования варьируют в диапазоне 20-100 ч.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что непрерывное культивирование предусматривает следующие 3 фазы культивирования:

a) начальный периодический процесс, за которым следует

b) периодический процесс с подпиткой, за которым следует

c) непрерывный процесс.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что уровень растворенного кислорода поддерживают ниже 10% насыщения с начала стадии с).