Патент на изобретение №2346002

(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ИНТЕРФЕРОНА БЕТА ЧЕЛОВЕКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки интерферона бета человека из рекомбинантной культуры, содержащей интерферон бета человека, включающий проведение аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии. Аффинная хроматография включает адсорбцию культуры, содержащей интерферон бета, на уравновешенной хроматографической колонке для аффинной хроматографии, промывание колонки промывочным буферным раствором А с рН 6,5-7,5, содержащим 30-60 мас.% пропиленгликоля, и промывочным буферным раствором В с рН 6,5-7,5, содержащим 10-30 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl с элюцией фракции, содержащей интерферон бета человека, буферным раствором с рН 6,5-7,5, содержащим 40-60 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl. Полученный раствор подвергают диафильтрации и осуществляют катионообменную хроматографию, элюируя интерферонсодержащую фракцию при рН 5-7 градиентом концентрации NaCl в пределах 0-400 мМ с последующим концентрированном и гель-фильтрацией продукта. Получаемый интерферон бета характеризуется высокой степенью чистоты (99%) при упрощении технологии выделения. 3 з.п. ф-лы, 4 ил.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается способа очистки интерферона бета человека из культуры, содержащей рекомбинантный интерферон бета человека, с использованием аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии.

Уровень техники

Интерфероны в широком смысле слова являются внеклеточными мессенжерами, опосредующими реакционную способность организма-хозяина, и эволюционно консервативными семействами белков, которые выделяются в относительно небольших количествах из клеток. Интерфероны освобождаются из продуцирующих интерфероны клеток в ответ на стимуляцию вирусами, двухцепочечными РНК, различными микроорганизмами или цитокинами, такими как фактор некроза опухолей (TNF) или интерлейкин 1 (IL1), и затем связываются с рецепторами интерферона, локализованными на поверхности соседних клеток. После этого интерфероны индуцируют синтез различных белков, так что реакционная способность и гомеостаз организма-хозяина поддерживаются за счет последовательной передачи сигнала клетками. Таким образом, интерфероны действуют в организме как антивирусные, антипролиферативные и иммунные сигнальные белки и обладают прямым антипролиферативным действием на раковые клетки, вследствие чего привлекают пристальное внимание как терапевтические агенты [Postka S., Langer J.A. and Zoon К.С (1987) Interferons and their actions, Armu. Rev. Biochem. 56: 727-777].

Интерфероны принадлежат к классу спиральных физиологически активных веществ. Согласно физико-химическим характеристикам и функциональной активности выделяют два класса интерферонов: тип 1 и 2. Интерфероны альфа, бета, тау и эпсилон являются представителями интерферонов типа 1 [Weissman С. and Weber H. (1986) The Interferon genes, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 33: 251-300], а интерферон гамма является представителем интерферонов типа 2. Среди них интерфероны бета, относящиеся к интерферонам типа 1, являются белками, демонстрирующими видовую специфичность. Интерфероны бета также называют интерферонами фибробластов в соответствии с их источником и рН2-стабильными интерферонами согласно их биологическим характеристикам. Интерфероны бета связываются с теми же рецепторами на поверхности клеток, что и интерфероны альфа, принадлежащие к интерферонам типа 1, и затем индуцируют транскрипцию антивирусных факторов в ответ на активацию соответствующих сигнальных систем клетки.

Интерфероны бета представляют собой гликопротеины (около 20% сахарных остатков) с молекулярной массой около 20 кДа и одноцепочечные белки, состоящие из 166 аминокислотных остатков. Известно, что один участок N-гликозилирования играет роль в увеличении стабильности или растворимости, т.е. в улучшении физико-химических функций, скорее, чем участвует в биологической активности или антигенности [Karpusas М., Whytty A., Runkel L, and Hochman P. The structure of human interferon-: implications for activity CMLS, 54: 1203-1216 1998].

Достижения в генетической рекомбинантной технологии сделали возможным определение аминокислотной последовательности интерферона бета человека, а также клонирование и экспрессию интерферона бета человека в Е.coli [Taniguchi, Gene 10: 11-15, 1980]. Более того, сообщалось также об экспрессии интерферона бета в клетках яичников китайского хомячка (Chinese hamster ovary (CHO) cells) [USP 4,966,843, USP 5376567, и USP 5795779].

В настоящее время интерфероны бета производятся по технологии генетической рекомбинации и коммерчески доступны под торговыми названиями Betaseron®, Avonex®, и Rebif®. Известно, что рекомбинантные интерфероны бета являются эффективными в замедлении развития рассеянного склероза у пациентов с симптомами заболевания и в снятии болевого синдрома при болезни. Более того, рекомбинантные интерфероны бета широко используются как терапевтические агенты при рассеянном склерозе и в то же время являются эффективными в неспецифической регуляции иммунного ответа человека, иммунного ответа на вирусные инфекции и в подавлении пролиферации раковых клеток.

Доступные в настоящее время технологии очистки рекомбинантных интерферонов бета, экспрессируемых в клетках CHO, состоят из 3-5 процедур очистки, включая первичную очистку методом аффинной хроматографии (USP 4278661, USP 4289689, USP 4541952, USP 4808523 и т.д.), металл-хелатную хроматографию (USP 4257938, USP 4359389, USP 4541952, USP 5244655, и т.д.), хроматографию на пористом стекле с контролируемым размером пор (CPG, controlled pore glass chromatography) (USP 4359389, USP 5066786, USP 5244655 и т.д.), или хроматографию на Конканавалине А (USP 4289689, USP 4658017 и т.д.) с последующей катионообменной хроматографией или обращенно-фазовой хроматографией.

В описанных выше обычных технологиях очистки металл-хелатная хроматография может привести к загрязнению окружающей среды из-за использования тяжелых металлов. Хроматография на пористом стекле или хроматография на Конканавалине А обладают низкой специфичностью. То есть хроматография на Конканавалине А основана на избирательном связывании многих содержащих сахара белков, которые присутствуют в культуре клеток СНО, что приводит к низкой специфичности. Хроматография на пористом стекле позволяет производить разделение молекул по размеру после связывания с белком. Однако эффективность разделения и чистота интерферонов бета ниже, чем при аффинной хроматографии (например, при хроматографии на колонке с Blue-Сефарозой).

Более того, обычные технологии очистки с помощью аффинной хроматографии включают промывание и элюцию с этиленгликолем с использованием моноклональных антител и/или смол, содержащих красители. Однако аффинная хроматография с использованием моноклональных антител требует отдельной стадии удаления негликозилированной формы интерферона бета, что делает массовое производство затруднительным. В частности, используемый для промывания и элюции этиленгликоль является очень токсичным для организма, что ограничивает применение этого способа очистки.

В то же время U.S. Patent No. 4483849 раскрывает способ очистки и стабилизации интерферона бета с использованием пропиленгликоля вместо токсичного этиленгликоля при аффинной хроматографии. Способ, раскрываемый в этом патентном документе, включает нанесение интерферонсодержащей культуры на аффинную колонку с красителем, такую как уравновешенный Affi-Gel Blue, промывание колонки 1,0 М буфером NaCl/PO₄ и 1,0 М буфером NaCl/PO₄, содержащим 40% пропиленгликоля, и затем элюцию интерферона 50% пропиленгликолем. Хотя описываемый в этом патентном документе процесс включает промывку колонки и элюцию, пик желаемого конечного продукта и пик загрязнений накладываются друг на друга, что приводит к снижению чистоты продукта.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение предлагает способ очистки интерферона бета, который включает получение с высокой чистотой продукта первичной очистки интерферона бета с помощью усовершенствованной аффинной хроматографии с использованием нетоксичного пропиленгликоля с последующей катионообменной хроматографией.

Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ очистки интерферона бета человека из рекомбинантной культуры, содержащей интерферон бета человека, включающий проведение аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии, которая включает промывку и элюцию специфическим буферным раствором.

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения предлагается способ очистки интерферона бета человека из культуры, содержащей рекомбинантный интерферон бета человека, с помощью аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии, при котором аффинная хроматография включает адсорбцию культуры, содержащей интерферон бета человека, на предварительно уравновешенную колонку для аффинной хроматографии, последующую промывку колонки буферным раствором для уравновешивания, промывку колонки промывочным буферным раствором А с рН 6,5-7,5, содержащим 30-60% (по весу) пропиоленгликоля, и промывку колонки промывочным буферным раствором В с рН 6,5-7,5, содержащим 10-30% (по весу) пропиленгликоля и 1-2 М NaCl, и элюцию фракции, содержащей интерферон бета человека, буферным раствором с рН 6,5-7,5, содержащим 40-60% (по весу) пропиленгликоля и 1-2 М NaCl.

В способе очистки по настоящему изобретению нелимитирующие примеры культуры, содержащей рекомбинантный интерферон бета человека, используемые в качестве образца, включают продуцирующие интерферон бета клетки и штаммы. Например, содержащая рекомбинантный интерферон бета человека культура может быть получена известным способом, описываемым в Carter and Horoszewicz, Pharm. Ther. 8, 359-377, 1980; Strander and Cantell, Ann. Med. Exp. Fenn. 44, 265-273, 1966; Wheelock, Science, 149, 310-311, 1965, и тому подобное. Предпочтительно, культура, содержащая рекомбинантный интерферон бета человека, является бессывороточной культурой, полученной из клеток яичников китайского хомячка (СНО), продуцирующих рекомбинантный интерферон бета человека

В способе очистки по настоящему изобретению используемая для аффинной хроматографии хроматографическая колонка может быть обычной аффинной колонкой с красителем, например колонкой (например, колонкой ХК-50 column, Amersham biosciences, Sweden), заполненной Blue-Sepharose 6 (Amersham biosciences, Sweden), или колонкой Affi-Gel Blue (Bio-Rad, America). Буферный раствор для уравновешивания колонки для аффинной хроматографии может быть буферным раствором натрий фосфат-ЭДТА (рН около 7,2). Аффинная колонка может быть уравновешена 3 объемами колонки (CV) буферного раствора для уравновешивания, например, при линейной скорости около 15-30 см/ч.

В способе очистки по настоящему изобретению аффинная хроматография включает адсорбцию культуры, содержащей интерферон бета, на уравновешенной колонке для аффинной хроматографии и удаление неспецифически связанного белка путем промывки буферным раствором для уравновешивания.

Аффинная хроматография также включает многоступенчатую промывку, то есть промывку колонки промывочным буферным раствором А с рН 6,5-7,5, содержащим 30-60% (по весу) пропиленгликоля и промывку колонки промывочным буферным раствором В с рН 6,5-7,5, содержащим 10-30% (по весу) пропиленгликоля и 1-2 М NaCl. Предпочтительно, аффинная хроматография также включает промывку колонки промывочным раствором С с рН 6,5-7,5, содержащим 1-2 М NaCl. Предпочтительно, каждая промывка проводится с использованием 2-4 объемов колонки (CV) каждого буферного раствора

В способе очистки по настоящему изобретению нет ограничений в последовательности использования промывочных буферных растворов. Например, промывка может быть проведена с использованием промывочного буферного раствора А и затем промывочного буферного раствора В или с использованием промывочного буферного раствора В, а затем промывочного буферного раствора А. Кроме того, промывка может быть проведена с использованием промывочного буферного раствора А, промывочного буферного раствора С и затем промывочного буферного раствора В или с использованием промывочного буферного раствора В, промывочного буферного раствора С и затем промывочного буферного раствора А. Промывка с использованием промывочного буферного раствора А эффективно удаляет загрязнения с высокой гидрофобностью, промывка с помощью промывочного буферного раствора С удаляет гидрофильные загрязнения, а промывка с помощью промывочного буферного раствора В удаляет белковые примеси.

Снятие интерферона бета с колонки может быть осуществлено путем элюции фракции, содержащей интерферон бета человека, буферным раствором с рН 6,5-7,5, содержащим 40-60% (по весу) пропиленгликоля, предпочтительно 50% (по весу), и 1-2 М NaCl.

Предпочтительно, каждый используемый для промывки или элюции буфер может быть натрий-фосфатным буферным раствором или калий-фосфатным буферным раствором.

В способе очистки по настоящему изобретению промывка буферным раствором, содержащим около 50% пропиленгликоля, позволяет эффективно удалить пики загрязнений, в отличие от способа, раскрытого в US Patent No. 4483849, в котором промывка и элюция проводятся ступенчатым градиентом концентрации пропиленгликоля.

В способе очистки по настоящему изобретению вслед за вышеописанной аффинной хроматографией проводится катионообменная хроматография. Предпочтительно до проведения катионообменной хроматографии полученный при элюции при аффинной хроматографии раствор подвергают диафильтрации на мембране для ультрафильтрации с пределом пропускания по молекулярному весу 10000. При диафильтрации интерферон бета с относительно высокой концентрацией соли может быть доведен до подходящей концентрации соли.

Катионообменную хроматографию проводили следующим образом: образец, полученный после диафильтрации, наносили на колонку, и затем фракцию, содержащую интерферон бета человека, элюировали при рН 5-7 градиентом концентрации NaCl. Более подробно, фракции, содержащие интерферон бета, элюировали линейным градиентом концентрации, начиная с натрий-фосфатного буферного раствора (рН 5-7), который является уравновешивающим буферным раствором, до NaCl-содержащего натрий-фосфатного буферного раствора (рН 5-7).

Колонка для катионообменной хроматографии может быть колонкой (ХК-50, 150 мл CV, Amersham biosciences, Sweden) и CCM-Sepharose FF (Amersham biosciences, Sweden) и может быть уравновешена примерно 3 CV натрий-фосфатного буферного раствора при скорости потока 5 мл/мин. При катионообменной хроматографии образец, полученный посредством диафильтрации, пропускали через уравновешенную колонку при подходящей скорости потока и элюировали линейным градиентом концентрации соли NaCl-содержащего натрий-фосфатного буферного раствора (объемом примерно 12 CV). В результате этого удалялся интерферон бета, лишенный сахарных цепей, и избирательно был получен интерферон бета с сахарной цепью.

Во фракции, содержащей интерферон бета, полученной посредством катионообменной хроматографии, может быть затем проведена замена на новый буферный раствор. Замена на новый буферный раствор может осуществляться посредством гель-фильтрации или концентрирования и диафильтрации.

Например, в случае проведения гель-фильтрации, фракции, содержащие интерферон бета, полученные при катионообменной хроматографии, концентрируют до, например, около 200-1000 мкг/мл, диализуют против 10-50 мМ натрий-ацетатного буферного раствора (рН 3,5˜5,5) и наносят на хроматографическую колонку для гель-фильтрации (например, Sephacryl S-200, Amersham biosciences), уравновешенную 10-50 мМ, предпочтительно 20 мМ натрий-ацетатным буферным раствором (рН 3,5˜5,5). Затем 10-50 мМ натрий-ацетатный буферный раствор (рН 3,5˜5,5) пропускают через колонку при подходящей скорости потока, обеспечивая таким образом смену раствора искомых белков и отделение, и удаление полимеров.

Блок-схема, иллюстрирующая способ очистки по настоящему изобретению, показана на фиг.1.

Краткое описание фигур

Фиг.1 представляет собой блок-схему способа очистки по настоящему изобретению.

Фиг.2 представляет собой С4 ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография) аналитическую хроматограмму интерферона бета, элюируемого при аффинной хроматографии согласно способу очистки по настоящему изобретению.

Фиг.3 представляет собой С4 ОФ-ВЭЖХ аналитическую хроматограмму интерферона бета, элюируемого без промывки с 50% пропиленгликоля.

Фиг.4 представляет собой С4 ОФ-ВЭЖХ аналитическую хроматограмму элюируемого раствора после гель-фильтрации.

Осуществление изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более детально с помощью примеров. Однако нижеследующие примеры приводятся исключительно в качестве иллюстрации и, следовательно, настоящее изобретение не ограничивается ими.

Пример 1: аффинная хроматография

Blue-Sepharose 6 (Amersham biosciences, Sweden) в количестве 350 мл была внесена в колонку ХК-50 (Amersham biosciences, Sweden) для изготовления колонки для аффинной хроматографии. Для уравновешивания колонки через нее пропускали в достаточном количестве 20 мМ натрий-фосфатный буферный раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА. После этого через колонку пропускали 25 л бессывороточной культуры клеток яичников китайского хомячка (СНО), содержащей интерферон бета, при скорости потока 5-10 мл/мин, после чего колонку промывали 3 объемами колонки (CV) раствора для уравновешивания.

Около 3 CV 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора (рН 7,2), содержащего 50% пропиленгликоля, пропускали через колонку при скорости потока 5 мл/мин для удаления примесных белков, после чего промывали колонку примерно 3 CV буферного раствора для уравновешивания. Затем около 3 CV 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора (рН 7,2), содержащего 2 М NaCl, пропускали через колонку при скорости потока 5 мл/мин для удаления примесных белков. И, наконец, около 3 CV 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора (рН 7,2), содержащего 2 М NaCl и 20% пропиленгликоля, пропускали через колонку при скорости потока 5 мл/мин для удаления примесных белков.

Около 3 CV буферного раствора для элюции (20 мМ натрий-фосфатный буферный раствор, содержащий 2 М NaCl и 50% пропиленгликоля, рН 7,2) пропускали через колонку при скорости потока 5 мл/мин, чтобы получить раствор, содержащий интерферон бета. Чистота полученного элюируемого раствора была протестирована С4 ВЭЖХ аналитической хроматографией, результаты которой представлены на фиг.2. Согласно данным фиг.2, чистота интерферона бета составляла около 85% или более.

В контрольном эксперименте аффинную хроматографию проводили согласно описанному выше протоколу, за исключением того, что промывка колонки 20 мМ натрий-фосфатным буферным раствором (рН 7,2), содержащим 50% пропиленгликоля, была пропущена. Чистота полученного при элюции раствора была проанализирована с помощью С4 ВЭЖХ аналитической хроматографии, результаты которой представлены на фиг.3. Как видно из фиг.3, в отсутствие промывки 20 мМ натрий-фосфатным буферным раствором (рН 7,2), содержащим 50% пропиленгликоля, значительно снижается чистота интерферона бета.

Пример 2: катионообменная хроматография

Раствор, содержащий интерферон бета, полученный согласно настоящему изобретению и примере 1, подвергали диафильтрации, используя систему для ультрафильтрации (отсекаемый молекулярный вес 10000), и затем наносили на колонку (ХК-50, 150 мл CV, Amersham biosciences, Sweden) CCM-Sepharose FF (Amersham biosciences, Sweden) при скорости потока 1,5 мл/мин. Затем колонку уравновешивали, используя примерно 3 CV 50 мМ натрий-фосфатного буферного раствора (рН 6,7) при скорости потока 5 мл/мин. Элюцию интерферона бета осуществляли, используя линейный градиент концентрации от 50 мМ натрий-фосфатного буферного раствора (рН 6,7) до 50 мМ натрий-фосфатного буферного раствора (рН 6,7), содержащего 400 мМ NaCl для того, чтобы таким образом получить фракции интерферона бета, связанные с сахарными цепями.

Пример 3: гель-фильтрация

Раствор, содержащий интерферон бета, полученный в примере 2, был сконцентрирован до 200 мкг/мл. Получившийся раствор был нанесен на колонку с Sephacryl S-200 (1700 мл, ХК-50/100, Amersham biosciences, Sweden), уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатным буферным раствором (рН 4,0) для получения раствора, содержащего интерферон бета.

Пример 4: обращенно-фазовая жидкостная хроматография высокого разрешения (ОФ-ВЭЖХ)

Каждый из растворов, полученных в примерах 1, 2 и 3, был нанесен на колонку С4 ОФ-ВЭЖХ (Vydac 214TP54, внутренний диаметр 4,6 мм×25 см в длину, размер частиц 5 мкм, размер пор – 300 Å) при скорости потока 1 мл/мин. После этого через колонку пропускали 20 CV раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, в виде линейного градиента от 30% ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, до 80% ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, для анализа хроматографической картины.

Результат анализа методом гель-фильтрационной хроматографии приведен на фиг.4. Из фиг.4 можно видеть, что настоящее изобретение позволяет получить интерферон бета высокой степени чистоты.

Промышленная применимость

Согласно способу очистки по настоящему изобретению интерферон бета может быть очищен до высокой степени чистоты, составляющей 99% или более, при использовании нетоксичного пропиленгликоля и усовершенствованной аффинной хроматографии.

Формула изобретения

1. Способ очистки интерферона бета человека из культуры, содержащей рекомбинантный интерферон бета человека, включающий проведение аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии, где аффинная хроматография включает:

адсорбцию культуры, содержащей интерферон бета, на уравновешенной колонке для аффинной хроматографии с последующим промыванием уравновешивающим буферным раствором;

промывание колонки промывочным буферным раствором А с рН 6,5-7,5,

содержащим 30-60 мас.% пропиленгликоля и промывочным буферным раствором В с рН 6,5-7,5, содержащим 10-30 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl; и

элюцию фракции, содержащей интерферон бета человека, буферным раствором с рН 6,5-7,5, содержащим 40-60 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl,

раствор, полученный после аффинной хроматографии, подвергают диафильтрации, и полученный образец наносят на колонку для катионообменной хроматографии, и затем фракцию, содержащую интерферон бета человека, элюируют при рН 5-7, используя растворы с градиентом концентрации NaCl от 0 до 400 мМ,

причем раствор, полученный катионообменной хроматографией, концентрируют и подвергают гель-фильтрации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия промывки дополнительно включает промывку колонки промывочным буферным раствором С с рН 6,5-7,5, содержащим 1-2 М NaCl.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что каждый буферный раствор, используемый для промывки и элюции, является натрий-фосфатным буферным раствором или калий-фосфатным буферным раствором.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что диафильтрацию проводят с использованием мембраны для ультрафильтрации с пределом пропускания по молекулярному весу 10000.

РИСУНКИ