Патент на изобретение №2345363

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПЕРИНАТАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ ЦНС У ДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и касается способа оценки степени тяжести гипоксического поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей в раннем неонатальном периоде. Способ заключается в определении среднего количественного значения ДНК в ядрах лимфоцитов методом плоидометрии в 1 и на 3 сутки жизни ребенка. Исходя из полученных показателей, дифференцируют легкую, среднюю, тяжелую степень, а также отсутствие гипоксического поражения ЦНС. Использование способа позволяет оценить с высокой точностью и специфичностью степень тяжести гипоксического поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей в раннем неонатальном периоде.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”factor levels in newborn infants with and without perinatal asphyxia: is it an additional marker of perinatal asphyxia? Acta Paediatr Jpn. 1998 Oct; 40(5): 427-31. SHANTARINA E.V. et al. The significance of determination of the serum levels of nitrites for assessing severity of perinatal ischemia and predicting the nervous and mental development of a child. Klin Lab Diagn. 2006 Apr; (4): 17-20. AUTENSHLIUS A.I. et al. Lymphocyte reaction and humoral immune response to brain specific protein in children with pathology of the central nervous system. Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova. 2002; 102(12): 25-8.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для клинической диагностики степени тяжести гипоксического поражения центральной нервной системы у доношенных новорожденных детей в раннем неонатальном периоде.

Взаимосвязь иммунных реакций, энергетического метаболизма на фоне гипоксической энцефалопатии у новорожденных может быть исследована на единой информационной модели, которой является лимфоцит периферической крови.

Известен способ диагностики перинатальных гипоксических поражений головного мозга у доношенных детей грудного возраста путем комплексной оценки результатов клинического обследования, биохимического и цитохимического исследования крови, а именно: определение в лимфоцитах периферической венозной крови уровней териотропного гормона (ТТГ), свободного тироксина (Т₄ своб.), кортизола и сукцинатдегидрогеназы (СДГ), -глицеофосфатдегидрогеназы (-ГФДГ), кислой фосфатазы (КФ). Диагноз перинатальное гипоксическое поражение головного мозга устанавливали, если одновременно отмечалось, по отношению к норме, повышение уровня ТТГ, снижение Т₄ своб. и кортизола, активация СДГ, снижение активности

Недостаток известного способа состоит в том, что он применяется, начиная с первого месяца жизни ребенка, и не позволяет проводить раннюю диагностику в первые дни жизни после рождения. Кроме того, известный способ трудоемкий, так как диагностика перинатальных гипоксических поражений головного мозга осуществляется путем комплексной оценки результатов клинического обследования, биохимического и цитохимического исследования крови.

Известен способ оценки степени тяжести перинатального гипоксического поражения ЦНС у новорожденных методом иммуноферментного анализа с определением содержания интерлейкина IL-1, где моделью исследования также являются иммунокомпетентные клетки – лимфоциты (РФ, патент № 2291443, G01N 33/68, G01N 33/53, 10.01.2007).

Недостатки известного способа в относительной его специфичности, в связи с тем, что определяют содержание только интерлейкина IL-1, а также с кратковременным присутствием в крови цитокинов, что требует быстрого проведения исследования после забора крови. Последнее повышает трудоемкость способа. Для проведения исследования требуется достаточно большой объем крови (до 3 мл).

Известен способ оценки степени тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей, в котором степень тяжести оценивают по содержанию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и изменению концентрации нейроспецифической енолазы (NSE). Для чего определяют цитокиновый профиль (IL-1, IL-4, TNF

Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки степени тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей, в котором исследуют популяцию лимфоцитов, а именно анализируют показатели активности митохондриальных ферментов в популяции лимфоцитов: сукцинатдегидрогеназы (СДГ), глутаматдегидрогеназы, -глицерофосфатдегидрогеназы (-ГФДГ), лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы. Кроме того, определяют состояние клеточного звена иммунитета с учетом общего количества лейкоцитов и субпопуляций лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD95, CD25 и исследуют уровень иммуноглобулинов А, М, G, интерлейкинов-4, -6, -1, фактора некроза опухолей (ФНО-

Приведенные выше оба известных способа оценки степени тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей имеют ряд существенных недостатков. Основной недостаток – это сложность выполнения, что ухудшает воспроизводимость известных способов. Это объясняется следующим. Определение цитокинов и популяций клеток требует тщательной обработки материала, а также хранения при заданной постоянной температуре. Кроме того, трудность определения цитокинов заключается также в мимолетности и нестабильности их присутствия в опыте. В результате быстрого разрушения цитокинов нужны условия для стабилизации исследуемого материала и хранения клеток. При исследовании митохондриальных ферментов требуется немедленное выполнение реакции, так как в этом случае исследуемый материал длительно хранить нельзя. Кроме того, необходимость и сложность соблюдения правил выполнения способов снижает и точность количественной оценки конечных результатов. Трудности при воспроизводимости и снижение точности количественной оценки в известных способах снижает их достоверность.

Кроме того, в выявленных известных способах оценки степени тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей для диагностики используют критерии, которые применяют и для диагностики других заболеваний, что снижает специфичность известных способов.

Предлагаемое изобретение «Способ оценки степени тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей» решает задачу создания соответствующего способа, осуществление которого обеспечивает возможность достижения технического результата, заключающегося в повышении специфичности, в повышении достоверности и в упрощении.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе оценки степени тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей, в котором у новорожденного исследуют популяцию лимфоцитов периферической крови в 1 сутки и на 3 сутки жизни, новым является то, что исследование выполняют методом плоидометрии, для чего определяют среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов, при этом, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 1039 до 1064, на 3 сутки – от 775 до 804, то констатируют тяжелую степень гипоксического перинатального поражения ЦНС, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 2231 до 2273, на 3 сутки – от 1942 до 1980, то констатируют среднюю степень тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 3039 до 3092, на 3 сутки – от 2835 до 2874, то констатируют легкую степень гипоксического перинатального поражения ЦНС, если количество ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 3211 до 3253, на 3 сутки – от 2937 до 2964, то констатируют отсутствие гипоксического перинатального поражения ЦНС.

Технический результат достигается следующим образом.

Известен способ диагностики онкологического заболевания методом плоидометрии, в соответствии с которым измеряют содержание ДНК в ядрах клеток ростковых зон нормального эпителия и новообразований, при этом выполняют плоидометрию лимфоцитов в тех же срезах или подсаженных к опухолям в блок лимфотических узлов (Г.Г.Автондилов Введение в количественную патологическую морфологию, М.: Медицина, 1980, с.173…175).

Методология и способ исследования разработаны и усовершенствованы в течение 2-х десятилетий Г.Г.Автандиловым. Плоидометрия использована автором в дифференциальной патогистологической диагностике стадий канцерогена, динамики атеросклеротического процесса, ишемической болезни сердца, функционального состояния гепатоцитов. Использованы компьютерные микротелефотометрические автоматизированные системы с математическим моделированием гистопатологического процесса.

Результаты проведенного патентно-информационного поиска показали, что исследования с применением плоидометрии с целью оценки степени тяжести гипоксии у новорожденных ранее не проводились.

Лимфоцит является самой важной клеткой, отвечающей за иммунитет. Многочисленные исследования показали, что гипоксия является пусковым механизмом в цепи иммунологических состояний у новорожденных. Мозг имеет автономную иммунную систему. Эта система функционирует на уровне лимфоидных клеток спинномозговой жидкости (Т- и В-лимфоциты, их популяции), клеток естественных киллеров, моноцитов, на уровне гуморальных факторов биологически активных веществ (цитокины, медиаторы, пептиды). Это обуславливает возможность исследования на единой информационной модели клетки лимфоцит взаимосвязи иммунных реакций и энергетического метаболизма на фоне гипоксической энцефалопатии у новорожденных. В заявленном способе исследуют популяцию лимфоцитов периферической крови, причем исследование выполняют методом плоидометрии, для чего определяют среднее количественное значение ДНК в ядрах лимфоцитов. Поскольку исследуют популяцию лимфоцитов периферической крови в 1 сутки и на 3 сутки жизни, то, по сути, способ контролирует степень зрелости лимфоцитов по количеству ДНК в ядре при дефиците кислорода в крови, что обуславливает его специфичность и достоверность. Это объясняется тем, что указанные сутки для новорожденного являются реперными физиологическими точками, в которых фиксируют транзиторное состояние крови: 1 сутки – контрольный замер, в 3 сутки количество лимфоцитов в крови снижается, с 3 по 5 – их количество нарастает, с 5 по 7 – их количество не изменяется, затем количество лимфоцитов нарастает и устанавливается в промежутке от 28 до 30 суток. Поскольку в заявленном способе среднее количественное значение ДНК определяют в ядрах лимфоцитов у ребенка с гипоксическим перинатальным поражением ЦНС, это делает заявленный способ специфичным, так как позволяет исследовать только конкретное заболевание: степень гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей. Это также повышает его достоверность. Кроме того, поскольку в заявленном способе в качестве критерия оценки состояния степени тяжести гипоксического поражения ребенка используют среднее количественное значения ДНК в ядрах лимфоцитов, это обеспечивает возможность непосредственно в данный момент времени, т.е. в режиме реального времени, получать информацию о степени зрелости лимфоцитов при дефиците кислорода в крови. Это повышает достоверность способа, повышает его специфичность в отличие от прототипа, где используемые критерии оценки в сочетании дают возможность только опосредованно судить о состоянии организма.

Для заявленного способа, в основе которого лежит плоидометрия популяции лимфоцитов, лимфоцит является материалом для исследования, что очень удобно и упрощает способ, так как кровь может храниться достаточно долго, а сам лимфоцит всегда стабильно в ней присутствует. Кроме того, это обеспечивает воспроизводимость способа, что повышает его достоверность. При этом, поскольку в способе для оценки степени тяжести гипоксии используют только один критерий: определяют среднее количественное значение ДНК в ядрах лимфоцитов – это также упрощает способ.

Опытным путем авторами установлено: если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 1039 до 1064, на 3 сутки – от 775 до 804, то констатируют тяжелую степень гипоксического перинатального поражения ЦНС, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 2231 до 2273, на 3 сутки – от 1942 до 1980, то констатируют среднюю степень тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 3039 до 3092, на 3 сутки – от 2835 до 2874, то констатируют легкую степень гипоксического перинатального поражения ЦНС, если количество ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 3211 до 3253, на 3 сутки – от 2937 до 2964, то констатируют отсутствие гипоксического перинатального поражения ЦНС.

Из полученных результатов видно, что чем ниже показатели средних величин количества ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов периферической крови новорожденных в 1-е и 3-и сутки жизни, тем тяжелее церебральные нарушения. Это можно подтвердить предположением: вероятно, в условиях гипоксии нарушена трансформация пролимфоцитов в полноценные лимфоциты (иммунокомпетентные клетки), участвующие в иммунных реакциях и процессах клеточного энергетического метаболизма ЦНС.

Математические расчеты показали высокую достоверность полученных количественных результатов: р<0,05, что обеспечивает специфичность способа и повышает его достоверность. Также математический расчет показал высокую точность способа – 97,7%, чувствительность – 100% и специфичность – 90,9%.

Предлагаемый способ является объективным количественным методом исследования, позволяющим достоверно определить степень гипоксии новорожденного.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что заявленный способ оценки степени тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей при осуществлении обеспечивает достижение технического результата, заключающегося в повышении специфичности, в повышении достоверности и в упрощении.

Способ оценки степени тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей осуществляют следующим образом. Исследуют популяцию лимфоцитов периферической крови в 1 сутки и на 3 сутки жизни. Исследование выполняют методом плоидометрии, для чего определяют среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 1039 до 1064, на 3 сутки – от 775 до 804, то констатируют тяжелую степень гипоксического перинатального поражения ЦНС, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 2231 до 2273, на 3 сутки – от 1942 до 1980, то констатируют среднюю степень тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 3039 до 3092, на 3 сутки – от 2835 до 2874, то констатируют легкую степень гипоксического перинатального поражения ЦНС, если количество ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сутки составляет от 3211 до 3253, на 3 сутки – от 2937 до 2964, то констатируют отсутствие гипоксического перинатального поражения ЦНС.

Для определения количества ДНК в ядрах лимфоцитов методом плоидометрии осуществляли забор периферической крови в объеме 0,5 мл в 1 и на 3 сутки жизни в стерильные стандартные пробирки. Кровь обрабатывали фиксатором Cytospin Collection Fluid (США) в разведении 1:1. Далее проводилось центрифугирование 0,5 мл крови с одновременным изготовлением мазков в автоматизированной системе Cytospin-3 (США) на стандартных стеклах Shandon (США) толщиной 1 мм в течение 5 мин при режиме 1000 об/мин с малым ускорением. После центрифугирования готовые мазки высушивались и окрашивались в автомате Shandon Linistain GLX (США) по методу Фельгена для селективного выявления ДНК в ядрах лимфоцитов. Препараты просматривались при помощи микроскопа Nikon Eclipse E-400 (Япония) с использованием окуляра 10х и объектива 100х/1.25 с масляной иммерсией. Изображения препаратов выводились на монитор микроскопа с помощью цифровой телекамеры Mintron 62W1P и программы ASUS Digital VCR выводились в компьютер Pentium-4, сохранялись в виде файлов формата JPEG и анализировались с применением программы Adobe Photoshop 6.0.

Среднее количество ДНК вычислялось денситометрически с построением гистограмм в относительных единицах – пикселах. В каждом препарате вычисления производились не менее чем по 25 ядрам, определяли средние величины, минимальное и максимальное значение относительных единиц.

Математическая обработка результатов исследования позволила установить пределы колебаний показателей среднего количества ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов, с высокой степенью достоверности характеризующих степень тяжести поражения ЦНС.

Авторами было обследовано 114 доношенных новорожденных нормотрофиков обоего пола (мальчиков – 59, девочек – 55) со средней массой тела 3400±24,08 г, ростом 51,4±0,4 см. Из исследования исключены новорожденные с ЗВУР (задержкой внутриутробного развития), врожденными пороками развития и дети с инфекционными гнойно-воспалительными заболеваниями.

Проводили плоидометрию лимфоцитов в 1 сутки и на 3 сутки жизни.

Все дети были разделены на группы:

1-я группа (23 ребенка) – гипоксическая энцефалопатия I степени (легкая степень).

2-я группа (23 ребенка) – гипоксическая энцефалопатия II степени тяжести (средняя).

3-я группа (23 ребенка) – гипоксическая энцефалопатия III степени тяжести (тяжелая).

4-я группа (45 детей) – контрольная (здоровые).

В контрольной группе средние величины количества ДНК в ядрах лимфоцитов крови (в относительных единицах) составили в 1 сутки от 3211 до 3253, на 3 сутки от 2937 до 2964.

У новорожденных 1-й группы с легкой степенью гипоксического поражения ЦНС отмечалось снижение средних величин количества ДНК в лимфоцитах крови: в 1 сутки составляет от 3039 до 3092, на 3 сутки – от 2835 до 2874.

У новорожденных 2-й группы с гипоксическим поражением ЦНС II степени тяжести при заборе крови в 1 сутки составляет от 2231 до 2273, на 3 сутки – от 2835 до 2874.

У детей с гипоксической энцефалопатией III степени тяжести показатели средних величин ДНК в лимфоцитах крови были сниженными на 1-е и 3-и сутки жизни: в 1 сутки составляет от 1039 до 1064, на 3 сутки – от 775 до 804.

Пример № 1

Ребенок К., 2 дня.

От 1-й беременности, протекавшей без особенностей, от первых срочных родов в 39 недель беременности, длительность родов 8 часов 30 мин. Безводный период 5 часов 30 мин. Родилась девочка 3600 г, длина 51 см, окружность головы 35 см, окружность груди 33 см, оценка по шкале Апгар 8-9 баллов. Неврологический статус при рождении без особенностей. В 1-е сутки жизни содержание ДНК в ядрах лимфоцитов (средние величины) – 3041, что снижено по сравнению с нормой, на 3-й сутки – 2836, что соответствовало гипоксической энцефалопатии легкой степени.

На 2-е сутки отмечался непостоянный тремор в руках, иногда вздрагивание, снижение мышечного тонуса в руках (незначительное), непостоянный спонтанный рефлекс Моро. Клинические данные свидетельствуют о гипоксической энцефалопатии легкой степени. По данным нейросонографии (НСГ) патологии не выявлено. К 5-му дню неврологические симптомы исчезли. Ребенок выписан домой. Динамическое наблюдение в неонатальном периоде в течение 28 дней жизни и далее показало, что ребенок практически здоров.

Пример № 2

Ребенок А., 2 дня.

Диагноз: Гипоксическое поражение ЦНС II степени тяжести, гипертензионный синдром. Перивентрикулярный отек. Ребенок родился от 3-й беременности с оценкой по шкале Апгар 6-7 баллов. При рождении состояние оценивалось как средне-тяжелое. Ребенок от 1-х родов (в анамнезе 2 мед. аборта), в 40 недель беременности, длительность родов – 6 часов 40 мин, безводный период – 8 часов. Родился мальчик с массой тела 3200 г, длина 50 см, окружность головы 34 см, окружность груди 32 см. Тремор конечностей со 2-х суток, спонтанный Моро, мышечный тонус снижен в руках, в ногах повышен в проксимальных отделах во флексорах. Сухожильные рефлексы высокие. На НСГ (3-и сутки) – перивентрикулярный отек с 2-х сторон. На 5-е сутки расхождение сагиттального шва с 0,5 до 2 см. При поступлении в отделение патологии новорожденных на НСГ: МПЩ – 3 см, ПРБЖ S=4 мм, Д=4 мм. Расширение вен глазного дна. Показатели средних величин количества ДНК в ядрах лимфоцитов (метод плоидометрии) в 1-е сутки – 2233, на 3-й – 1948, что соответствует средней степени тяжести энцефалопатии.

Заключение: гипоксическая энцефалопатия средней степени тяжести подтверждается клиническими данными и НСГ.

Пример № 3

Ребенок И. 21 день, мальчик, от 3-й беременности. Беременность протекала на фоне гестоза средней тяжести, ожирения II ст. Роды в срок, первичная слабость родовой деятельности, неэффективность стимуляции. Безводный период 11 часов. Операция Кесарево сечение. Оценка по шкале Апгар на 1-й минуте – 3 балла, на 5-й минуте – 5 баллов. Через 20 минут взят на ИВЛ на фоне РДС. На ИВЛ находился 2-е суток. Масса тела при рождении – 3200, рост – 51 см. В 1 сутки жизни показатели средних величин ДНК в ядрах лимфоцитов крови – 1040, на 3 сутки – 801, что соответствует тяжелой степени гипоксического поражения ЦНС. В роддоме проведена терапия в палате реанимации. Переведен на II этап выхаживания на 7-е сутки. НСГ: перивентрикулярный отек II степени, ВЖК II ст. слева. Состояние средней тяжести по неврологической симптоматике: синдром угнетения, гипорефлексия, снижение рефлекса сосания, патологическая глазная симптоматика: синдром Грефе, горизонтальный нистагм.

Диагноз: Перинатальное поражение ЦНС гипоксически-геморрагического генеза тяжелой степени, острый период, синдром угнетения; ВЖК II степени слева.

Из клинических примеров следует, что применение в заявленном способе диагностики плоидометрии позволяет объективно оценить степень тяжести перинатального гипоксического поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей.

Формула изобретения

Способ оценки степени тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей, в котором у новорожденного исследуют популяцию лимфоцитов периферической крови в 1 сут и на 3 сут жизни, отличающийся тем, что исследование выполняют методом плоидометрии, для чего определяют среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов, при этом, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сут составляет от 1039 до 1064, на 3 сут -от 775 до 804, то констатируют тяжелую степень гипоксического перинатального поражения ЦНС, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сут составляет от 2231 до 2273, на 3 сут – от 1942 до 1980, то констатируют среднюю степень тяжести гипоксического перинатального поражения ЦНС, если среднее количественное значение ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сут составляет от 3039 до 3092, на 3 сут – от 2835 до 2874, то констатируют легкую степень гипоксического перинатального поражения ЦНС, если количество ДНК в ядрах исследуемой популяции лимфоцитов в 1 сут составляет от 3211 до 3253, на 3 сут -от 2937 до 2964, то констатируют отсутствие гипоксического перинатального поражения ЦНС.