Патент на изобретение №2344831

(54) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

(57) Реферат:

Изобретние относится к области медицины и касается композиций и способов терапии и диагностики злокачественной опухоли, такой как рак молочной железы. Сущность изобретения включает композиции, которые могут содержать один или несколько белков опухоли молочной железы, их иммуногенные части или полинуклеотиды, которые кодируют такие части. В альтернативном случае терапевтическая композиция может содержать антиген-презентирующую клетку, которая экспрессирует белок опухоли молочной железы, или Т-клетку, которая специфична по отношению к клеткам, экспрессирующим такой белок. Такие композиции можно применять для профилактики и лечения таких заболеваний, как рак молочной железы. Также представлены диагностические способы, основанные на определении в образце белка опухоли молочной железы или мРНК, кодирующей такой белок. Преимущество изобретения заключается в использовании для диагностики и терапии рака молочной железы пептидов, полученных из белка, экспрессированного опухолью молочной железы. 22 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

ОБЛАСТИ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Данное изобретение, в общем, относится к терапии и диагностике злокачественных опухолей, таких как рак молочной железы. Более конкретно изобретение относится к полипептидам, содержащим, по меньшей мере, часть белка опухоли молочной железы, и к полинуклеотидам, кодирующим такие полипептиды. Такие полипептиды и полинуклеотиды можно использовать в композициях для предотвращения и лечения рака молочной железы и для диагностики и контроля таких злокачественных опухолей.

ПРЕДПОСЫЛКА ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Рак молочной железы представляет существенную проблему для здоровья женщин и Соединенных Штатах и во всем мире. Хотя были достигнуты успехи в выявлении и лечении заболевания, рак молочной железы остается второй главной причиной связанных со злокачественными опухолями смертельных исходов у женщин, поражающим каждый год более 180000 женщин в Соединенных Штатах. Для женщин в Северной Америке шанс заболеть раком молочной железы в течение жизни составляет один из восьми.

В настоящее время нет вакцины или другого универсального успешного способа предотвращения или лечения рака молочной железы. Терапия заболевания в настоящее время основана на комбинации ранней диагностики (посредством обычных процедур скрининга молочной железы) и агрессивного лечения, которое может включать один или несколько из множества способов лечения, таких как хирургия, лучевая терапия, химиотерапия и гормональная терапия. Курс лечения в конкретном случае рака молочной железы часто выбирают на основе ряда прогностических параметров, включая анализ специфичных опухолевых маркеров. Смотри, например, Porter-Jordan and Lippman, Breast Cancer 8: 73-100 (1994). Однако использование установленных маркеров часто приводит к результату, который трудно интерпретировать, и высокая смертность, наблюдаемая среди пациентов с раком молочной железы, свидетельствует о том, что необходимы усовершенствования в области лечения, диагностики и предупреждения заболевания.

Следовательно, в данной области существует необходимость в усовершенствованных способах лечения и диагностики рака молочной железы. Данное изобретение удовлетворяет указанные потребности и, кроме того, дает другие связанные преимущества.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Кратко, данное изобретение относится к композициям и способам диагностики и терапии злокачественной опухоли, такой как рак молочной железы. В одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим, по меньшей мере, часть белка опухоли молочной железы или его вариант. Определенные части и другие варианты являются иммуногенными, так что способность варианта реагировать с антигенспецифичной антисывороткой существенно не снижается. В некоторых вариантах полипептид содержит последовательность, которую кодирует полинуклеотидная последовательность, выбранная из группы, состоящей из: последовательностей, указанных SEQ ID NO: 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 и 489; (b) вариантов последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 и 489; и (c) комплементов последовательности (a) или (b). В конкретных вариантах полипептиды согласно данному изобретению содержат, по меньшей мере, часть белка опухоли, который включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 176, 179, 181, 469-473, 475, 485, 487 и 488, и их варианты.

Данное изобретение, кроме того, относится к полинуклеотидам, которые кодируют полипептид, описанный выше, или их частям (таким как часть, кодирующая, по меньшей мере, 15 аминокислотных остатков белка опухоли молочной железы), к экспрессирующим векторам, содержащим такие полинуклеотиды, и клеткам-хозяевам, трансформированным или трансфицированным такими экспрессирующими векторами.

В других аспектах данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид или полинуклеотид, которые описаны выше, и физиологически приемлемый носитель.

В связанном аспекте данное изобретение относится к иммуногенным композициям или вакцинам для профилактического или терапевтического применения. Такие композиции содержат полипептид или полинуклеотид, которые описаны выше, и иммуностимулятор.

Данное изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям, которые содержат: (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывается с белком опухоли молочной железы; и (b) физиологически приемлемый носитель.

В следующих аспектах данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим: (а) антиген-презентирующую клетку, которая экспрессирует полипептид, описанный выше, и (b) фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Антиген-презентирующие клетки включают дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и В-клетки.

В связанных аспектах представлены иммуногенные композиции или вакцины, которые содержат: (а) антиген-презентирующую клетку, которая экспрессирует полипептид, описанный выше, и (b) иммуностимулятор.

В других аспектах данное изобретение, кроме того, относится к гибридным белкам, которые содержат, по меньшей мере, один полипептид, который описан выше, а также к полинуклеотидам, кодирующим такие гибридные белки. Примерные гибридные белки согласно данному изобретению содержат первую часть аминокислот и вторую часть аминокислот, где первая часть аминокислот включает в себя 9 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот из маммаглобина, который изображен аминокислотами 1-93 SEQ ID NO: 493; где вторая часть аминокислот включает в себя 9 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот из B726P, которые изображены SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 469 или SEQ ID NO: 176; и где первая часть аминокислот связана либо с аминоконцом, либо карбоксильным концом второй части аминокислот.

Кроме того, в следующих вариантах данное изобретение относится к гибридным белкам, в которых указанная первая часть аминокислот выбрана из группы, состоящей из:

IDELKECFLNQTDETLSNVE (аминокислоты 59-78 SEQ ID NO: 493);

TTNAIDELKECFLNQ (аминокислоты 55-69 SEQ ID NO: 493);

SQHCYAGSGCPLLENVISKTI (аминокислоты 13-33 SEQ ID NO: 493);

EYKELLQEFIDDNATTNAID (аминокислоты 41-60 SEQ ID NO: 493);

KLLMVLMLA (аминокислоты 2-10 SEQ ID NO: 493);

QEFIDDNATTNAI (аминокислоты 47-59 SEQ ID NO: 493); и

LKECFLNQTDETL (аминокислоты 62-74 SEQ ID NO: 493).

В альтернативных вариантах представлены гибридные белки, в которых вторая часть аминокислот включает в себя 9 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот, кодируемых (1) объединенной открытой рамкой считывания (ORF) из «левой» и «правой» ORF, B726P, указанной в SEQ ID NO: 475; (2) «левой» ORF B726P, которая изображена в SEQ ID NO: 469; и (3) «правой» ORF B726P, указанной в SEQ ID NO: 176. Гибридные белки согласно данному изобретению также могут содержать вторую часть аминокислот, которая включает в себя 9 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот из аминокислотной последовательности, изображенной аминокислотами 1-129 SEQ ID NO: 475. Кроме того, дополнительные примеры гибридных белков изображены здесь в виде SEQ ID NO: 493; SEQ ID NO: 494 и SEQ ID NO: 495.

Представлены гибридные белки, в которых часть аминокислот маммаглобина связана с аминоконцом части аминокислот B726P, наряду с тем, что представлены другие гибридные белки, в которых часть аминокислот маммаглобина связана с карбоксильным концом части аминокислот B726P. Связь между частью аминокислот маммаглобина и частью B726P может быть представлена ковалентной связью. Кроме того, участок аминокислот либо несвязанный, либо связанный с маммаглобином и/или B726P, может быть включен между или на амино- или на карбоксильном конце части аминокислот маммаглобина и/или B726P.

Данное изобретение также относится к изолированным полинуклеотидам, которые кодируют любой из гибридных белков, которые здесь конкретно описаны, а также те гибридные белки, которые могут быть получены при обычном экспериментировании специалистом в данном области.

Связанные аспекты относятся к фармацевтическим композициям, содержащим гибридный белок или полинуклеотид, кодирующий гибридный белок, в комбинации с физиологически приемлемым носителем.

Кроме того, в других аспектах представлены композиции, которые содержат гибридный белок или полинуклеотид, кодирующий гибридный белок, в комбинации с иммуностимулятором.

В следующих аспектах данное изобретение относится к способам ингибирования развития злокачественной опухоли у пациента, включающим в себя введение пациенту композиции, указанной выше. Пациент может быть поражен раком молочной железы, и в этом случае способы обеспечивают лечение заболевания, или пациенту, у которого предполагается риск развития заболевания, может быть проведено профилактическое лечение.

В других аспектах данное изобретение, кроме того, относится к способам удаления опухолевых клеток из биологического образца, включающим в себя осуществление контакта биологического образца с Т-клетками, которые специфично реагируют с белком опухоли молочной железы, при этом стадию контактирования выполняют в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы обеспечить удаление клеток, экспрессирующих белок, из образца.

В связанных аспектах представлены способы ингибирования развития злокачественной опухоли у пациента, включающие в себя введение пациенту биологического образца, обработанного, как описано выше.

В других аспектах, кроме того, представлены способы стимуляции и/или экспансии Т-клеток, специфичных по отношению к белку опухоли молочной железы, включающие в себя осуществление контакта Т-клеток с одним или несколькими из следующих факторов: (i) полипептидом, который описан выше; (ii) полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид; и/или (iii) антиген-презентирующей клеткой, которая экспрессирует такой полипептид; в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения стимуляции и/или экспансии Т-клеток. Также представлены изолированные популяции Т-клеток, включающие в себя Т-клетки, полученные, как описано выше.

В следующих аспектах данное изобретение относится к способам ингибирования развития злокачественной опухоли у пациента, включающим в себя введение пациенту эффективного количества популяции Т-клеток, которая описана выше.

Данное изобретение, кроме того, относится к способам ингибирования развития злокачественной опухоли у пациента, включающим в себя следующие стадии: (а) инкубирование CD4⁺ и/или CD8⁺ Т-клеток, выделенных из организма пациента с одним или несколькими из следующих факторов: (i) полипептидом, содержащим, по меньшей мере, иммуногенную часть белка опухоли молочной железы; (ii) полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид; и (iii) антиген-презентирующей клеткой, которая экспрессирует такой полипептид; и (b) введение пациенту эффективного количества пролиферирующих Т-клеток, и тем самым ингибирование развития злокачественной опухоли у пациента. Пролиферирующие клетки перед введением пациенту можно, но не обязательно, клонировать.

В следующих аспектах данное изобретение относится к способам определения наличия или отсутствия злокачественной опухоли у пациента, включающим в себя: (а) осуществление контакта биологического образца, полученного от пациента, со связывающим агентом, который связывается с полипептидом, указанным выше; (b) определение в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; и (с) сравнение количества полипептида с предварительно определенным отсекающим значением и определение исходя из этого наличия или отсутствия злокачественной опухоли у пациента. В предпочтительных вариантах связывающим агентом является антитело, более предпочтительно моноклональное антитело. Злокачественной опухолью является рак молочной железы.

В других аспектах данное изобретение также относится к способам мониторинга прогрессирования злокачественной опухоли у пациента. Такие способы включают в себя следующие стадии: (а) осуществление контакта биологического образца, полученного от пациента в первой временной точке, со связывающим агентом, который связывает полипептид, указанный выше; (b) определение в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; (с) повторение стадий (а) и (b) с использованием биологического образца, полученного от пациента в более поздней временной точке; и (d) сравнение количества полипептида, определенного на стадии (с) с количеством, определенным на стадии (b), и тем самым осуществление мониторинга прогрессирования злокачественной опухоли у пациента.

В других аспектах данное изобретение, кроме того, относится к способам определения наличия или отсутствия злокачественной опухоли у пациента, включающим в себя следующие стадии: (а) осуществление контакта биологического образца, полученного от пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует белок опухоли молочной железы; (b) определение в образце уровня полинуклеотида, предпочтительно мРНК, который гибридизуется с олигонуклеотидом; и (с) сравнение уровня полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, с предварительно определенным отсекающим значением, и тем самым определение наличия или отсутствия злокачественной опухоли у пациента. В некоторых вариантах количество мРНК определяют посредством полимеразной цепной реакции, например, с использованием, по меньшей мере, одного олигонуклеотидного праймера, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, который указан выше, или комплементом такого полинуклеотида. В других вариантах количество мРНК определяют с применением способа гибридизации, используя олигонуклеотидный зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует полипептид, указанный выше, или с комплементом такого полинуклеотида.

В связанных аспектах представлены способы мониторинга прогрессирования злокачественной опухоли у пациента, включающие в себя следующие стадии: (а) осуществление контакта биологического образца, полученного от пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует белок опухоли молочной железы; (b) определение в образце количества полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, (с) повторение стадий (а) и (b) с использованием биологического образца, полученного от пациента в более поздней временной точке; и (d) сравнение количества полинуклеотида, определенного на стадии (с), с количеством, определенным на стадии (b), и тем самым осуществление мониторинга прогрессирования злокачественной опухоли у пациента.

В следующих аспектах данное изобретение относится к антителам, таким как моноклональные антитела, которые связываются с полипептидом, описанным выше, а также к диагностическим наборам, содержащим такие антитела. Также представлены диагностические наборы, содержащие один или несколько олигонуклеотидных зондов или праймеров, описанных выше.

Указанные и другие аспекты данного изобретения станут очевидными при обращении к следующему подробному описанию и чертежу. Все сообщаемые здесь ссылки включены в виде ссылок в полном объеме, как они были бы включены при отдельном цитировании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖА И ИДЕНТИФИКАТОРОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ.

На чертеже показаны результаты Нозерн-блота клона SYN18C6 (SEQ ID NO: 40).

SEQ ID NO: 1 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT2.

SEQ ID NO: 2 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT6.

SEQ ID NO: 3 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT7.

SEQ ID NO: 4 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT10.

SEQ ID NO: 5 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT13.

SEQ ID NO: 6 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT14.

SEQ ID NO: 7 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT15.

SEQ ID NO: 8 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT16.

SEQ ID NO: 9 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT17.

SEQ ID NO: 10 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT22.

SEQ ID NO: 11 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT25.

SEQ ID NO: 12 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT28.

SEQ ID NO: 13 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT32.

SEQ ID NO: 14 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT33.

SEQ ID NO: 15 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT34.

SEQ ID NO: 16 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT36.

SEQ ID NO: 17 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT37.

SEQ ID NO: 18 представляет собой определенную последовательность кДНК JBT51.

SEQ ID NO: 19 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT1.

SEQ ID NO: 20 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT7.

SEQ ID NO: 21 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT11.

SEQ ID NO: 22 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT14.

SEQ ID NO: 23 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT18.

SEQ ID NO: 24 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT19.

SEQ ID NO: 25 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT20.

SEQ ID NO: 26 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT21.

SEQ ID NO: 27 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT22.

SEQ ID NO: 28 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT28.

SEQ ID NO: 29 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT29.

SEQ ID NO: 30 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT33.

SEQ ID NO: 31 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT37.

SEQ ID NO: 32 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT38.

SEQ ID NO: 33 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT47.

SEQ ID NO: 34 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT48.

SEQ ID NO: 35 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT50.

SEQ ID NO: 36 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT51.

SEQ ID NO: 37 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT52.

SEQ ID NO: 38 представляет собой определенную последовательность кДНК JBTT54.

SEQ ID NO: 39 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN17F4.

SEQ ID NO: 40 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN18C6 (также известного как В709Р).

SEQ ID NO: 41 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN19A2.

SEQ ID NO: 42 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN19C8.

SEQ ID NO: 43 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN20A12.

SEQ ID NO: 44 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN20G6.

SEQ ID NO: 45 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN20G6-2.

SEQ ID NO: 46 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN21B9.

SEQ ID NO: 47 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN21B9-2.

SEQ ID NO: 48 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN21C10.

SEQ ID NO: 49 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN21G10.

SEQ ID NO: 50 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN21G10-2.

SEQ ID NO: 51 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN21G11.

SEQ ID NO: 52 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN21G11-2.

SEQ ID NO: 53 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN21H8.

SEQ ID NO: 54 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN22A10.

SEQ ID NO: 55 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN22A10-2.

SEQ ID NO: 56 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN22A12.

SEQ ID NO: 57 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN22A2.

SEQ ID NO: 58 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN22B4.

SEQ ID NO: 59 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN22C2.

SEQ ID NO: 60 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN22E10.

SEQ ID NO: 61 представляет собой определенную последовательность кДНК SYN22F2.

SEQ ID NO: 62 представляет собой рассчитанную аминокислотную последовательность SYN18C6 (также известную как B709P).

SEQ ID NO: 63 представляет собой определенную последовательность кДНК B723P.

SEQ ID NO: 64 представляет собой определенную последовательность кДНК B724P.

SEQ ID NO: 65 представляет собой определенную последовательность кДНК B770P.

SEQ ID NO: 66 представляет собой определенную последовательность кДНК B716P.

SEQ ID NO: 67 представляет собой определенную последовательность кДНК B725P.SEQ ID NO: 68 представляет собой определенную последовательность кДНК B717P.

SEQ ID NO: 69 представляет собой определенную последовательность кДНК B771P.

SEQ ID NO: 70 представляет собой определенную последовательность кДНК B722P.

SEQ ID NO: 71 представляет собой определенную последовательность кДНК B726P.

SEQ ID NO: 72 представляет собой определенную последовательность кДНК B727P.

SEQ ID NO: 73 представляет собой определенную последовательность кДНК B728P.

SEQ ID NO: 74-87 представляют собой определенные последовательности кДНК выделенных клонов, которые проявляют гомологию с известными последовательностями.

SEQ ID NO: 88 представляет собой определенную последовательность кДНК 13053.

SEQ ID NO: 89 представляет собой определенную последовательность кДНК 13057.

SEQ ID NO: 90 представляет собой определенную последовательность кДНК 13059.

SEQ ID NO: 91 представляет собой определенную последовательность кДНК 13065.

SEQ ID NO: 92 представляет собой определенную последовательность кДНК 13067.

SEQ ID NO: 93 представляет собой определенную последовательность кДНК 13068.

SEQ ID NO: 94 представляет собой определенную последовательность кДНК 13071.

SEQ ID NO: 95 представляет собой определенную последовательность кДНК 13072.

SEQ ID NO: 96 представляет собой определенную последовательность кДНК 13073.

SEQ ID NO: 97 представляет собой определенную последовательность кДНК 13075.

SEQ ID NO: 98 представляет собой определенную последовательность кДНК 13078.

SEQ ID NO: 99 представляет собой определенную последовательность кДНК 13079.

SEQ ID NO: 100 представляет собой определенную последовательность кДНК 13081.

SEQ ID NO: 101 представляет собой определенную последовательность кДНК 13082.

SEQ ID NO: 102 представляет собой определенную последовательность кДНК 13092.

SEQ ID NO: 103 представляет собой определенную последовательность кДНК 13097.

SEQ ID NO: 104 представляет собой определенную последовательность кДНК 13101.

SEQ ID NO: 105 представляет собой определенную последовательность кДНК 13102.

SEQ ID NO: 106 представляет собой определенную последовательность кДНК 13119.

SEQ ID NO: 107 представляет собой определенную последовательность кДНК 13131.

SEQ ID NO: 108 представляет собой определенную последовательность кДНК 13133.

SEQ ID NO: 109 представляет собой определенную последовательность кДНК 13135.

SEQ ID NO: 110 представляет собой определенную последовательность кДНК 13139.

SEQ ID NO: 111 представляет собой определенную последовательность кДНК 13140.

SEQ ID NO: 112 представляет собой определенную последовательность кДНК 13146.

SEQ ID NO: 113 представляет собой определенную последовательность кДНК 13147.

SEQ ID NO: 114 представляет собой определенную последовательность кДНК 13148.

SEQ ID NO: 115 представляет собой определенную последовательность кДНК 13149.

SEQ ID NO: 116 представляет собой определенную последовательность кДНК 13151.

SEQ ID NO: 117 представляет собой определенную последовательность кДНК 13051.

SEQ ID NO: 118 представляет собой определенную последовательность кДНК 13052.

SEQ ID NO: 119 представляет собой определенную последовательность кДНК 13055.

SEQ ID NO: 120 представляет собой определенную последовательность кДНК 13058.

SEQ ID NO: 121 представляет собой определенную последовательность кДНК 13062.

SEQ ID NO: 122 представляет собой определенную последовательность кДНК 13064

SEQ ID NO: 123 представляет собой определенную последовательность кДНК 13080

SEQ ID NO: 124 представляет собой определенную последовательность кДНК 13093.

SEQ ID NO: 125 представляет собой определенную последовательность кДНК 13094.

SEQ ID NO: 126 представляет собой определенную последовательность кДНК 13095.

SEQ ID NO: 127 представляет собой определенную последовательность кДНК 13096.

SEQ ID NO: 128 представляет собой определенную последовательность кДНК 13099.

SEQ ID NO: 129 представляет собой определенную последовательность кДНК 13100

SEQ ID NO: 130 представляет собой определенную последовательность кДНК 13103.

SEQ ID NO: 131 представляет собой определенную последовательность кДНК 13106.

SEQ ID NO: 132 представляет собой определенную последовательность кДНК 13107.

SEQ ID NO: 133 представляет собой определенную последовательность кДНК 13108.

SEQ ID NO: 134 представляет собой определенную последовательность кДНК 13121

SEQ ID NO: 135 представляет собой определенную последовательность кДНК 13126.

SEQ ID NO: 136 представляет собой определенную последовательность кДНК 13129.

SEQ ID NO: 137 представляет собой определенную последовательность кДНК 13130.

SEQ ID NO: 138 представляет собой определенную последовательность кДНК 13134.

SEQ ID NO: 139 представляет собой определенную последовательность кДНК 13141.

SEQ ID NO: 140 представляет собой определенную последовательность кДНК 13142.

SEQ ID NO: 141 представляет собой определенную последовательность кДНК 14376.

SEQ ID NO: 142 представляет собой определенную последовательность кДНК 14377.

SEQ ID NO: 143 представляет собой определенную последовательность кДНК 14383.

SEQ ID NO: 144 представляет собой определенную последовательность кДНК 14384.

SEQ ID NO: 145 представляет собой определенную последовательность кДНК 14387.

SEQ ID NO: 146 представляет собой определенную последовательность кДНК 14392.

SEQ ID NO: 147 представляет собой определенную последовательность кДНК 14394.

SEQ ID NO: 148 представляет собой определенную последовательность кДНК 14398.

SEQ ID NO: 149 представляет собой определенную последовательность кДНК 14401.

SEQ ID NO: 150 представляет собой определенную последовательность кДНК 14402.

SEQ ID NO: 151 представляет собой определенную последовательность кДНК 14405.

SEQ ID NO: 152 представляет собой определенную последовательность кДНК 14409.

SEQ ID NO: 153 представляет собой определенную последовательность кДНК 14412.

SEQ ID NO: 154 представляет собой определенную последовательность кДНК 14414.

SEQ ID NO: 155 представляет собой определенную последовательность кДНК 14415.

SEQ ID NO: 156 представляет собой определенную последовательность кДНК 14416.

SEQ ID NO: 157 представляет собой определенную последовательность кДНК 14419.

SEQ ID NO: 158 представляет собой определенную последовательность кДНК 14426.

SEQ ID NO: 159 представляет собой определенную последовательность кДНК 14427.

SEQ ID NO: 160 представляет собой определенную последовательность кДНК 14375.

SEQ ID NO: 161 представляет собой определенную последовательность кДНК 14378.

SEQ ID NO: 162 представляет собой определенную последовательность кДНК 14379.

SEQ ID NO: 163 представляет собой определенную последовательность кДНК 14380.

SEQ ID NO: 164 представляет собой определенную последовательность кДНК 14381.

SEQ ID NO: 165 представляет собой определенную последовательность кДНК 14382.

SEQ ID NO: 166 представляет собой определенную последовательность кДНК 14388.

SEQ ID NO: 167 представляет собой определенную последовательность кДНК 14399.

SEQ ID NO: 168 представляет собой определенную последовательность кДНК 14406.

SEQ ID NO: 169 представляет собой определенную последовательность кДНК 14407.

SEQ ID NO: 170 представляет собой определенную последовательность кДНК 14408.

SEQ ID NO: 171 представляет собой определенную последовательность кДНК 14417.

SEQ ID NO: 172 представляет собой определенную последовательность кДНК 14418.

SEQ ID NO: 173 представляет собой определенную последовательность кДНК 14423.

SEQ ID NO: 174 представляет собой определенную последовательность кДНК 14424.

SEQ ID NO: 175 представляет собой определенную последовательность кДНК B726P-20.

SEQ ID NO: 176 является рассчитанной аминокислотной последовательностью B726P-20.

SEQ ID NO: 177 является праймером ПЦР.

SEQ ID NO: 178 представляет собой определенную последовательность кДНК B726P-74.

SEQ ID NO: 179 является рассчитанной аминокислотной последовательностью B726P-74.

SEQ ID NO: 180 представляет собой определенную последовательность кДНК B726P-79.

SEQ ID NO: 181 является рассчитанной аминокислотной последовательностью B726P-79.

SEQ ID NO: 182 представляет собой определенную последовательность кДНК 19439.1, проявляющую гомологию с геном маммаглобина.

SEQ ID NO: 183 представляет собой определенную последовательность кДНК 19407.1, проявляющую гомологию с геном кератина человека.

SEQ ID NO: 184 представляет собой определенную последовательность кДНК 19428.1, проявляющую гомологию с клоном хромосомы 17 человека.

SEQ ID NO: 185 представляет собой определенную последовательность кДНК B808P (19408), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 186 представляет собой определенную последовательность кДНК 19460.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 187 представляет собой определенную последовательность кДНК 19419.1, проявляющую гомологию с легкой цепью каппа Ig.

SEQ ID NO: 188 представляет собой определенную последовательность кДНК 19411.1, проявляющую гомологию с коллагеном альфа-1 человека.

SEQ ID NO: 189 представляет собой определенную последовательность кДНК 19420.1, проявляющую гомологию с протеиназой-3 mus musculus.

SEQ ID NO: 190 представляет собой определенную последовательность кДНК 19432.1, проявляющую гомологию с боксом высоко подвижной группы человека.

SEQ ID NO: 191 представляет собой определенную последовательность кДНК 19412.1, проявляющую гомологию с геном активатора плазминогена человека.

SEQ ID NO: 192 представляет собой определенную последовательность кДНК 19415.1, проявляющую гомологию с активируемой митогеном протеинкиназой.

SEQ ID NO: 193 представляет собой определенную последовательность кДНК 19409.1, проявляющую гомологию с белком хондроитинсульфат-протеогликана.

SEQ ID NO: 194 представляет собой определенную последовательность кДНК 19406.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 195 is представляет собой определенную последовательность кДНК 19421.1, проявляющую гомологию с фибронектином человека.

SEQ ID NO: 196 представляет собой определенную последовательность кДНК 19426.1, проявляющую гомологию с элементом 3, отвечающим на рецептор ретиноевой кислоты.

SEQ ID NO: 197 представляет собой определенную последовательность кДНК 19425.1, проявляющую гомологию с мРНК MyD88.

SEQ ID NO: 198 представляет собой определенную последовательность кДНК 19424.1, проявляющую гомологию с мРНК пептидного транспортера (TAP-1)

SEQ ID NO: 199 представляет собой определенную последовательность кДНК 19429.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 200 представляет собой определенную последовательность кДНК 19435.1, проявляющую гомологию с муцином полиморфного эпителия человека.

SEQ ID NO: 201 представляет собой определенную последовательность кДНК B813P (19434.1), проявляющую гомологию с фактором транскрипции GATA-3 человека.

SEQ ID NO: 202 представляет собой определенную последовательность кДНК 19461.1, проявляющую гомологию с геном AP-2 человека.

SEQ ID NO: 203 представляет собой определенную последовательность кДНК 19450.1, проявляющую гомологию с регуляторным фактором, связывающим ДНК.

SEQ ID NO: 204 представляет собой определенную последовательность кДНК 19451.1, проявляющую гомологию с регуляторным кофактором обмена Na/H.

SEQ ID NO: 205 представляет собой определенную последовательность кДНК 19462.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 206 представляет собой определенную последовательность кДНК 19455.1, проявляющую гомологию с мРНК гистона HAS.Z человека.

SEQ ID NO: 207 представляет собой определенную последовательность кДНК 19459.1, проявляющую гомологию с клоном 179N16 РАС.

SEQ ID NO: 208 представляет собой определенную последовательность кДНК 19464.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 209 представляет собой определенную последовательность кДНК 19414.1, проявляющую гомологию с липофилином В.SEQ ID NO: 210 представляет собой определенную последовательность кДНК 19413.1, проявляющую гомологию с клоном hRPK.209_J_20 хромосомы 17.

SEQ ID NO: 211 представляет собой определенную последовательность кДНК 19416.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 212 представляет собой определенную последовательность кДНК 19437.1, проявляющую гомологию с мРНК клона 24976 человека.

SEQ ID NO: 213 представляет собой определенную последовательность кДНК 19449.1, проявляющую гомологию с ДНК мыши корового белка PG-M.

SEQ ID NO: 214 представляет собой определенную последовательность кДНК 19446.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 215 представляет собой определенную последовательность кДНК 19452.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 216 представляет собой определенную последовательность кДНК 19483.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 217 представляет собой определенную последовательность кДНК 19526.1, проявляющую гомологию с липофилином С человека.

SEQ ID NO: 218 представляет собой определенную последовательность кДНК 19484.1, проявляющую гомологию с секретируемым белком XAG-2 цементной железы.

SEQ ID NO: 219 представляет собой определенную последовательность кДНК 19470.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 220 представляет собой определенную последовательность кДНК 19469.1, проявляющей гомологию с геном HLA-DM человека.

SEQ ID NO: 221 представляет собой определенную последовательность кДНК 19482.1, проявляющую гомологию с геном белка pS2 человека.

SEQ ID NO: 222 представляет собой определенную последовательность кДНК B805P (19468.1), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 223 представляет собой определенную последовательность кДНК 19467.1, проявляющую гомологию с мРНК тромбоспондина человека.

SEQ ID NO: 224 представляет собой определенную последовательность кДНК 19498.1, проявляющую гомологию с геном CDC2, вовлеченным в контроль клеточного цикла.

SEQ ID NO: 225 представляет собой определенную последовательность кДНК 19506.1, проявляющую гомологию с кДНК человека для белка TREB.

SEQ ID NO: 226 представляет собой определенную последовательность кДНК B806P (19505.1), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 227 представляет собой определенную последовательность кДНК 19486.1, проявляющую гомологию с эпидермальным кератином типа I.

SEQ ID NO: 228 представляет собой определенную последовательность кДНК 19510.1, проявляющую гомологию с глюкозным транспортером для гликопротеида.

SEQ ID NO: 229 представляет собой определенную последовательность кДНК 19512.1, проявляющую гомологию с геном лизилгидроксилазы человека.

SEQ ID NO: 230 представляет собой определенную последовательность кДНК 19511.1, проявляющую гомологию с пальмитоил-протеинтиоэстеразой человека.

SEQ ID NO: 231 представляет собой определенную последовательность кДНК 19508.1, проявляющую гомологию с альфа-енолазой человека.

SEQ ID NO: 232 представляет собой определенную последовательность кДНК B807P (19509.1), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 233 представляет собой определенную последовательность кДНК B809P (19520.1), проявляющую гомологию с клоном 102D24 хромосомы 11ql3.31.

SEQ ID NO: 234 представляет собой определенную последовательность кДНК 19507.1, проявляющую гомологию с бета-субъединицей топросомы.

SEQ ID NO: 235 представляет собой определенную последовательность кДНК 19525.1, проявляющую гомологию с проурокиназным предшественником человека.

SEQ ID NO: 236 представляет собой определенную последовательность кДНК 19513.1, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 237 представляет собой определенную последовательность кДНК 19517.1, проявляющую гомологию с клоном 128M19 РАС человека.

SEQ ID NO: 238 представляет собой определенную последовательность кДНК 19564.1, проявляющую гомологию с цитохромом P450-IIB человека.

SEQ ID NO: 239 представляет собой определенную последовательность кДНК 19553.1, проявляющую гомологию с субъединицей pi рецептора GABA-A человека.

SEQ ID NO: 240 представляет собой определенную последовательность кДНК B811P (19575.1), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 241 представляет собой определенную последовательность кДНК B810P (19560.1), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 242 представляет собой определенную последовательность кДНК 19588.1, проявляющую гомологию с белком, подобным карбоксипептидазе аорты.

SEQ ID NO: 243 представляет собой определенную последовательность кДНК 19551.1, проявляющую гомологию с геном BCL-1 человека.

SEQ ID NO: 244 представляет собой определенную последовательность кДНК 19567.1, проявляющую гомологию со связанной с протеосомой мРНК человека.

SEQ ID NO: 245 представляет собой определенную последовательность кДНК B803P (19583.1), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 246 представляет собой определенную последовательность кДНК B812P (19587.1), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 247 представляет собой определенную последовательность кДНК B802P (19392.2), проявляющую гомологию с хромосомой 17 человека.

SEQ ID NO: 248 представляет собой определенную последовательность кДНК 19393.2, проявляющую гомологию с цепью В2 ницеина человека.

SEQ ID NO: 249 представляет собой определенную последовательность кДНК 19398.2, мРНК класса II DQ альфа МНС человека.

SEQ ID NO: 250 представляет собой определенную последовательность кДНК B804P (19399.2), проявляющую гомологию с GSHB-184P14 ВАС Хр22 человека.

SEQ ID NO: 251 представляет собой определенную последовательность кДНК 19401.2, проявляющую гомологию с геном киназы-b ikB человека.

SEQ ID NO: 252 представляет собой определенную последовательность кДНК 20266, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 253 представляет собой определенную последовательность кДНК B826P (20270), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 254 представляет собой определенную последовательность кДНК 20274, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 255 представляет собой определенную последовательность кДНК 20276, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 256 представляет собой определенную последовательность кДНК 20277, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 257 представляет собой определенную последовательность кДНК B823P (20280), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 258 представляет собой определенную последовательность кДНК B821P (20281), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 259 представляет собой определенную последовательность кДНК B824P (20294), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 260 представляет собой определенную последовательность кДНК 20303, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 261 представляет собой определенную последовательность кДНК B820P (20310), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.SEQ ID NO: 262 представляет собой определенную последовательность кДНК B825P (20336), не проявляющей значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 263 представляет собой определенную последовательность кДНК B827P (20341), не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 264 представляет собой определенную последовательность кДНК 20941, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 265 представляет собой определенную последовательность кДНК 20954, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 266 представляет собой определенную последовательность кДНК 20961, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 267 представляет собой определенную последовательность кДНК 20965, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 268 представляет собой определенную последовательность кДНК 20975, не проявляющую значимой гомологии с каким-либо известным геном.

SEQ ID NO: 269 представляет собой определенную последовательность кДНК 20261, проявляющую гомологию с катенином р120 человека.

SEQ ID NO: 270 представляет собой определенную последовательность кДНК B822P (20262), проявляющим гомологию с мембранным гликопротеидом 4F2 человека.

SEQ ID NO: 271 представляет собой определенную последовательность кДНК 20265, проявляющим гомологию с Na,K-АТФазой альфа 1 человека.

SEQ ID NO: 272 представляет собой определенную последовательность кДНК 20267, проявляющую гомологию с HS 90 сердца человека, неполная кодирующая последовательность.

SEQ ID NO: 273 представляет собой определенную последовательность кДНК 20268, проявляющую гомологию с мРНК GPI-заякоренного белка р137 человека.

SEQ ID NO: 274 представляет собой определенную последовательность кДНК 20271, проявляющую гомологию с субъединицей с М.м. 77 кД фактора человека, стимулирующего расщепление.

SEQ ID NO: 275 представляет собой определенную последовательность кДНК 20272, проявляющую гомологию с p190-B человека.

SEQ ID NO: 276 представляет собой определенную последовательность кДНК 20273, проявляющую гомологию с рибофорином человека.

SEQ ID NO: 277 представляет собой определенную последовательность кДНК 20278, проявляющую гомологию с орнитинаминотрансферазой человека.

SEQ ID NO: 278 представляет собой определенную последовательность кДНК 20279, проявляющую гомологию с S-аденозилметионинсинтетазой человека.

SEQ ID NO: 279 представляет собой определенную последовательность кДНК 20293, проявляющую гомологию с транскриптом Х-инактивации человека.

SEQ ID NO: 280 представляет собой определенную последовательность кДНК 20300, проявляющую гомологию с цитохромом p450 человека.

SEQ ID NO: 281 представляет собой определенную последовательность кДНК 20305, проявляющую гомологию с фактором элонгации 1 альфа человека.

SEQ ID NO: 282 представляет собой определенную последовательность кДНК 20306, проявляющую гомологию с эпителиальным белком ets человека.

SEQ ID NO: 283 представляет собой определенную последовательность кДНК 20307, проявляющую гомологию с мРНК трансдуктора сигнала человека.

SEQ ID NO: 284 представляет собой определенную последовательность кДНК 20313, проявляющую гомологию с мРНК субъединицы pi рецептора GABA-A человека.

SEQ ID NO: 285 представляет собой определенную последовательность кДНК 20317, проявляющую гомологию с тирозинфосфатазой человека.

SEQ ID NO: 286 представляет собой определенную последовательность кДНК 20318, проявляющую гомологию с протеиназой катепсина В человека.

SEQ ID NO: 287 представляет собой определенную последовательность кДНК 20320, проявляющую гомологию с 2-фосфопируватгидратазой-альфа-енолазой человека.

SEQ ID NO: 288 представляет собой определенную последовательность кДНК 20321, проявляющую гомологию с Е-кадхерином человека.

SEQ ID NO: 289 представляет собой определенную последовательность кДНК 20322, проявляющую гомологию с hsp86 человека.

SEQ ID NO: 290 представляет собой определенную последовательность кДНК B828P (20326), проявляющую гомологию с транскриптом Х-инактивации человека.

SEQ ID NO: 291 представляет собой определенную последовательность кДНК 20333, проявляющую гомологию с регулятором хроматина человека SMARCA5.

SEQ ID NO: 292 представляет собой определенную последовательность кДНК 20335, проявляющую гомологию с белком 1 активатором сфинголипидов человека.

SEQ ID NO: 293 представляет собой определенную последовательность кДНК 20337, проявляющим гомологию с ингибитором типа 2 активатора фактора роста гепатоцитов человека.

SEQ ID NO: 294 представляет собой определенную последовательность кДНК 20338, проявляющую гомологию с молекулой клеточной адгезии CD44 человека.

SEQ ID NO: 295 представляет собой определенную последовательность кДНК 20340, проявляющую гомологию с ядерным фактором 1 человека, подобным фактору эритроидного происхождения.

SEQ ID NO: 296 представляет собой определенную последовательность кДНК 20938, проявляющим гомологию с мРНК винкулина человека.

SEQ ID NO: 297 представляет собой определенную последовательность кДНК 20939, проявляющим гомологию с фактором элонгации EF-1-альфа человека.

SEQ ID NO: 298 представляет собой определенную последовательность кДНК 20940, проявляющую гомологию с геном нестина человека.

SEQ ID NO: 299 представляет собой определенную последовательность кДНК 20942, проявляющую гомологию с панкреатической рибонуклеазой человека.

SEQ ID NO: 300 представляет собой определенную последовательность кДНК 20943, проявляющую гомологию с транскобаламином I человека.

SEQ ID NO: 301 представляет собой определенную последовательность кДНК 20944, проявляющую гомологию с бета-тубулином человека.

SEQ ID NO: 302 представляет собой определенную последовательность кДНК 20946, проявляющую гомологию с белком HS1 человека.

SEQ ID NO: 303 представляет собой определенную последовательность кДНК 20947, проявляющую гомологию с катепсином В человека.

SEQ ID NO: 304 представляет собой определенную последовательность кДНК 20948, проявляющую гомологию с транскриптом усиленного тестикулярного гена человека.

SEQ ID NO: 305 представляет собой определенную последовательность кДНК 20949, проявляющую гомологию с фактором элонгации EF-1-альфа человека.

SEQ ID NO: 306 представляет собой определенную последовательность кДНК 20950, проявляющую гомологию с фактором 3 АДФ-рибозилирования человека.

SEQ ID NO: 307 представляет собой определенную последовательность кДНК 20951, проявляющую гомологию с IFP53 или WRS человека для триптофанил-тРНК-синтетазы.

SEQ ID NO: 308 представляет собой определенную последовательность кДНК 20952, проявляющую гомологию с зависимой от циклина протеинкиназой человека.

SEQ ID NO: 309 представляет собой определенную последовательность кДНК 20957, проявляющую гомологию с изоформой 1 альфа-тубулина человека.

SEQ ID NO: 310 представляет собой определенную последовательность кДНК 20959, проявляющую гомологию с делецией длиной 61 п.н. тирозинфосфатазы человека.

SEQ ID NO: 311 представляет собой определенную последовательность кДНК 20966, проявляющую гомологию с тирозинфосфатазой человека.

SEQ ID NO: 312 представляет собой определенную последовательность кДНК B830P (20976), проявляющую гомологию с ядерным фактором NF 45 человека.SEQ ID NO: 313 представляет собой определенную последовательность кДНК B829P (20977), проявляющую гомологию с десатуразой жирных кислот дельта-6 человека.

SEQ ID NO: 314 представляет собой определенную последовательность кДНК 20978, проявляющую гомологию с ядерной аконитазой человека.

SEQ ID NO: 315 является определенной последовательностью кДНК клона 23176.

SEQ ID NO: 316 является определенной последовательностью кДНК клона 23140.

SEQ ID NO: 317 является определенной последовательностью кДНК клона 23166.

SEQ ID NO: 318 является определенной последовательностью кДНК клона 23167.

SEQ ID NO: 319 является определенной последовательностью кДНК клона 23177.

SEQ ID NO: 320 является определенной последовательностью кДНК клона 23217.

SEQ ID NO: 321 является определенной последовательностью кДНК клона 23169.

SEQ ID NO: 322 является определенной последовательностью кДНК клона 23160.

SEQ ID NO: 323 является определенной последовательностью кДНК клона 23182.

SEQ ID NO: 324 является определенной последовательностью кДНК клона 23232.

SEQ ID NO: 325 является определенной последовательностью кДНК клона 23203.

SEQ ID NO: 326 является определенной последовательностью кДНК клона 23198.

SEQ ID NO: 327 является определенной последовательностью кДНК клона 23224.

SEQ ID NO: 328 является определенной последовательностью кДНК клона 23142.

SEQ ID NO: 329 является определенной последовательностью кДНК клона 23138.

SEQ ID NO: 330 является определенной последовательностью кДНК клона 23147.

SEQ ID NO: 331 является определенной последовательностью кДНК клона 23148.

SEQ ID NO: 332 является определенной последовательностью кДНК клона 23149.

SEQ ID NO: 333 является определенной последовательностью кДНК клона 23172.

SEQ ID NO: 334 является определенной последовательностью кДНК клона 23158.

SEQ ID NO: 335 является определенной последовательностью кДНК клона 23156.

SEQ ID NO: 336 является определенной последовательностью кДНК клона 23221.

SEQ ID NO: 337 является определенной последовательностью кДНК клона 23223.

SEQ ID NO: 338 является определенной последовательностью кДНК клона 23155.

SEQ ID NO: 339 является определенной последовательностью кДНК клона 23225.

SEQ ID NO: 340 является определенной последовательностью кДНК клона 23226.

SEQ ID NO: 341 является определенной последовательностью кДНК клона 23228.

SEQ ID NO: 342 является определенной последовательностью кДНК клона 23229.

SEQ ID NO: 343 является определенной последовательностью кДНК клона 23231.

SEQ ID NO: 344 является определенной последовательностью кДНК клона 23154.

SEQ ID NO: 345 является определенной последовательностью кДНК клона 23157.

SEQ ID NO: 346 является определенной последовательностью кДНК клона 23153.

SEQ ID NO: 347 является определенной последовательностью кДНК клона 23159.

SEQ ID NO: 348 является определенной последовательностью кДНК клона 23152.

SEQ ID NO: 349 является определенной последовательностью кДНК клона 23161.

SEQ ID NO: 350 является определенной последовательностью кДНК клона 23162.

SEQ ID NO: 351 является определенной последовательностью кДНК клона 23163.

SEQ ID NO: 352 является определенной последовательностью кДНК клона 23164.

SEQ ID NO: 353 является определенной последовательностью кДНК клона 23165.

SEQ ID NO: 354 является определенной последовательностью кДНК клона 23151.

SEQ ID NO: 355 является определенной последовательностью кДНК клона 23150.

SEQ ID NO: 356 является определенной последовательностью кДНК клона 23168.

SEQ ID NO: 357 является определенной последовательностью кДНК клона 23146.

SEQ ID NO: 358 является определенной последовательностью кДНК клона 23170.

SEQ ID NO: 359 является определенной последовательностью кДНК клона 23171.

SEQ ID NO: 360 является определенной последовательностью кДНК клона 23145.

SEQ ID NO: 361 является определенной последовательностью кДНК клона 23174.

SEQ ID NO: 362 является определенной последовательностью кДНК клона 23175.

SEQ ID NO: 363 является определенной последовательностью кДНК клона 23144.

SEQ ID NO: 364 является определенной последовательностью кДНК клона 23178.

SEQ ID NO: 365 является определенной последовательностью кДНК клона 23179.

SEQ ID NO: 366 является определенной последовательностью кДНК клона 23180.

SEQ ID NO: 367 является определенной последовательностью кДНК клона 23181.

SEQ ID NO: 368 является определенной последовательностью кДНК клона 23143.

SEQ ID NO: 369 является определенной последовательностью кДНК клона 23183.

SEQ ID NO: 370 является определенной последовательностью кДНК клона 23184.

SEQ ID NO: 371 является определенной последовательностью кДНК клона 23185.

SEQ ID NO: 372 является определенной последовательностью кДНК клона 23186.

SEQ ID NO: 373 является определенной последовательностью кДНК клона 23187.

SEQ ID NO: 374 является определенной последовательностью кДНК клона 23190.

SEQ ID NO: 375 является определенной последовательностью кДНК клона 23189.

SEQ ID NO: 376 является определенной последовательностью кДНК клона 23202.

SEQ ID NO: 378 является определенной последовательностью кДНК клона 23191.

SEQ ID NO: 379 является определенной последовательностью кДНК клона 23188.

SEQ ID NO: 380 является определенной последовательностью кДНК клона 23194.

SEQ ID NO: 381 является определенной последовательностью кДНК клона 23196.

SEQ ID NO: 382 является определенной последовательностью кДНК клона 23195.

SEQ ID NO: 383 является определенной последовательностью кДНК клона 23193.

SEQ ID NO: 384 является определенной последовательностью кДНК клона 23199.

SEQ ID NO: 385 является определенной последовательностью кДНК клона 23200.

SEQ ID NO: 386 является определенной последовательностью кДНК клона 23192.

SEQ ID NO: 387 является определенной последовательностью кДНК клона 23201.

SEQ ID NO: 388 является определенной последовательностью кДНК клона 23141.

SEQ ID NO: 389 является определенной последовательностью кДНК клона 23139.

SEQ ID NO: 390 является определенной последовательностью кДНК клона 23204.

SEQ ID NO: 391 является определенной последовательностью кДНК клона 23205.

SEQ ID NO: 392 является определенной последовательностью кДНК клона 23206.

SEQ ID NO: 393 является определенной последовательностью кДНК клона 23207.

SEQ ID NO: 394 является определенной последовательностью кДНК клона 23208.

SEQ ID NO: 395 является определенной последовательностью кДНК клона 23209.

SEQ ID NO: 396 является определенной последовательностью кДНК клона 23210.

SEQ ID NO: 397 является определенной последовательностью кДНК клона 23211.

SEQ ID NO: 398 является определенной последовательностью кДНК клона 23212.

SEQ ID NO: 399 является определенной последовательностью кДНК клона 23214.

SEQ ID NO: 400 является определенной последовательностью кДНК клона 23215.

SEQ ID NO: 401 является определенной последовательностью кДНК клона 23216.

SEQ ID NO: 402 является определенной последовательностью кДНК клона 23137.

SEQ ID NO: 403 является определенной последовательностью кДНК клона 23218.

SEQ ID NO: 404 является определенной последовательностью кДНК клона 23220.

SEQ ID NO: 405 является определенной последовательностью кДНК клона 19462.

SEQ ID NO: 406 является определенной последовательностью кДНК клона 19430.

SEQ ID NO: 407 является определенной последовательностью кДНК клона 19407.

SEQ ID NO: 408 является определенной последовательностью кДНК клона 19448.

SEQ ID NO: 409 является определенной последовательностью кДНК клона 19447.

SEQ ID NO: 410 является определенной последовательностью кДНК клона 19426.

SEQ ID NO: 411 является определенной последовательностью кДНК клона 19441.

SEQ ID NO: 412 является определенной последовательностью кДНК клона 19454.

SEQ ID NO: 413 является определенной последовательностью кДНК клона 19463.

SEQ ID NO: 414 является определенной последовательностью кДНК клона 19419.

SEQ ID NO: 415 является определенной последовательностью кДНК клона 19434.

SEQ ID NO: 416 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В820Р.

SEQ ID NO: 417 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В821Р.

SEQ ID NO: 418 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В822Р.

SEQ ID NO: 419 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В823Р.

SEQ ID NO: 420 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В824Р.

SEQ ID NO: 421 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В825Р.

SEQ ID NO: 422 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В826Р.

SEQ ID NO: 423 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В827Р.

SEQ ID NO: 424 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В828Р.

SEQ ID NO: 425 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В829Р.

SEQ ID NO: 426 является определенной удлиненной последовательностью кДНК В830Р.

SEQ ID NO: 427 является определенной последовательностью кДНК клона 266В4.

SEQ ID NO: 428 является определенной последовательностью кДНК клона 22892.

SEQ ID NO: 429 является определенной последовательностью кДНК клона 266G3.

SEQ ID NO: 430 является определенной последовательностью кДНК клона 22890.

SEQ ID NO: 431 является определенной последовательностью кДНК клона 264В4.

SEQ ID NO: 432 является определенной последовательностью кДНК клона 22883.

SEQ ID NO: 433 является определенной последовательностью кДНК клона 22882.

SEQ ID NO: 434 является определенной последовательностью кДНК клона 22880.

SEQ ID NO: 435 является определенной последовательностью кДНК клона 263G1.

SEQ ID NO: 436 является определенной последовательностью кДНК клона 263G6.

SEQ ID NO: 437 является определенной последовательностью кДНК клона 262B2.

SEQ ID NO: 438 является определенной последовательностью кДНК клона 262B6.

SEQ ID NO: 439 является определенной последовательностью кДНК клона 22869.

SEQ ID NO: 440 является определенной последовательностью кДНК клона 21374.

SEQ ID NO: 441 является определенной последовательностью кДНК клона 21362.

SEQ ID NO: 442 является определенной последовательностью кДНК клона 21349.

SEQ ID NO: 443 является определенной последовательностью кДНК клона 21309.

SEQ ID NO: 444 является определенной последовательностью кДНК клона 21097.

SEQ ID NO: 445 является определенной последовательностью кДНК клона 21096.

SEQ ID NO: 446 является определенной последовательностью кДНК клона 21094.

SEQ ID NO: 447 является определенной последовательностью кДНК клона 21093.

SEQ ID NO: 448 является определенной последовательностью кДНК клона 21091.

SEQ ID NO: 449 является определенной последовательностью кДНК клона 21089.

SEQ ID NO: 450 является определенной последовательностью кДНК клона 21087.

SEQ ID NO: 451 является определенной последовательностью кДНК клона 21085.

SEQ ID NO: 452 является определенной последовательностью кДНК клона 21084.

SEQ ID NO: 453 является первой неполной последовательностью кДНК клона 2ВТ1-40.

SEQ ID NO: 454 является второй неполной последовательностью кДНК клона 2ВТ1-40.

SEQ ID NO: 455 является определенной последовательностью кДНК клона 21063.

SEQ ID NO: 456 является определенной последовательностью кДНК клона 21062.

SEQ ID NO: 457 является определенной последовательностью кДНК клона 21060.

SEQ ID NO: 458 является определенной последовательностью кДНК клона 21053.

SEQ ID NO: 459 является определенной последовательностью кДНК клона 21050.

SEQ ID NO: 460 является определенной последовательностью кДНК клона 21036.

SEQ ID NO: 461 является определенной последовательностью кДНК клона 21037.

SEQ ID NO: 462 является определенной последовательностью кДНК клона 21048.

SEQ ID NO: 463 является консенсусной последовательностью ДНК В726Р (обозначаемой B726P-spliced_seq_B726P).

SEQ ID NO: 464 является определенной последовательностью кДНК второй сплайсированной формы B726P (обозначаемой 27490.seq_B726P).

SEQ ID NO: 465 является определенной последовательностью кДНК третьей сплайсированной формы B726P (обозначаемой 27068.seq_B726P).

SEQ ID NO: 466 является определенной последовательностью кДНК второй сплайсированной формы B726P (обозначаемой 23113.seq_B726P).

SEQ ID NO: 467 является определенной последовательностью кДНК второй сплайсированной формы B726P (обозначаемой 23103.seq_B726P).

SEQ ID NO: 468 является определенной последовательностью кДНК второй сплайсированной формы B726P (обозначаемой 19310.seq_B726P).

SEQ ID NO: 469 является рассчитанной последовательностью аминокислот, кодируемой «левой» ORF SEQ ID NO: 463.

SEQ ID NO: 470 является рассчитанной последовательностью аминокислот, кодируемой SEQ ID NO: 464.

SEQ ID NO: 471 является рассчитанной последовательностью аминокислот, кодируемой SEQ ID NO: 465.

SEQ ID NO: 472 является рассчитанной последовательностью аминокислот, кодируемой SEQ ID NO: 466.

SEQ ID NO: 473 является рассчитанной последовательностью аминокислот, кодируемой SEQ ID NO: 467.

SEQ ID NO: 474 является определенной последовательностью кДНК альтернативно сплайсированной формы B726P.

SEQ ID NO: 475 является аминокислотной последовательностью, кодируемой SEQ ID NO: 474.

SEQ ID NO: 476 является изолированной последовательностью кДНК B720P.

SEQ ID NO: 477 является последовательностью кДНК известного гена кератина.

SEQ ID NO: 478 является аминокислотной последовательностью, кодируемой SEQ ID NO: 477.

SEQ ID NO: 479 является определенной последовательностью кДНК клона 19465.

SEQ ID NO: 480 и 481 представляют собой праймеры ПЦР.

SEQ ID NO: 482 является последовательностью кДНК экспрессируемой «правой» ORF B726P.

SEQ ID NO: 483 является аминокислотной последовательностью экспрессируемой рекомбинантной «правой» ORF B726P.

SEQ ID NO: 484 является определенной последовательностью кДНК полной длины для B720P.

SEQ ID NO: 485 является аминокислотной последовательностью, кодируемой SEQ ID NO: 484.

SEQ ID NO: 486 является определенной последовательностью кДНК укороченной формы B720P, обозначаемой B720P-tr.

SEQ ID NO: 487 является аминокислотной последовательностью B720P-tr.

SEQ ID NO: 488 является аминокислотной последовательностью естественным образом процессированного эпитопа B726P, узнаваемого B726P-специфичными CTL.

SEQ ID NO: 489 является последовательностью ДНК, кодирующей эпитоп B726P, указанный в SEQ ID NO: 488.

SEQ ID NO: 490 является последовательностью ДНК, кодирующей гибридный белок, в котором маммаглобин слит с объединенной открытой рамкой считывания (ORF) B726P из «левой» и «правой» ORF, (аминокислотная последовательность объединенной ORF B726P представлена здесь в SEQ ID NO: 475, которая кодируется последовательностью ДНК SEQ ID NO: 474).

SEQ ID NO: 491 является последовательностью ДНК, кодирующей гибридный белок, в котором маммаглобин слит с «левой» ORF B726P, (аминокислотная последовательность «левой» ORF B726P, представлена здесь в SEQ ID NO: 469, которая кодируется последовательностью ДНК SEQ ID NO: 463).

SEQ ID NO: 492 является последовательностью ДНК, кодирующей гибридный белок, в котором маммаглобин слит с «правой» ORF B726P, (аминокислотная последовательность «правой» ORF B726P, представлена здесь в SEQ ID NO: 176, которая кодируется последовательностью ДНК SEQ ID NO: 175).

SEQ ID NO: 493 является аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью ДНК SEQ ID NO: 490.

SEQ ID NO: 494 является аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью ДНК SEQ ID NO: 491.

SEQ ID NO: 495 является аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью ДНК SEQ ID NO: 492.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Как указано выше, в общем, направлением данного изобретения являются композиции и способы применения композиций, например, в терапии и диагностике злокачественной опухоли, такой как рак молочной железы. Некоторые описанные здесь иллюстративные композиции включают полипептиды опухоли молочной железы, полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды, связывающие агенты, такие как антитела, антиген-презентирующие клетки (АПК) и/или клетки иммунной системы (например, Т-клетки). Используемый здесь термин «белок опухоли молочной железы», в общем, относится к белку, который экспрессируется клетками опухоли молочной железы на уровне, который, по меньшей мере, в два раза, и предпочтительно, по меньшей мере, в пять раз превышает уровень экспрессии в нормальной ткани, который определяют с использованием представленного здесь типичного анализа. Некоторые белки опухоли молочной железы являются опухолевыми белками, которые реагируют с антисывороткой пациента, пораженного раком молочной железы, так, что это регистрируется (в иммуноанализе, таком как ELISA или Вестерн-блот).

Следовательно, в соответствии со сказанным выше и как описано далее, в данном изобретении представлены иллюстративные полинуклеотидные композиции, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 и 489, иллюстративные полипептидные композиции, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 176, 179, 181, 469-473, 475, 485, 487 и 488, композиции антител, способных связываться с такими полипептидами, и многочисленные дополнительные варианты применения таких композиций, например, при выявлении, диагностике и/или терапии рака молочной железы у человека.

ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫЕ КОМПОЗИЦИИ.

В используемом здесь смысле термины «сегмент ДНК» или «полинуклеотид» относятся к молекуле ДНК, которая была выделена из суммарной геномной ДНК конкретного вида. Следовательно, участок ДНК, кодирующий полипептид, относится к сегменту ДНК, который содержит одну или несколько кодирующих последовательностей, кроме того, в значительной степени изолированный или очищенный от суммарной геномной ДНК вида, из которого получают сегмент ДНК. Термины «сегмент ДНК» или «полинуклеотид» включают в себя сегменты ДНК и более мелкие фрагменты таких сегментов, а также рекомбинантные векторы, включая, например, плазмиды, космиды, фагмиды, фаги, вирусы и тому подобное.

Как будет понятно специалистам в данной области, сегменты ДНК согласно данному изобретению могут содержать геномные последовательности, внегеномные и кодируемые плазмидами последовательности и более мелкие сконструированные сегменты генов, которые экспрессируют, или могут быть адаптированы для экспрессии белков, полипептидов, пептидов и тому подобного. Такие сегменты могут быть выделены в естественном виде или могут быть искусственно модифицированы синтетическим способом.

«Изолированный» в используемом здесь смысле означает, что полинуклеотид в значительной степени освобожден от других кодирующих последовательностей и что сегмент ДНК не содержит больших частей не родственной кодирующей ДНК, таких как крупные хромосомные фрагменты или другие функциональные гены или районы, кодирующие полипептиды. Конечно, это имеет отношение к сегменту ДНК, который выделен изначально, и не исключает гены или кодирующие районы, искусственно добавленные к сегменту позднее.

Как будет понятно специалистам в данной области, полинуклеотиды могут быть однонитевыми (кодирующими или антисмысловыми) или двунитевыми и могут представлять собой молекулы ДНК (геномную, кДНК или синтетическую) или РНК. Молекулы РНК включают молекулы гяРНК, которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК один к одному, и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. В полинуклеотиде согласно изобретению могут, но не обязательно, присутствовать дополнительные кодирующие или не кодирующие последовательности, и полинуклеотид может, но не обязательно, быть связанным с другими молекулами и/или материалами-носителями.

Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует белок опухоли молочной железы или его часть) или могут содержать вариант или биологический или антигенный функциональный эквивалент такой последовательности. Варианты полинуклеотида могут содержать одну или несколько замен, присоединений, делеций и/или инсерций, которые описаны далее, предпочтительно таких, чтобы иммуногенность кодируемого полипептида относительно нативного белка опухоли не снижалась. Влияние на иммуногенность кодируемого полипептида обычно можно оценить как здесь описано. Термин «варианты» также охватывает гомологичные гены ксеногенной природы. При сравнении полинуклеотидных или полипептидных последовательностей говорят, что две последовательности являются «идентичными», если последовательность нуклеотидов или аминокислот в двух последовательностях является одной и той же при выравнивании в отношении максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями обычно выполняют посредством сравнения последовательностей на протяжении окна сравнения, чтобы идентифицировать и сравнить локальные районы сходства последовательностей. «Окно сравнения» в используемом здесь смысле относится к сегменту длиной, по меньшей мере, примерно 20 непрерывно следующих друг за другом положений, обычно от 30 до примерно 75, от 40 до примерно 50, на котором последовательность можно сравнить с эталонной последовательностью такого же количества непрерывно следующих друг за другом положений после того, как две последовательности оптимально выровнены.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно провести с использованием программы Megalign в наборе компьютерных программ по биоинформатике Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), используя параметры по умолчанию. Указанная программа включает в себя несколько схем выравнивания, описанных в следующих источниках: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5: 151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4: 11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11: 105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy – the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80: 726-730.

Альтернативно оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно провести посредством алгоритма локальной идентичности Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482, посредством алгоритма выравнивания по идентичности Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, методами поиска сходства Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, компьютеризованной реализацией указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA в пакете компьютерных программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) или при просмотре.

Одним предпочтительным примером алгоритмов, которые подходят для определения идентичности последовательностей и сходства последовательностей в процентах, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 и Altschul et al. (1990) J Mol. Biol. 215: 403-410, соответственно. BLAST и BLAST 2.0 можно, например, использовать с описанными здесь параметрами, чтобы определить процентную идентичность последовательностей полинуклеотидов и полипептидов согласно изобретению. Компьютерная программа для выполнения BLAST-анализов находится в открытом доступе через National Center for Biotechnology Information. В одном иллюстративном примере суммарное количество очков можно подсчитать, используя для нуклеотидных последовательностей параметры М (очки вознаграждения за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафные очки за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей можно использовать матрицу подсчета очков, чтобы подсчитать суммарное количество очков. Продолжение поиска совпадений слов в каждом направлении прекращают в том случае, когда: суммарное количество очков выравнивая уменьшается на количество Х по сравнению с его достигнутым максимальным значением; суммарное количество очков опускается до нуля или ниже, вследствие накопления одного или нескольких отрицательно оцениваемых выравниваний остатков; или достигается конец какой-либо последовательности. Параметры W, T и Х алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLAST (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию используется длина слов (W), равная 11, и ожидание (Е) – 10, и выравнивания по матрице подсчета очков BLOSUM62 (смотри Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915), (B) – 50, ожидание (E) – 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих нитей.

Предпочтительно «процент идентичности последовательностей» определяют при сравнении двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении окна сравнения, по меньшей мере, из 20 положений, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пробелы), составляющие 20 процентов или меньше, обычно от 5 до 15 процентов, или от 10 до 12 процентов, по сравнению с эталонными последовательностями (которые не содержат добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых в обеих последовательностях присутствуют идентичные основания нуклеиновых кислот или остатки аминокислот, чтобы получить количество совпадающих положений, делением количества совпадающих положений на общее количество положений в эталонной последовательности (т.е. на размер окна) и умножением результатов на 100, чтобы получить процент идентичности последовательностей.

Таким образом, данное изобретение включает в себя полинуклеотидные или полипептидные последовательности, обладающие значительной идентичностью с описанными здесь последовательностями, например, последовательности, обладающие, по меньшей мере, 50% идентичностью последовательностей, предпочтительно, по меньшей мере, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или более высокой идентичностью последовательностей при сравнении с полинуклеотидной или полипептидной последовательностью согласно данному изобретению посредством описанных здесь способов (например, BLAST-анализ с использованием стандартных параметров, как описано далее). Специалист в данной области поймет, что указанные значения можно соответствующим образом регулировать, чтобы определить соответствующую идентичность белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, принимая во внимание вырожденность кодонов, сходство аминокислот, расположение рамки считывания и тому подобное.

В дополнительных вариантах данное изобретение относится к изолированным полинуклеотидам и полипептидам, содержащим различные по длине непрерывные участки последовательности, идентичной или комплементарной одной или нескольким описанным здесь последовательностям. Например, в данном изобретении представлены полинуклеотиды, которые содержат, по меньшей мере, примерно 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 или 1000 или больше непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов одной или нескольких описанных здесь последовательностей, а также все промежуточные длины между ними. Легко будет понять, что «промежуточные длины» в данном контексте означают любую длину между указанными значениями, такую как 16, 17, 18, 19, и т.д.; 21, 22, 23, и т.д.; 30, 31, 32, и т.д.; 50, 51, 52, 53, и т.д.; 100, 101, 102, 103, и т.д.; 150, 151, 152, 153, и т.д.; включая все целые числа между 200-500; 500-1000, и тому подобное.

Полинуклеотиды согласно данному изобретению или их фрагменты независимо от длины самой кодирующей последовательности, можно комбинировать с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты ферментов рестрикции, сайты множественного клонирования, другие кодирующие сегменты и тому подобное, так что их общая длина может значительно варьировать. Поэтому предполагается, что можно использовать фрагмент нуклеиновой кислоты почти любой длины, при этом общая длина предпочтительно ограничена простотой получения и применения в планируемом протоколе рекомбинантной ДНК. Например, предполагается, что иллюстративные сегменты ДНК общей длиной примерно 10000, примерно 5000, примерно 3000, примерно 2000, примерно 1000, примерно 500, примерно 200, примерно 100, примерно 50 пар оснований в длину, и тому подобные (включая все промежуточные длины) пригодны для многих практических воплощений данного изобретения.

В других вариантах направлением данного изобретения являются полинуклеотиды, которые в условиях умеренной жесткости способны гибридизоваться с представленной здесь полинуклеотидной последовательностью, или ее фрагментом, или комплементарной ей последовательностью. Способы гибридизации хорошо известны в области молекулярной биологии. В целях иллюстрации подходящие условия умеренной жесткости для проверки гибридизации полинуклеотида согласно изобретению с другими полинуклеотидами включают предварительную промывку в растворе 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (pH 8,0); гибридизацию при 50°C – 65°C, 5 X SSC, в течение ночи; после чего следует промывка при 65°C в течение 20 минут дважды каждым из растворов 2X, 0,5X и 0,2X SSC, содержащим 0,1% SDS.

Кроме того, специалистам в данной области будет понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют описанный здесь полипептид. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью какого-либо нативного гена. Несмотря на это, полинуклеотиды, которые варьируют в результате различий в использовании кодонов, специально предусмотрены данным изобретением. Кроме того, в рамки данного изобретения входят аллели генов, содержащих представленные здесь полинуклеотидные последовательности. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменены в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеции, присоединения и/или замены нуклеотидов. Получаемые в результате мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели можно идентифицировать, используя стандартные способы (такие как гибридизация, амплификация и/или сравнение с последовательностями в базе данных).

ЗОНДЫ И ПРАЙМЕРЫ.

В других вариантах данного изобретения представляемые здесь полинуклеотидные последовательности можно предпочтительно использовать в качестве зондов или праймеров для гибридизации нуклеиновых кислот. По существу предполагается, что сегменты нуклеиновых кислот, которые содержат район последовательности, представляющей собой непрерывную последовательность длиной, по меньшей мере, около 15 нуклеотидов, которая имеет ту же последовательность или является комплементарной заявленной здесь непрерывной последовательности длиной 15 нуклеотидов, найдут конкретное применение. Более длинные идентичные или комплементарные непрерывные последовательности, например, последовательности примерно из 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 (включая все промежуточные длины) и даже вплоть до полноразмерных последовательностей также будут пригодны в некоторых вариантах.

Способность таких зондов нуклеиновых кислот специфично гибридизоваться с последовательностью, которая представляет интерес, обеспечивает возможность их применения для выявления наличия комплементарных последовательностей в данном образце. Однако также предполагаются другие применения, такие как использование информации, записанной в последовательности, для получения праймеров мутантного вида, или праймеров для использования при получении других генетических конструкций.

Молекулы полинуклеотидов, имеющие районы последовательности, состоящие из участков нуклеотидных контигов примерно из 10-14, 15-20, 30, 50 или даже 100-200 нуклеотидов или около этого (также включая промежуточные длины), идентичных или комплементарных заявленной здесь полинуклеотидной последовательности, в частности, предполагаются в качестве гибридизационных зондов для применения, например, в Саузерн- и Нозерн-блоттинге. Это позволит анализировать продукт гена или его фрагмент как в разнообразных типах клеток, так и в различных бактериальных клетках. Общий размер фрагмента, а также размер комплементарного участка(ков) в конечном счете будет зависеть от предполагаемого использования или применения конкретного сегмента нуклеиновой кислоты. Фрагменты меньшего размера в основном найдут применение в вариантах гибридизации, при этом длину непрерывного комплементарного района можно варьировать, например, примерно между 15 и 100 нуклеотидами, но можно использовать более длинные непрерывные комплементарные участки, в соответствии с длиной комплементарных последовательностей, которые требуется обнаружить.

Применение зонда для гибридизации длиной около 15-25 нуклеотидов дает возможность для формирования молекулы дуплекса, которая является как стабильной, так и избирательной. Хотя, для того, чтобы увеличить стабильность и избирательность гибрида, и тем самым повысить качество и уровень полученных специфичных гибридных молекул, как правило, предпочтительны молекулы, имеющие непрерывные комплементарные последовательности на участках длиной более 15 оснований. В основном, предпочтительным будет конструирование молекул нуклеиновых кислот, имеющих комплементарные генам участки длиной от 15 до 25 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, или, при желании, даже более длинные.

Зонды для гибридизации можно выбрать из любой части любой из заявленных здесь последовательностей. Все что требуется, это проанализировать последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 и 489 или в любой непрерывной части последовательности, длиной примерно от 15-25 нуклеотидов вплоть до последовательности полной длины включительно, которая требуется для использования в качестве зонда или праймера. Выбор последовательностей зонда или праймера может быть обусловлен различными факторами. Например, желательным может быть использование праймеров от конца до конца общей последовательности.

Небольшие сегменты или фрагменты полинуклеотида легко можно получить, например, прямым синтезом фрагмента химическими способами, как обычно практикуется с использованием автоматизированного синтезатора олигонуклеотидов. Также фрагменты можно получить, применяя технологию репродукции нуклеиновых кислот, такую как технология ПЦР (PCR^TM), изложенная в патенте США 4683202 (включенном здесь в виде ссылки), посредством введения выбранных последовательностей в рекомбинантные векторы для продукции рекомбинантов, или посредством других технологий рекомбинантной ДНК, как правило, известных специалистам в области молекулярной биологии.

Нуклеотидные последовательности согласно данному изобретению можно использовать вследствие их способности избирательно формировать дуплексные молекулы с комплементарными участками полного гена или фрагментов гена, представляющего интерес. В зависимости от предполагаемого применения, как правило, потребуется использование различных условий гибридизации для того, чтобы достичь различной степени избирательности зонда по отношению к последовательности-мишени. В случае применений, требующих высокой избирательности, как правило, желательным будет использование относительно жестких условий для формирования гибридов, например, будут выбраны условия при относительно низкой концентрации соли и/или высокой температуре, такие как условия, которые обеспечивает концентрация соли примерно от 0,02 М до 0,15 М соли при температурах примерно от 50^°С до примерно 70^°С. Такие избирательные условия допускают небольшое, если вообще допускают, ошибочное спаривание оснований между зондом и матрицей или нитью мишени, и могут быть особенно пригодны для выделения родственных последовательностей.

Конечно, для некоторых применений, например, когда желательно получить мутанты, используя нить мутантного праймера, гибридизующуюся с основной матрицей, как правило, необходимы менее жесткие (пониженной жесткости) условия гибридизации для того, чтобы обеспечить возможность для образования гетеродуплекса. При таких обстоятельствах желательным может быть использование условий при такой концентрации соли, как примерно от 0,15 М до примерно 0,9 М соли, при температурах в пределах примерно от 20^°С до примерно 55^°С. При этом перекрестно-гибридизующиеся варианты легко можно определить в виде позитивных сигналов гибридизации относительно гибридизации в контроле. Во всяком случае, обычно принимается во внимание, что условия можно сделать более жесткими добавлением возрастающих количеств формамида, который служит для того, чтобы дестабилизировать гибридный дуплекс таким же образом, как и повышенная температура. Таким образом, условиями гибридизации легко можно манипулировать, и соответственно, как правило, имеется способ выбора в зависимости от желаемых результатов.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ.

Полинуклеотиды можно идентифицировать, получить и/или подвергнуть манипуляциям с использованием любого из множества хорошо разработанных способов. Например, полинуклеотид можно идентифицировать, как описано более подробно ниже, посредством скрининга микроматрицы кДНК в отношении экспрессии, связанной с опухолью (например, экспрессии, которая, по меньшей мере, в два раза выше в опухоли, чем в нормальной ткани на основе определения с использованием предоставленного в данной работе типичного анализа). Такие скрининговые анализы можно, например, осуществлять с использованием микроматрицы Synteni (Palo Alto, CA) согласно инструкциям производителя (и по существу как описано Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, 1996 и Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997). Альтернативно полинуклеотиды можно амплифицировать с кДНК, полученной из клеток, экспрессирующих описанные здесь белки, таких как клетки опухоли молочной железы. Такие полинуклеотиды можно амплифицировать посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для такого подхода специфичные для последовательности праймеры могут быть сконструированы на основе представленных здесь последовательностей, и могут быть приобретены или синтезированы.

Амплифицированную часть полинуклеотида согласно данному изобретению можно использовать для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотеки кДНК опухоли молочной железы) с использованием хорошо известных способов. В таких способах проводят скрининг библиотеки (кДНК или геномной) с использованием одного или нескольких полинуклеотидных зондов или праймеров, подходящих для амплификации. Предпочтительно проводят отбор по размеру, чтобы библиотека включала в себя более крупные молекулы. Также предпочтительными могут быть библиотеки, полученные с помощью случайного праймера, для того, чтобы идентифицировать 5′-районы и «левые» районы генов. Геномные библиотеки предпочтительны для получения интронов и удлиняющих 5′-последовательностей.

Для способа гибридизации неполную последовательность можно метить (например, ник-трансляцией, или мечением концов ³²P), используя хорошо известные способы. Затем, как правило, проводят скрининг библиотеки в бактериях или бактериофагах посредством гибридизации фильтров, содержащих денатурированные бактериальные колонии (или газоны, содержащие фаговые бляшки), с меченым зондом (смотри, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Гибридизующиеся колонии или бляшки отбирают и наращивают, и ДНК выделяют для дальнейшего анализа. Клоны кДНК можно анализировать, чтобы определить количество дополнительной последовательности, например, посредством ПЦР, используя праймер из неполной последовательности и праймер вектора. Можно создать карты рестрикции и неполные последовательности, чтобы идентифицировать один или несколько перекрывающихся клонов. Затем можно определить полную последовательность, используя стандартные способы, которые могут включать в себя создание серии делеционных клонов. Затем полученные в результате перекрывающиеся последовательности можно собрать в одну непрерывную последовательность. Молекулу кДНК полной длины можно создать лигированием подходящих фрагментов, используя хорошо известные способы.

Альтернативно существуют многочисленные способы амплификации для получения полноразмерной кодирующей последовательности из неполной последовательности кДНК. В таких способах амплификацию обычно выполняют посредством ПЦР. Для выполнения стадии амплификации можно использовать любой из множества коммерчески доступных наборов. Праймеры можно конструировать с использованием, например, компьютерной программы, хорошо известной в данной области. Праймеры предпочтительно имеют длину в 22-30 нуклеотидов, имеют содержание GC, по меньшей мере, 50%, и гибридизуются с последовательностью мишени при температурах примерно от 68^°С до 72^°С. Амплифицированный район можно секвенировать, как описано выше, и перекрывающиеся последовательности собрать в непрерывную последовательностью.

Одним из таких способов амплификации является обратная ПЦР (смотри Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186, 1988), при которой используют ферменты рестрикции, чтобы создать фрагмент в известном районе гена. Затем фрагмент переводят в кольцевую форму внутримолекулярным лигированием и используют в качестве матрицы для ПЦР с дивергентными праймерами, полученными из известного района. При альтернативном подходе последовательности, прилегающие к неполной последовательности, можно отыскивать посредством амплификации с праймером к линкерной последовательности и праймером, специфичным для известного района. Амплифицированные последовательности обычно подвергают второму раунду амплификации с таким же линкерным праймером и вторым праймером, специфичным по отношению к известному району. Вариант этой процедуры, при котором используется два праймера, которые иницируют удлинение в противоположных направлениях от известной последовательности, описан в WO 96/38591. Другой такой способ известен как «быстрая амплификация концов кДНК» или RACE. Этот способ включает в себя использование внутреннего праймера и внешнего праймера, который гибридизуется с полиА-районом или векторной последовательностью, чтобы идентифицировать последовательности, которые расположены с 5′- и 3′-стороны известной последовательности. Дополнительные способы включают ПЦР с улавливанием (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-19, 1991) и ПЦР-«прогулку» (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19: 3055-60, 1991). Также можно использовать другие способы с применением амплификации, чтобы получить полноразмерную последовательность кДНК.

В некоторых случаях можно получить полноразмерную последовательность кДНК посредством анализа последовательностей, представленных в базе данных маркерных экспрессируемых последовательностей (EST), такой, которая доступна из GenBank. Поиски перекрывающихся EST обычно можно выполнять с использованием известных программ (например, поиск NCBI BLAST). И такие EST можно использовать для того, чтобы создать непрерывную полноразмерную последовательность. Последовательности ДНК полной длины также можно получить посредством анализа геномных фрагментов.

ЭКСПРЕССИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ В КЛЕТКАХ-ХОЗЯЕВАХ.

В других вариантах изобретения полинуклеотидные последовательности или их фрагменты, которые кодируют полипептиды согласно изобретению, или гибридные белки, или их функциональные эквиваленты, можно использовать в рекомбинантных молекулах ДНК, чтобы направлять экспрессию полипептида в соответствующих клетках-хозяевах. Вследствие свойственной генетическому коду вырожденности можно получить другие последовательности ДНК, которые кодируют по существу такую же, или функционально эквивалентную аминокислотную последовательность, и указанные последовательности можно использовать для того, чтобы клонировать и экспрессировать данный полипептид.

Как будет понятно специалистам в данной области, предпочтительным в некоторых случаях может быть получение нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды, имеющих кодоны не природного происхождения. Например, можно выбрать кодоны, предпочитаемые конкретным прокариотическим или эукариотическим хозяином, для того, чтобы увеличить скорость экспрессии белка, или получить рекомбинантный РНК-транскрипт, обладающий желательными признаками, такими как более продолжительное время полужизни, чем для транскрипта, созданного на основе последовательности природного происхождения.

Кроме того, полинуклеотидные последовательности согласно данному изобретению можно получить генно-инженерным путем, используя способы, как правило, известные в данной области, чтобы изменить последовательности, кодирующие полипептид по разным причинам, включая, но не ограничивая этим, изменения, которые модифицируют клонирование, процессинг и/или экспрессию генного продукта. Например, чтобы сконструировать нуклеотидные последовательности, можно использовать перестановки в ДНК посредством получения случайных фрагментов и повторной сборки в ПЦР фрагментов гена и синтетических олигонуклеотидов. Кроме того, можно использовать сайт-специфичный мутагенез, чтобы встроить новые сайты рестрикции, изменить характер гликозилирования, изменить предпочтительное использование кодонов, получить варианты сплайсинга, или ввести мутации, и так далее.

В другом варианте изобретения природные, модифицированные или рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот можно лигировать с гетерологичной последовательностью, чтобы кодировать гибридный белок. Например, для скрининга библиотек пептидов в отношении ингибиторов полипептидной активности, полезным может быть кодирование химерного белка, который может узнаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок также можно сконструировать так, чтобы он содержал сайт расщепления, локализованный между последовательностью, кодирующей полипептид, и последовательностью гетерологичного белка, так чтобы полипептид можно было отщепить и очистить от гетерологичного компонента.

Последовательности, кодирующие требуемый полипептид, можно синтезировать целиком или частично, используя химические способы, хорошо известные в данной области (смотри Caruthers, M.H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232). Альтернативно белок как таковой можно получить, используя химические способы чтобы синтезировать аминокислотную последовательность полипептида или его части. Например, синтез пептида можно выполнить, используя различные технологии твердофазного синтеза (Roberge, J. Y. Et al. (1995) Science 269: 202-204) и можно добиться автоматизированного синтеза, используя, например, синтезатор пептидов ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Новосинтезированный пептид можно в значительной степени очистить препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (например, Creighton, T. (1983) Proteins, Structure and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.) или другими совместимыми способами, имеющимися в данной области. Структуру синтетических пептидов можно подтвердить аминокислотным анализом или секвенированием (например, способом деградации по Эдману). Кроме того, аминокислотную последовательность полипептида или любой его части можно изменить в ходе прямого синтеза и/или объединить, используя химические способы, с последовательностями других белков, или любых их частей, чтобы получить вариант полипептида.

Для того чтобы экспрессировать требуемый полипептид, нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид или функциональные эквиваленты, можно встроить в подходящий вектор экспрессии, т.е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, можно использовать для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, и соответствующие регуляторные элементы транскрипции и трансляции. Указанные способы включают технологии рекомбинантной ДНК in vitro, способы синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. Такие способы описаны в Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. и Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.

Разнообразные экспрессирующие векторы/системы хозяев можно использовать для помещения в них и экспрессии полинуклеотидных последовательностей. К ним относятся, но не ограничивают этим, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные экспрессирующими ДНК векторами на основе рекомбинантных бактериофагов, плазмид или космид; дрожжи, трансформированные дрожжевыми векторами экспрессии; системы клеток насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусами); системы растительных клеток, трансформированных вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом табачной мозаики, TMV) или бактериальными экспрессирующими векторами (например, плазмидами Ti или pBR322); или системы клеток животных.

«Контролирующие элементы» или «регуляторные последовательности», присутствующие в экспрессирующем векторе, представляют собой нетранслируемые районы вектора – энхансеры, промоторы, 5′- и 3′-нетранслируемые районы, которые взаимодействуют с белками клетки-хозяина, чтобы осуществить транскрипцию и трансляцию. Такие элементы могут варьировать по силе и специфичности. В зависимости от используемой векторной системы и хозяина можно использовать любое количество подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцируемые промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцируемые промоторы, такие как гибридный промотор lacZ фагмиды PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) или плазмиды PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) и тому подобное. В системах клеток млекопитающих обычно предпочтительны промоторы генов млекопитающих или вирусов млекопитающих. Если необходимо создать линию клеток, которая содержит множественные копии последовательности, кодирующей полипептид, преимущественно можно использовать векторы, основанные на SV40 или EBV, с соответствующими селектируемыми маркерами.

В бактериальных системах можно выбрать ряд экспрессирующих векторов в зависимости от предполагаемого применения экспрессированного полипептида. Например, в том случае, когда необходимы большие количества, например, для индукции антител, можно использовать векторы, которые обеспечивают высокий уровень экспрессии слитого белка, который легко очищать. Такие векторы включают, но не ограничены указанным, многофункциональные клонирующие и экспрессирующие векторы E. coli, такие как BLUESCRIPT (Stratagene), в котором последовательность, кодирующая представляющий интерес полипептид, может быть лигирована в вектор в рамке с последовательностями для аминоконцевого Met и последующих 7 остатков бета-галактозидазы, с тем, чтобы продуцировать гибридный белок; векторы pIN (Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509); и тому подобное. Также можно использовать векторы pGEX (Promega, Madison, Wis.), чтобы экспрессировать чужеродные полипептиды в виде белков, гибридных с глутатион-S-трансферазой (GST). В общем, такие гибридные белки растворимы и могут быть легко очищены из лизированных клеток адсорбцией на глутатион-агарозных шариках с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Белки, полученные в таких системах, могут быть сконструированы так, чтобы они включали в себя сайты расщепления протеазами гепарином, тромбином или фактором ХА, так чтобы представляющий интерес клонированный полипептид при желании можно было освободить от фрагмента GST.

В дрожжах Saccharomyces cerevisiae можно использовать ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, такие как промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы и PGH. Для обзора смотрите Ausubel et al. (выше) и Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544.

В тех случаях, когда используют экспрессирующие векторы растений, экспрессия последовательностей, кодирующих полипептиды, может управляться любым количеством промоторов. Например, вирусные промоторы, такие как промоторы 35S и 19S CaMV, можно использовать отдельно или в комбинации с лидерной последовательностью омега TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6: 307-311. Альтернативно можно использовать растительные промоторы, такие как промоторы малой субъединицы RUBISCO или теплового шока (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224: 838-843; и Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105). Указанные конструкции можно ввести в растительные клетки прямой трансформацией ДНК или трансфекцией, опосредованной патогенами. Такие способы описаны в ряде широко доступных обзоров (смотри, например, Hobbs, S. или Murry, L. E в McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; p. 191-196).

Систему насекомых также можно использовать для того, чтобы экспрессировать представляющий интерес полипептид. Например, в одной такой системе используют вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или в личинках Trichoplusia. Последовательности, кодирующие полипептид, можно клонировать в неважном для жизни районе вируса, таком как ген полиэдрина, и поместить под контроль промотора полиэдрина. Успешное встраивание последовательности, кодирующей полипептид, делает ген полиэдрина неактивным и дает рекомбинантный вирус, у которого отсутствует белок оболочки. Затем рекомбинантные вирусы можно использовать для того, чтобы, например, инфицировать клетки S. frugiperda или личинки Trichoplusia, в которых представляющий интерес полипептид может экспрессироваться (Engelhard E.K. et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3224-3227).

В клетках-хозяевах млекопитающих обычно имеются несколько экспрессирующих систем на основе вирусов. Например, в тех случаях, когда в качестве экспрессирующего вектора используют аденовирусы, последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, можно лигировать в аденовирусный транскрипционный/трансляционный комплекс, включающий в себя поздний промотор и состоящую из трех частей лидерную последовательность. Можно использовать инсерцию в несущественный район вирусного генома Е1 или Е3, чтобы получить жизнеспособный вирус, который способен экспрессировать представляющий интерес полипептид в инфицированных клетках-хозяевах (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). Кроме того, можно использовать энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (RSV), чтобы усилить экспрессию в клетках-хозяевах млекопитающих.

Также можно использовать специфичные сигналы инициации, чтобы достичь более эффективной трансляции последовательностей, кодирующих представляющий интерес полипептид. Такие сигналы включают инициирующий кодон ATG и прилежащие последовательности. В тех случаях, когда последовательности, кодирующие полипептид, кодон их инициации и «левые» последовательности встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор, может отсутствовать необходимость в дополнительных сигналах регуляции транскрипции или трансляции. Однако в тех случаях, когда встраивают только кодирующую последовательность или ее часть, необходимо предоставить экзогенные сигналы регуляции трансляции, включая инициирующий кодон ATG. Кроме того, кодон инициации должен быть в правильной рамке считывания, чтобы обеспечить трансляцию полной вставки. Экзогенные трансляционные элементы и кодоны инициации могут быть различного происхождения как природного, так и синтетического. Эффективность экспрессии можно усилить включением энхансеров, которые подходят для конкретной используемой клеточной системы, таких как энхансеры, описанные в литературе (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162).

Кроме того, линию клеток-хозяев можно выбрать по способности модулировать экспрессию встроенных последовательностей или процессировать экспрессированный белок желательным образом. Такие модификации полипептида включают, но не ограничены этим, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Для того чтобы обеспечить правильное встраивание, упаковку и/или функционирование также может быть использован посттрансляционный процессинг, который расщепляет форму «препробелка». Для того чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг чужеродного белка можно выбрать различные клетки-хозяева, такие как СНО, HeLa, MDCK, HEK293 и WI38, которые обладают специфичным клеточным аппаратом и характерными механизмами для такой посттрансляционной активности.

Для долговременной высокопродуктивной выработки рекомбинантных белков, как правило, предпочтительна стабильная экспрессия. Например, линии клеток, которые стабильно экспрессируют представляющий интерес полинуклеотид, можно трансформировать с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать начала репликации вирусов и/или эндогенные элементы экспрессии и селектируемый маркерный ген в том же самом или отдельном векторе. После введения вектора клеткам можно дать возможность расти в течение 1-2 дней в обогащенных средах перед переводом их в селективные среды. Назначением селектируемого маркера является придание резистентности к селекции, и его присутствие обеспечивает возможность выращивать и извлекать клетки, которые успешно экспрессируют введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток можно размножать, используя способы культивирования тканей, подходящие для типа клеток.

Для получения трансформированных линий клеток можно использовать любое количество систем селекции. Указанные системы включают, но не ограничены этим, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-32) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy, I. et al. (1990) Cell 22: 817-23), которые можно использовать в клетках tk.sup.- или aprt.sup.-, соответственно. Также в качестве основы для селекции можно использовать устойчивость к антиметаболитам, антибиотикам или гербицидам; например, dhfr, который придает резистентность к метотрексату (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-70); npt, который придает резистентность к аминогликозидам, неомицину и G-418 (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14); и als или pat, которые придают устойчивость к хлорсульфурону и фосфинотрицинацетилтрансферазе, соответственно (Murry, выше). Описаны дополнительные селектируемые гены, например, trpB, который обеспечивает клеткам возможность использовать индол вместо триптофана, или hisD, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина (Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51). В последнее время приобрело популярность применение видимых маркеров, таких маркеров как антоцианины, бета-глюкуронидаза и ее субстрат GUS и люцифераза и ее субстрат люциферин, при этом они широко используются не только для идентификации трансформантов, но также для измерения количества временной или стабильной экспрессии белка, относящейся к конкретной векторной системе (Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55: 121-131).

Хотя наличие/отсутствие экспрессии маркерного гена свидетельствует о том, что представляющий интерес ген также присутствует, может требоваться подтверждение его наличия и экспрессии. Например, если последовательность, кодирующая полипептид, встроена в последовательность маркерного гена, рекомбинантные клетки, содержащие последовательности, можно идентифицировать по отсутствию функционирования маркерного гена. Альтернативно маркерный ген может быть помещен в тандеме с последовательностью, кодирующей полипептид, под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индукцию или селекцию обычно также указывает на экспрессию тандемного гена.

Альтернативно клетки-хозяева, которые содержат и экспрессируют желаемую полинуклеотидную последовательность, можно идентифицировать посредством множества процедур, известных специалистам в данной области. Указанные процедуры включают, но не ограничены этим, гибридизацию ДНК-ДНК или ДНК-РНК и способы биоанализа или иммуноанализа белка, которые включают технологии на основе мембран, растворов или чипов для выявления и/или количественного определения нуклеиновой кислоты или белка.

В данной области известно множество протоколов для выявления и измерения экспрессии продуктов, кодируемых полинуклеотидами, с использованием либо поликлональных, либо моноклональных антител, специфичных в отношении продукта. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (РИА) и флюоресцентно-активируемую сортировку клеток (FACS). Для некоторых применений предпочтительным может быть иммуноанализ, основанный на моноклональных антителах с двумя антидетерминантами, с использованием моноклональных антител, реагирующих с двумя непересекающимися эпитопами на данном полипептиде, но также можно использовать анализ конкурентного связывания. Указанные и другие анализы описаны наряду с другими публикациями, в Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) и Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158: 1211-1216).

Широкое разнообразие меток и способов конъюгации известно специалистам в данной области и может быть использовано в различных анализах нуклеиновых кислот и аминокислот. Способы получения меченых зондов для гибридизации и ПЦР для выявления последовательностей, относящихся к полинуклеотидам, включают мечение олигонуклеотидов, ник-трансляцию, концевое мечение или ПЦР-амплификацию с использованием меченого нуклеотида. В альтернативном случае последовательности или любые их части можно клонировать в векторе для получения мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области и доступны для приобретения, и могут быть использованы для того, чтобы синтезировать РНК-зонды in vitro при добавлении соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или SP6, и меченых нуклеотидов. Указанные процедуры можно проводить с использованием различных коммерчески доступных наборов. Подходящие репортерные молекулы или метки, которые можно использовать, включают радионуклиды, ферменты, флуоресцентные, хемилюминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и тому подобное. Клетки-хозяева, трансформированные представляющей интерес полинуклеотидной последовательностью, можно культивировать в условиях, подходящих для экспрессии и извлечения белка из культуры клеток. Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может секретироваться или находится внутри клеток в зависимости от последовательности и/или используемого вектора. Как будет понятно специалистам в данной области, экспрессирующие векторы, содержащие полинуклеотиды согласно изобретению, можно сконструировать так, чтобы они содержали сигнальные последовательности, которые управляют секрецией кодируемого полипептида через мембрану прокариотической или эукариотической клетки. Можно использовать другие рекомбинантные конструкции, чтобы соединить последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидный домен, который облегчит очистку растворимых белков. Такие облегчающие очистку домены включают, но не ограничены этим, пептиды, хелатирующие металлы, такие как модули гистидина-триптофана, которые обеспечивают очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые обеспечивают очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе FLAGS-удлинения/аффинной очистки (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как последовательности, специфичные для фактора ХА или энтерокиназы (Invitrogen, San Diego, Calif.) между доменом, предназначенным для очистки, и кодируемым полипептидом, можно использовать для облегчения очистки. Один из таких экспрессирующих векторов предусматривает экспрессию слитого белка, содержащего представляющий интерес полипептид, и нуклеиновую кислоту, кодирующую 6 остатков гистидина, предшествующих тиоредоксину, или сайту расщепления энтерокиназой. Остатки гистидина обеспечивают очистку на IMIAC (аффинная хроматография с использованием иммобилизованных ионов металлов), как описано в Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3: 263-281), в то время как сайт расщепления энтерокиназой предоставляет средство для очистки требуемого полипептида из слитого белка. Обсуждение векторов, которые содержат гибридные белки, дается в Kroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12: 441-453).

Кроме способов получения рекомбинантов полипептиды согласно изобретению или их фрагменты можно получать прямым синтезом пептидов, используя методики твердофазного синтеза (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154). Синтез белков можно выполнить вручную или автоматизированными способами. Автоматизированный синтез, например, можно осуществить, используя синтезатор пептидов Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Альтернативно можно отдельно химическим способом синтезировать различные фрагменты и соединить их, используя химические способы, чтобы получить молекулу полной длины.

САЙТ-СПЕЦИФИЧНЫЙ МУТАГЕНЕЗ.

Сайт-специфичный мутагенез является способом, пригодным для получения отдельных пептидов или биологически функциональных эквивалентных полипептидов с помощью специфичного мутагенеза основных полинуклеотидов, которые их кодируют. Способ, хорошо известный специалистам в данной области, кроме того, предоставляет легкодоступную возможность получать и тестировать варианты последовательности, например, принимая во внимание одно или более вышеупомянутых соображений, введением одного или нескольких изменений нуклеотидной последовательности в ДНК. Сайт-специфичный мутагенез позволяет получать мутанты посредством использования специфичных олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК с требуемой мутацией, а также достаточное количество близлежащих нуклеотидов, чтобы получить последовательность праймера достаточного размера и сложности последовательности для того, чтобы сформировать стабильный дуплекс с обеих сторон перекрываемого соединения с делецией. Мутации можно использовать в выбранной нуклеотидной последовательности для того, чтобы улучшить, изменить, снизить, модифицировать, или другим образом изменить свойства самого полинуклеотида и/или изменить свойства, активность, структуру, стабильность или первичную последовательность кодируемого полипептида.

В некоторых вариантах данного изобретения авторы предполагают использование мутагенеза заявленных полинуклеотидных последовательностей для того, чтобы изменить одно или несколько свойств кодируемого полипептида, таких как антигенность полипептидной вакцины. Способы сайт-специфичного мутагенеза хорошо известны в данной области и широко используются для создания вариантов как полипептидов, так и полинуклеотидов. Например, сайт-специфичный мутагенез часто используют для того, чтобы изменить конкретную часть молекулы ДНК. В таких вариантах используют праймер, обычно содержащий примерно от 14 до 25 нуклеотидов или около этого в длину, и при этом примерно от 5 до 10 остатков с обеих сторон соединения изменяемой последовательности.

Как будет понятно специалистам в данной области, в способах сайт-специфичного мутагенеза часто использовали фаговый вектор, который существует как в однонитевой, так и в двунитевой форме. Обычные векторы, пригодные для сайт-специфичного мутагенеза, включают такие векторы, как фаг М13. Этот фаг легко доступен для приобретения и его применение обычно хорошо известно специалистам в данной области. Двунитевые плазмиды также обычно используют в сайт-специфичном мутагенезе, при котором исключена стадия переноса интересующего гена из плазмиды в фаг.

В общем сайт-специфичный мутагенез согласно данному изобретению выполняют, получая сначала однонитевой вектор или расплавляя на отдельные две нити двунитевой вектор, который содержит в своей последовательности последовательность ДНК, которая кодирует требуемый пептид. Олигонуклеотидный праймер, несущий требуемую мутантную последовательность, обычно получают синтетически. Затем указанный праймер отжигают с однонитевым вектором и подвергают воздействию ДНК-полимеризующих ферментов, таких как фрагмент Кленова полимеразы I E. coli, для того, чтобы завершить синтез нити, несущей мутацию. Таким образом, формируют гетеродуплекс, в котором одна нить кодирует исходную не мутантную последовательность, а вторая нить несет требуемую мутацию. Затем указанный гетеродуплексный вектор используют для трансформации соответствующих клеток, таких как клетки E. coli, и отбирают клоны, которые содержат рекомбинантные векторы, несущие последовательность с мутантным расположением нуклеотидов.

Получение вариантов последовательности выбранных сегментов ДНК, кодирующих пептид, с использованием сайт-специфичного мутагенеза предоставляет средства получения потенциально полезных вариантов и не означает ограничения, так как существуют другие способы, посредством которых можно получить варианты последовательности пептидов и кодирующих их последовательностей ДНК. Например, рекомбинантные векторы, кодирующие требуемую пептидную последовательность, можно обработать мутагенными агентами, такими как гидроксиламин, чтобы получить варианты последовательности. Конкретные подробности, относящиеся к указанным способам и протоколам, имеются в руководствах Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; и Maniatis et al., 1982, каждое из которых с этой целью включено здесь в виде ссылки.

В используемом здесь смысле термин «процедура сайт-специфичного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов» относится к процессам, зависимым от матрицы, и воспроизведению, опосредованному вектором, результатом которых является увеличение концентрации молекулы специфичной нуклеиновой кислоты относительно ее исходной концентрации, или увеличение концентрации регистрируемого сигнала, такому как амплификация. В используемом здесь смысле подразумевается, что термин «процедура сайт-специфичного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов» относится к способу, который включает в себя зависимое от матрицы удлинение молекулы праймера. Термин «способ, зависимый от матрицы» относится к синтезу нуклеиновых кислот – молекулы РНК или ДНК, при котором последовательность новосинтезированной нити нуклеиновой кислоты продиктована хорошо известными правилами комплементарного спаривания оснований (смотри, например, Watson, 1987). Обычно методы, опосредованные векторами, включают в себя введение фрагмента нуклеиновой кислоты в ДНК- или РНК-вектор, клональную амплификацию вектора и извлечение амплифицированного фрагмента нуклеиновой кислоты. Примеры таких методов даются в патенте США No. 4237224, специально включенном здесь в виде ссылки в полном объеме.

СПОСОБЫ АМПЛИФИКАЦИИ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ.

Имеется ряд зависимых от матрицы способов для того, чтобы амплифицировать представляющие интерес последовательности-мишени в образце. Одним из наиболее известных способов амплификации является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая подробно описана в патентах США No. 4683195, 4683202 и 4800159, каждый из которых включен здесь в виде ссылки в полном объеме. Коротко, при ПЦР готовят две праймерные последовательности, которые комплементарны районам на противоположных комплементарных нитях последовательности-мишени. К реакционной смеси добавляют избыток дезоксинуклеозидтрифосфатов вместе с ДНК-полимеразой (например, полимеразой Taq). Если последовательность-мишень присутствует в образце, праймеры будут связываться с мишенью, и полимераза вызовет удлинение праймеров вдоль последовательности мишени посредством присоединения нуклеотидов. При повышении и понижении температуры реакционной смеси удлиненные праймеры будут отделяться от мишени, образуя продукты реакции, избыток праймеров будет связываться с мишенью и с продуктом реакции и процесс повторится. Предпочтительно можно выполнять процедуру обратной транскрипции и ПЦР-амплификации для того, чтобы измерить количество амплифицированной мРНК. Способы полимеразной цепной реакции хорошо известны в данной области.

Другим способом амплификации является лигазная цепная реакция (называемая ЛЦР), описанная в опубликованной заявке на выдачу европейского патента No. 320308 (специально включенной здесь в виде ссылки в полном объеме). При ЛЦР готовят две пары комплементарных зондов, и в присутствии последовательности-мишени каждая пара будет связываться с противоположными комплементарными нитями мишени, так, чтобы они примыкали друг к другу. В присутствии лигазы две пары зондов будут связываться, образуя одну единицу. При цикличном изменении температуры, как и при ПЦР, лигированные связанные единицы отделяются от мишени и затем служат в качестве «последовательностей-мишеней» для лигирования избытка пар зондов. В патенте США No. 4883750, включенном здесь в виде ссылки в полном объеме, описан альтернативный способ амплификации, сходный с ЛЦР, для связывания пар зондов с последовательностью мишени.

Также можно использовать Q бета-репликазу, описанную в опубликованной международной заявке РСТ на выдачу патента No. РСТ/US87/00880, включенной здесь в виде ссылки в полном объеме, в качестве еще одного способа амплификации согласно данному изобретению. В указанном способе репликативную последовательность РНК, которая имеет район, комплементарный району мишени, добавляют к образцу в присутствии РНК-полимеразы. Полимераза будет копировать репликативную последовательность, которую затем можно обнаружить.

Способ изотермальной амплификации, при котором используют эндонуклеазы рестрикции и лигазы, чтобы добиться амплификации молекул мишени, которые содержат нуклеотид-5′-[-тио]трифосфаты в одной нити сайта рестрикции (Walker et al., 1992, работа включена здесь в виде ссылки в полном объеме), также может быть пригодным при амплификации нуклеиновых кислот согласно данному изобретению.

Амплификация с вытеснением цепи (SDA) является другим способом выполнения изотермальной амплификации нуклеиновых кислот, который включает в себя множественные раунды вытеснения цепи и синтеза, т.е. ник-трансляции. Сходный способ, называемый цепной реакцией репарации (RCR), является другим способом амплификации, который может быть пригоден для данного изобретения, и он включает в себя отжиг нескольких зондов по всей длине района, выбранного в качестве мишени для амплификации, с последующей реакцией репарации, при которой присутствуют только два из четырех оснований. Другие два основания можно добавить в виде биотинилированных производных для облегчения регистрации. Сходный подход используется при SDA.

Последовательности также можно обнаружить, используя циклическую реакцию с зондом (CPR). При CPR зонд, имеющий 3′- и 5′-последовательности ДНК, не являющейся мишенью, и внутреннюю или «среднюю» последовательность РНК, специфичной для белка-мишени, гибридизуют с ДНК, которая присутствует в образце. После гибридизации реакционную смесь обрабатывают РНКазой Н, и продукты зонда идентифицируют в виде характерных продуктов при генерировании сигнала, который высвобождается после расщепления. Исходную матрицу отжигают с другим цикличным зондом и реакцию повторяют. Таким образом, CPR включает в себя амплификацию сигнала, генерируемого при гибридизации зонда со специфичной для гена-мишени экспрессированной нуклеиновой кислотой.

Согласно данному изобретению еще можно использовать другие способы амплификации, описанные в заявке на выдачу патента Великобритании No. 2202328 и в опубликованной международной заявке РСТ No. PCT/US89/01025, каждая из которых включена здесь в виде ссылки в полном объеме. В первой заявке «модифицированные» праймеры используют в ходе подобного ПЦР зависимого от матрицы и фермента синтезе. Праймеры можно модифицировать мечением фрагментом для улавливания (например, биотином) и/или детекторным фрагментом (например, ферментом). В последней заявке к образцу добавляют избыток меченых зондов. В присутствии последовательности-мишени зонд связывается и каталитически расщепляется. После расщепления последовательность-мишень высвобождается в интактном виде, чтобы связаться с избытком зонда. Расщепление меченого зонда дает сигнал о присутствии последовательности-мишени.

Другие способы амплификации нуклеиновых кислот включают системы амплификации, основанные на транскрипции (TAS) (Kwoh et al., 1989; опубликованная международная заявка PCT No. WO 88/10315, включенная здесь в виде ссылки а полном объеме), включая амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA) и 3SR. В NASBA нуклеиновые кислоты для амплификации можно получить стандартной экстракцией фенолом/хлороформом, тепловой денатурацией образца, обработкой лизирующим буфером и используя центрифужные миниколонки для выделения ДНК и РНК, или экстракцией РНК с гуанидинхлоридом. Указанные способы амплификации включают в себя отжиг праймера, который имеет последовательности, специфичные по отношению к последовательности-мишени. После полимеризации гибриды ДНК/РНК расщепляют РНКазой Н, в то время как двунитевые молекулы ДНК снова денатурируют теплом. В каждом случае однонитевую ДНК делают полностью двунитевой посредством добавления второго специфичного для мишени праймера с последующей полимеризацией. Затем двунитевые молекулы ДНК многократно транскрибируют такой полимеразой, как Т7 или SP6. При изотермальной циклической реакции РНК обратно транскрибируют в ДНК и опять транскрибируют такой полимеразой, как Т7 или SP6. Полученные в результате продукты, укороченные или полные, свидетельствуют о специфичных для мишени последовательностях.

В опубликованной заявке на европейский патент No. 329822, включенный здесь в виде ссылки в полном объеме, раскрыт способ амплификации нуклеиновых кислот, включающий в себя цикличный синтез однонитевой РНК (онРНК), онДНК и двунитевой ДНК (днДНК), который можно использовать согласно данному изобретению. онРНК является первой матрицей для первого олигонуклеотидного праймера, который элонгируют обратной транскриптазой (РНК-зависимая ДНК-полимераза). Затем РНК удаляют из полученного в результате дуплекса ДНК:РНК, действуя рибонуклеазой Н (РНКаза Н, РНКаза, специфичная по отношению к РНК в дуплексе с ДНК или РНК). Полученная в результате онДНК является второй матрицей для второго праймера, который также содержит последовательности промотора РНК-полимеразы (примером которой является РНК-полимераза Т7) на 5′-конце последовательности праймера, гомологичной его матрице. Затем указанный праймер удлиняют ДНК-полимеразой (примером которой служит большой фрагмент «Кленова» ДНК-полимеразы I E. coli), получая в результате двунитевую молекулу ДНК («днДНК»), имеющую последовательность, идентичную последовательности исходной РНК между праймерами, и дополнительно имеющую на одном конце последовательность промотора. Указанная последовательность промотора может быть использована соответствующей РНК-полимеразой для того, чтобы сделать много РНК-копий ДНК. Затем эти копии снова вводят в цикл, что приводит к очень быстрой амплификации. При правильном выборе ферментов такую амплификацию можно осуществлять изотермически без добавления ферментов в каждом цикле. Вследствие циклической природы этого процесса стартовую последовательность можно выбрать в форме либо ДНК, либо РНК.

В опубликованной международной заявке РСТ на выдачу патента No. WO 89/06700, включенной здесь в виде ссылки в полном объеме, описана схема амплификации последовательности нуклеиновой кислоты на основе гибридизации последовательности промотора/праймера с однонитевой ДНК («онДНК») мишени с последующей транскрипцией множества РНК-копий этой последовательности. Указанная схема не является цикличной; т.е. новые матрицы не продуцируются на основе полученных в результате РНК-транскриптов. Другие способы амплификации включают «RACE» (Frohman, 1990) и «одностороннюю ПЦР» (Ohara, 1989), которые хорошо известны специалистам в данной области.

Способы, основанные на лигировании двух (или более) олигонуклеотидов в присутствии нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность получаемого в результате «диолигонуклеотида», таким образом приводящие к амплификации диолигонуклеотида (работа Wu and Dean, 1996, включенная здесь в виде ссылки в полном объеме), также можно использовать при амплификации последовательностей ДНК согласно данному изобретению.

БИОЛОГИЧЕСКИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЭКВИВАЛЕНТЫ.

В структуре полинуклеотидов и полипептидов согласно данному изобретению можно сделать модификации и изменения, и получить еще функциональную молекулу, которая кодирует полипептид с желаемыми характеристиками. Как указано выше, часто требуется ввести одну или несколько мутаций в специфичную последовательность полинуклеотида. В некоторых случаях полученная в результате кодируемая последовательность полипептида изменяется такой мутацией или в некоторых случаях при одной или нескольких мутациях в кодирующем полинуклеотиде последовательность полипептида не изменяется.

В том случае, когда требуется изменить аминокислотную последовательность полипептида, чтобы создать эквивалент, или даже улучшенную молекулу второго поколения, изменений аминокислот можно добиться, изменяя один или несколько кодонов кодирующей последовательности ДНК в соответствии с таблицей 1.

Например, в структуре белка некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами без заметной потери связывающей способности при взаимодействии с такими структурами, как, например, антигенсвязывающие районы антител или сайты связывания на субстратных молекулах. Так как эта биологическая функциональная активность белка определяется способностью к взаимодействию и природой белка, в последовательности белка можно сделать некоторые замены аминокислотной последовательности, и, конечно, в ее основной кодирующей последовательности ДНК, и тем не менее получить белок с похожими свойствами. Поэтому авторы данного изобретения полагают, что можно сделать различные изменения в пептидных последовательностях описанной структуры или в соответствующих последовательностях ДНК, которые кодируют указанные пептиды, без заметной потери их биологической эффективности или активности.

Таблица 1.

______________________________________________________________

Аминокислоты Кодоны

______________________________________________________________

Аланин Ala A GCA GCC GCG GCU

Цистеин Cys C UGC UGU

Аспарагиновая кислота Asp D GAC GAU

Глутаминовая кислота Glu E GAA GAG

Фенилаланин Phe F UUC UUU

Глицин Gly G GGA GGC GGG GGU

Гистидин His H CAC CAU

Изолейцин Ile I AUA AUC AUU

Лизин Lys K AAA AAG

Лейцин Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Метионин Met M AUG

Аспарагин Asn N AAC AAU

Пролин Pro P CCA CCC CCG CCU

Глутамин Gln Q CAA CAG

Аргинин Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Серин Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Треонин Thr T ACA ACC ACG ACU

Валин Val V GUA GUC GUG GUU

Триптофан Trp W UGG

Тирозин Tyr Y UAC UAU

______________________________________________________________

При осуществлении таких замен можно учитывать гидропатический индекс аминокислот. Значение гидропатического индекса аминокислот в придании белку биологической функции взаимодействия, как правило, учитывается в данной области (Kyte and Doolittle, 1982, включенная здесь в виде ссылки). Считается, что относительный гидропатический характер аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру полученного в результате белка, которая в свою очередь определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например, ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и тому подобным. Для каждой аминокислоты определен гидропатический индекс на основе ее характеристик гидрофобности и заряда (Kyte and Doolittle, 1982). Эти значения равны: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-0,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9); и аргинин (-4,5).

В данной области известно, что некоторые аминокислоты можно заменять другими аминокислотами, имеющими сходный гидропатический индекс или оценку, и все же получить в результате белок со сходной биологической активностью, т.е. все же получить белок биологически функционально эквивалентный. При осуществлении таких изменений предпочтительны замены аминокислот, гидропатический индекс которых находится в пределах ±2, особенно предпочтительны замены в пределах ±1, и еще более предпочтительны замены в пределах ±0,5. В данной области также понятно, что замену подобных аминокислот можно эффективно осуществлять на основе гидрофильности. В патенте США 4554101 (специально включенном здесь в виде ссылки в полном объеме) установлено, что самая высокая средняя локальная гидрофильность белка, которая обусловлена гидрофильностью соседних аминокислот, коррелирует с биологическим свойством белка.

Как подробно описано в патенте США 4554101, для аминокислотных остатков установлены следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 ±1); глутамат (+3,0 ±1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5 ±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Понятно, что аминокислоту можно заменить другой, имеющей сходное значение гидрофильности, и все же получить биологический эквивалент, и, в частности, иммунологически эквивалентный белок. При таких изменениях предпочтительна замена аминокислот, значения гидрофильности которых находятся в пределах ±2, особенно предпочтительна замена в пределах ±1, и еще более предпочтительна замена в пределах ±0,5.

Следовательно, как отмечено выше, замены аминокислот обычно основаны на относительном сходстве заместителей боковых цепей аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и тому подобного. Примеры замен, при которых принимаются во внимание вышеуказанные характеристики, хорошо известны специалистам в данной области и включают: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серин и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.

Кроме того, полинуклеотид можно дополнительно модифицировать, чтобы повысить стабильность in vivo. Возможные модификации включают, но не ограничены этим, присоединение фланкирующих последовательностей на 5′ и/или 3′-концах; использование фосфоротиоатных или 2′-О-метильных, а не фосфодиэфирных связей в основной цепи; и/или включение нетрадиционных оснований, таких как инозин, квиозин и вайбутозин, а также ацетил-, метил-, тио- и других модифицированных форм аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина.

СПОСОБЫ ДОСТАВКИ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ IN VIVO.

В дополнительных вариантах в клетки in vivo вводят генетические конструкции, содержащие один или несколько полинуклеотидов согласно изобретению. Этого можно достичь, используя любой из множества хорошо известных подходов, некоторые из которых указаны ниже в целях иллюстрации.

1. АДЕНОВИРУС.

Один их предпочтительных способов доставки in vivo одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот включает в себя использование аденовирусного экспрессирующего вектора. Термин «аденовирусный экспрессирующий вектор» означает, что он включает конструкции, которые содержат последовательности аденовируса, достаточные для того, чтобы (а) обеспечить упаковку конструкции и (b) экспрессировать полинуклеотид, который был в них клонирован в смысловой или антисмысловой ориентации. Конечно в контексте антисмысловой конструкции, экспрессия не требует, чтобы был синтезирован продукт гена.

Экспрессирующий вектор содержит генетически сконструированную форму аденовируса. Знание генетической организации аденовируса, линейного двунитевого ДНК-вируса размером 36 т.п.н. позволяет проводить замещение больших участков аденовирусной ДНК чужеродными последовательностями длиной до 7 т.п.н. (Grunhaus and Horwitz, 1992). В отличие от ретровируса аденовирусная инфекция клеток-хозяев не приводит в результате к интеграции в хромосому, поскольку аденовирусная ДНК может реплицироваться в виде эписом без возможной генотоксичности. К тому же аденовирусы структурно стабильны, и после большой амплификации не обнаружено перестройки генома. Аденовирус может инфицировать практически все эпителиальные клетки, независимо от стадии клеточного цикла. До настоящего времени аденовирусную инфекцию выявляют только в связи с умеренным заболеванием, таким как острое респираторное заболевание у людей.

Аденовирус, в частности, пригоден для применения в качестве вектора для переноса генов вследствие среднего размера генома, легкости манипулирования, высокого титра, широкого диапазона клеток-мишеней и высокой инфекционности. Оба конца вирусного генома содержат инвертированные повторы длиной 100-200 п.н. (ITR), которые представляют собой цис-элементы, необходимые для репликации вирусной ДНК и упаковки. Ранние (Е) и поздние (L) районы генома содержат различные единицы транскрипции, которые разделены началом репликации вирусной ДНК. Район Е1 (Е1А и Е1В) кодирует белки, ответственные за регуляцию транскрипции вирусного генома и нескольких клеточных генов. Результатом экспрессии района Е2 (Е2А и Е2В) является синтез белков репликации вирусной ДНК. Указанные белки вовлечены в репликацию ДНК, экспрессию поздних генов и прекращение функционирования клетки-хозяина (Renan, 1990). Продукты поздних генов, включая большинство белков вирусного капсида, экспрессируются только после значительного процессинга единого первичного транскрипта, образующегося под контролем главного позднего промотора (MLP). MLP (локализованный в положении 16,8 ед. генетической карты) особенно эффективен во время поздней фазы инфекции, и все мРНК, образующиеся с этого промотора, имеют 5′-лидерную последовательность, состоящую из трех частей (TPL), которая делает их предпочтительными для трансляции мРНК.

В данной системе рекомбинантный аденовирус создают в результате гомологичной рекомбинации между челночным вектором и провирусным вектором. Благодаря возможной рекомбинации между двумя провирусными векторами в результате этого процесса может возникнуть аденовирус дикого типа. Поэтому, важно выделить отдельный клон вируса из индивидуальной бляшки и проверить структуру его генома.

Создание и размножение данных аденовирусных векторов, которые дефицитны по репликации, зависят от уникальной линии хелперных клеток, названной 293, которую трансформировали из клеток эмбриональной почки человека фрагментами ДНК Ad5 и которая конститутивно экспрессирует белки Е1 (Graham et al., 1977). Так как район Е3 не существенен для аденовирусного генома (Jones and Shenk, 1978) имеющиеся в настоящее время аденовирусные векторы с помощью клеток 293 несут чужеродную ДНК либо в Е1, D3, либо в обоих районах (Graham and Prevec, 1991). В природе аденовирус может упаковывать примерно 105% генома дикого типа (Ghosh-Choudhury et al., 1987), обеспечивая размещение около 2 т.п.н. дополнительной ДНК. Вместе с примерно 5,5 т.п.н. ДНК, которая заменяется в Е1 и Е3 районах, максимальная емкость данного аденовирусного вектора составляет около 7,5 т.п.н., или примерно 15% общей длины вектора. Более 80% вирусного генома аденовируса сохраняется в остове вектора и является источником цитотоксичности, связанной с вектором. К тому же дефицит по репликации вируса с делецией Е1 неполный. Например, наблюдали «просачивание» экспрессии вирусных генов при использовании имеющихся в настоящее время векторов при инфекции высокой кратности (MOI) (Mulligan, 1993).

Линии хелперных клеток можно получить из клеток человека, таких как клетки эмбриональной почки человека, мышечные клетки, гематопоэтические клетки или другие мезенхимные или эпителиальные клетки эмбриона человека. Альтернативно хелперные клетки можно получить из клеток других видов млекопитающих, которые являются пермиссивными для аденовируса человека. Такие клетки включают, например, клетки Vero, или другие мезенхимные или эпителиальные клетки эмбриона обезьян. Как отмечено выше в настоящее время предпочтительной линией хелперных клеток является линия 293.

Недавно Racher et al. (1995) заявили об усовершенствованных способах культивирования клеток 293 и размножения аденовирусов. В одной форме, агрегаты природных клеток выращивают посредством инокулирования индивидуальных клеток во вращающиеся силиконизированные флаконы объемом 1 литр (Techne, Cambridge, UK), содержащие 100-200 мл среды. После встряхивания при 40 об/мин жизнеспособность клеток определяют с трипановым синим. В другой форме используют микроносители Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 г/л) следующим образом. Инокулят клеток, ресуспендированный в 5 мл среды, добавляют к носителю (50 мл) в колбу Эрленмейера объемом 250 мл и оставляют в стационарном состоянии при редком встряхивании в течение от 1 до 4 час. Затем среду заменяют 50 мл свежей среды и начинают встряхивать. Для продукции вирусов клеткам дают возможность расти до слияния примерно на 80%, после этого момента среду заменяют (до 25% конечного объема) и добавляют аденовирусы при MOI 0,05. Культуры оставляют в стационарном состоянии в течение ночи, после чего объем увеличивают до 100%, и начинают встряхивание в течение следующих 72 часов.

Кроме требования, чтобы аденовирусный вектор был дефектным по репликации, или, по меньшей мере, условно дефектным, предполагается, что природа аденовирусного вектора не является решающей для успешного практического применения изобретения. Аденовирус может представлять собой любой из 42 различных известных серотипов или подгрупп А-F. Аденовирус типа 5 подгруппы С является предпочтительным исходным материалом для того, чтобы получить условно дефектный по репликации аденовирусный вектор для применения в данном изобретении, так как аденовирус типа 5 является аденовирусом человека, о котором известно огромное количество биохимической и генетической информации, и его исторически использовали для большинства конструкций, использующих аденовирус в качестве вектора.

Как указано выше обычный вектор согласно данному изобретению имеет дефект по репликации и не будет иметь аденовирусного района Е1. Таким образом, наиболее подходящим будет введение полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес ген, в положение, из которого удалены последовательности, кодирующие Е1. Однако положение инсерции в конструкции в пределах аденовирусных последовательностей не является критическим для изобретения. Полипептид, кодирующий представляющий интерес ген, также может быть встроен вместо делетированного района Е3 в векторах с замещениями Е3, как описано Karlsson et al. (1986), или в район Е4, в тех случаях, когда линия хелперных клеток или хелперный вирус комплементирует дефект Е4.

Аденовирус является простым для выращивания и обращения и обнаруживает широкий круг хозяев in vitro и in vivo. Эту группу вирусов можно получить при высоких титрах, например 10⁹-10¹¹ бляшкообразующих единиц на мл, и они высоко инфекционны. Жизненный цикл аденовируса не требует интеграции в геном клетки-хозяина. Чужеродные гены, доставляемые аденовирусными векторами, являются эписомными, поэтому обладают низкой генотоксичностью по отношению к клетке-хозяину. Не сообщалось о побочных эффектах при исследовании вакцинации аденовирусом дикого типа (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), что свидетельствует о их безопасности и возможности терапевтического применения в качестве векторов для переноса генов in vivo.

Аденовирусные векторы использовали для экспрессии эукариотических генов (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) и разработке вакцин (Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1992). Недавно исследования на животных показали, что рекомбинантный аденовирус можно использовать в генной терапии (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Исследования по введению рекомбинантного аденовируса в различные ткани включают инстилляцию в трахею (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), мышечную инъекцию (Ragot et al., 1993), периферические внутривенные инъекции (Herz and Gerard, 1993) и стереотаксическую инокуляцию в головной мозг (Le Gal La Salle et al., 1993).

2. РЕТРОВИРУСЫ.

Ретровирусы представляют собой группу однонитевых РНК-вирусов, которые характеризуются способностью превращать свою РНК в двунитевую ДНК в инфицированных клетках с помощью процесса обратной транскрипции (Coffin, 1990). Затем полученная в результате ДНК стабильно интегрируется в клеточные хромосомы в виде провируса и направляет синтез вирусных белков. Результатом интеграции является сохранение последовательностей вирусных генов в реципиентной клетке и ее потомстве. Геном ретровируса содержит три гена, gag, pol и env, которые кодируют белки капсида, фермент полимеразу и компоненты оболочки, соответственно. Последовательность, обнаруженная «левее» гена gag содержит сигнал для упаковки генома в вирионы. На 5′- и 3′-концах вирусного генома присутствуют две последовательности длинных концевых повторов (LTR). Эти последовательности содержат последовательности сильного промотора и энхансера, а также необходимы для интеграции в геном клетки-хозяина (Coffin, 1990).

Для того чтобы сконструировать ретровирусный вектор, нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, которые представляют интерес, встраивают в вирусный геном вместо некоторых вирусных последовательностей, чтобы получить вирус, который дефектен по репликации. Для продукции вирионов конструируют линию пакующих клеток, содержащих гены gag, pol и env, но без LTR, и компонентов упаковки (Mann et al., 1983). В том случае, когда рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК вместе с ретровирусными LTR и последовательностями упаковки, вводят в указанную линию клеток (например, преципитацией фосфатом кальция), последовательность упаковки дает возможность РНК-транскрипту рекомбинантной плазмиды упаковаться в вирусные частицы, которые затем секретируются в культуральную среду (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Среду, содержащую рекомбинантные ретровирусы, затем собирают, необязательно концентрируют и используют для переноса генов. Ретровирусные векторы способны инфицировать широкое множество типов клеток. Однако интеграция и стабильная экспрессия требуют деления клеток-хозяев (Paskind et al., 1975).

Недавно разработан новый подход, предназначенный для того, чтобы обеспечить специфичную доставку к мишени ретровирусных векторов, основанный на химической модификации ретровируса химическим присоединением остатков лактозы к вирусной оболочке. Указанная модификация может дать возможность для специфичной инфекции гепатоцитов посредством рецепторов сиалогликопротеидов.

Был разработан другой подход к доставке к мишени рекомбинантных ретровирусов, при котором использовали биотинилированные антитела против белка оболочки ретровируса и против специфичного рецептора клетки. Антитела связывали посредством биотиновых компонентов, используя стрептавидин (Roux et al., 1989). Используя антитела против антигенов класса I и класса II главного комплекса гистосовместимости, авторы продемонстировали инфекцию различных клеток человека, которые несли указанные поверхностные антигены, экотропным вирусом in vitro (Roux et al., 1989).

3. АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСЫ.

AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat and Muzycska, 1984) является паровирусом, обнаруженном как загрязнение аденовирусных штаммов. Это широко распространенный вирус (антитела имеются у 85% популяции человека в США), который не был связан с каким-либо заболеванием. Вирус также классифицируют как депендовирус, поскольку его репликация зависит от присутствия хелперного вируса, такого как аденовирус. Выделено пять серотипов, из которых лучше всех охарактеризован AAV-2. AAV имеет однонитевую линейную ДНК, которая заключена в капсидные белки VP1, VP2 и VP3, образуя вирион в форме икосаэдра от 20 до 24 нм в диаметре (Muzyczka and McLaughlin, 1988).

ДНК AAV имеет длину примерно в 4,7 тысяч оснований. Она содержит две открытые рамки считывания и фланкирована двумя ITR. В геноме AAV присутствуют два основных гена: rep и cap. Ген rep кодирует белки, ответственные за репликацию вирусов, тогда как cap кодирует белок капсида VP1-3. Каждый ITR образует структуру шпильки, имеющей форму Т. Эти концевые повторы являются единственными важными цис-компонентами AAV для интеграции в хромосому. Поэтому AAV можно использовать в качестве вектора при удалении всех вирусных кодирующих последовательностей и их замене кассетой генов для доставки. Идентифицированы три вирусных промотора и названы р5, р19 и р40 в соответствии с их положением на карте. Результатом транскрипции с р5 и р19 является продукция белков rep, а транскрипции с р40 приводит к продукции белков капсида (Hermonat and Muzyczka, 1984).

Существует несколько факторов, которые побуждали исследователей изучать возможность использования rAAV в качестве экспрессирующего вектора. Одним из них является то, что требований для доставки гена и интегрирования в хромосому хозяина удивительно немного. Необходимо иметь ITR длиной 145 п.н., которые составляют только 6% генома AAV. Это предоставляет место в векторе для того, чтобы скомпоновать вставку ДНК длиной 4,5 т.н. Хотя возможно такая емкость для переноса не допускает доставку посредством AAV больших генов, она достаточно подходит для доставки антисмысловых конструкций согласно данному изобретению.

AAV также является хорошим выбором среди носителей для доставки вследствие его безопасности. Существует относительно сложный механизм «спасения»: не только аденовирус дикого типа, но также и гены AAV необходимы для мобилизации rAAV. Более того, AAV не является патогенным и не связан с каким-либо заболеванием. Удаление кодирующих последовательностей вируса минимизирует иммунные реакции на экспрессию вирусных генов, и поэтому rAAV не вызывает воспалительного ответа.

4. ДРУГИЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ В КАЧЕСТВЕ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ КОНСТРУКЦИЙ.

В данном изобретении в качестве экспрессирующих конструкций для доставки олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей в клетку-хозяина можно использовать другие вирусные векторы. Можно использовать векторы, полученные на основе таких вирусов, как вирус осповакцины (Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), лентивирусы, полиовирусы и вирусы герпеса. Эти вирусы имеют несколько привлекательных для различных клеток млекопитающих особенностей (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

В связи с недавним обнаружением дефектных вирусов гепатита В получено новое представление о взаимосвязи структуры и функции различных вирусных последовательностей. Исследования in vitro показали, что вирус может сохранять способность к зависимой от хелпера упаковке и обратной транскрипции, несмотря на делецию до 80% его генома (Horwich et al., 1990). Это свидетельствует о том, что большие части генома можно заменять чужеродным генетическим материалом. Гепатотропизм и персистенция (интеграция) были особенно привлекательными свойствами для направленного переноса генов в печень. Chang et al. (1991) вводили ген хлорамфениколацетилтрансфеазы (CAT) в геном вируса гепатита В утки вместо последовательностей, кодирующих полимеразу, покрытие и предварительное покрытие. Вирус совместно трансфицировали с вирусом дикого типа в линию клеток гепатомы птиц. Культуральную среду, содержащую высокие титры рекомбинантного вируса, использовали для того, чтобы инфицировать первичные гепатоциты утенка. Была выявлена стабильная экспрессия гена САТ в течение, по меньшей мере, 24 дней после трансфекции (Chang et al., 1991).

5. НЕВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ.

Для того чтобы осуществить экспрессию олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей согласно данному изобретению, экспрессирующая конструкция должна быть доставлена в клетку. Указанную доставку можно выполнить in vitro, как при лабораторных процедурах для трансформации линий клеток, или in vivo или ex vivo, как при лечении некоторых патологических состояний. Как описано выше одним предпочтительным механизмом доставки является доставка посредством вирусной инфекции, при которой экспрессирующая конструкция инкапсулируется в инфекционную вирусную частицу.

После того как экспрессирующая конструкция доставлена в клетку нуклеиновая кислота, кодирующая требуемые олигонуклеотидные или полинуклеотидные последовательности может располагаться и экспрессироваться в разных местах. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота, кодирующая конструкцию, может быть стабильно интегрирована в геном клетки. Указанная интеграция может быть в специфичном положении и ориентации посредством гомологичной рекомбинации (замена генов) или может быть интегрирована в случайном не специфичном положении (добавление генов). В следующих вариантах нуклеиновая кислота может стабильно сохраняться в клетке в виде отдельного эписомного сегмента ДНК. Такие сегменты нуклеиновой кислоты или «эписомы» кодируют последовательности, достаточные для обеспечения сохранения и репликации независимо от клеточного цикла хозяина или синхронно с ним. Как доставляют экспрессирующую конструкцию в клетку, и где в клетке сохраняется нуклеиновая кислота, зависит от типа используемой экспрессирующей конструкции.

В некоторых вариантах изобретения экспрессирующая конструкция, содержащая одну или несколько олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, может просто состоять из «голой» рекомбинантной ДНК или плазмид. Перенос конструкции можно осуществить любым из указанных выше способов, которые физически или химически делают мембрану клеток проницаемой. В частности, это применимо для переноса in vitro, но также может быть использовано для применения in vivo. Dubensky et al. (1984) успешно инъецировали ДНК полиомавируса в форме преципитатов фосфатом кальция в печень и селезенку взрослых и новорожденных мышей, у которых при этом проявлялась активная репликация вирусов и острая инфекция. Benvenisty and Reshef (1986) также показали, что прямая внутрибрюшинная инъекция преципитированных фосфатом кальция плазмид в результате приводит к экспрессии трансфицированных генов. Предполагается, что ДНК, кодирующая представляющий интерес ген, сходным образом также может быть трансфицирована in vivo и может экспрессировать генный продукт.

Другой вариант изобретения для переноса экспрессирующей конструкции на основе «голой» ДНК в клетки может включать в себя бомбардировку частицами. Указанный способ обусловлен возможностью ускорять покрытые ДНК микроснаряды до высокой скорости, позволяющей им проходить сквозь клеточные мембраны и входить в клетки, не убивая их (Klein et al., 1987). Разработано несколько устройств для ускорения небольших частиц. Одно из таких устройств основано на высоковольтном разряде для генерирования электрического тока, который в свою очередь дает движущую силу (Yang et al., 1990). Используемые микроснаряды состояли из биологически инертных веществ, таких как шарики из вольфрама или золота.

Выбранные органы крыс и мышей, включая печень, кожу и мышечную ткань, бомбардировали in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). При этом может быть необходимо хирургическое воздействие на ткань или клетки, чтобы устранить какую-либо промежуточную ткань между стреляющим устройством и органом-мишенью, т.е. обработка ex vivo. И в этом случае ДНК, кодирующая конкретный ген, может быть доставлена посредством указанного способа и при этом быть включенной в данное изобретение.

АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ.

Конечным результатом потока генетической информации является синтез белка. ДНК транскрибируется полимеразами в матричную РНК и транслируется на рибосомах, давая упакованный функциональный белок. Таким образом, по всему пути существует несколько стадий, на которых может быть ингибирован синтез белка. Сегмент нативной ДНК, кодирующий описанный здесь полипептид, как и все подобные цепи ДНК млекопитающих, имеет две цепи: смысловую цепь и антисмысловую цепь, удерживаемые вместе водородными связями. Матричная РНК, кодирующая полипептид, имеет такую же нуклеотидную последовательность, как смысловая цепь ДНК, за исключением того, что тимидин ДНК заменен уридином. Таким образом, синтетические антисмысловые нуклеотидные последовательности будут связываться с мРНК и подавлять экспрессию белка, кодируемого этой мРНК.

Направленная доставка антисмысловых олигонуклеотидов к мишени – мРНК, таким образом, является одним из механизмов выключения синтеза белка, и, следовательно, представляет собой мощный и целенаправленный терапевтический подход. Например, синтезы полигалактауроназы и мускаринового рецептора ацетилхолина типа 2 ингибируются антисмысловыми олигонуклеотидами, направленными к соответствующим им последовательностям мРНК (патент США 5739119 и патент США 5759829, каждый специально включен здесь в виде ссылки в полном объеме). Кроме того, примеры антисмыслового ингибирования показаны для ядерного белка циклина, гена множественной лекарственной резистентности (MDG1), ICAM-1, E-селектина, STK-1, рецептора GABA_A полосатого тела и EGF человека (Jaskulski et al., 1988; Vasanthakumar and Ahmed, 1989; Peris et al., 1998; патент США 5801154; патент США 5789573; патент США 5718709 и патент США 5610288, каждая публикация специально включена здесь в виде ссылки в полном объеме). Также описаны антисмысловые конструкции, которые ингибируют и могут быть использованы для лечения различных аномалий клеточной пролиферации, например злокачественной опухоли (патент США 5747470; патент США 5591317 и патент США 5783683, каждый специально включен здесь в виде ссылки в полном объеме).

Следовательно, в иллюстративных вариантах изобретение относится к олигонуклеотидным последовательностям, которые содержат всю или часть какой-либо последовательности, которая способна специфично связываться с описанной здесь полинуклеотидной последовательностью или комплементарной ей последовательностью. В одном варианте антисмысловые олигонуклеотиды включают ДНК или ее производные. В другом варианте олигонуклеотиды содержат РНК или ее производные. В третьем варианте олигонуклеотиды представляют собой модифицированные ДНК, содержащие модифицированный остов с фосфоротиоатными связями. В четвертом варианте олигонуклеотидные последовательности содержат пептидонуклеиновые кислоты или их производные. В каждом случае предпочтительные структуры содержат район последовательности, который комплементарен и более предпочтительно в значительной степени комплементарен, и еще более предпочтительно полностью комплементарен одной или нескольким частям заявленных здесь полинуклеотидов.

Выбор антисмысловых соединений, специфичных для данной генной последовательности, основан на анализе выбранной последовательности-мишени (т.е. в данных иллюстративных примерах последовательностей крысы и человека) и определении вторичной структуры, Т_m, энергии связывания, относительной стабильности, и антисмысловые соединения выбирали на основе их относительной неспособности формировать димеры, шпильки или другие вторичные структуры, которые снижали бы или предотвращали специфичное связывание с мРНК-мишенью в клетке-хозяине.

В высокой степени предпочтительными районами мРНК являются районы, которые расположены у кодона инициации трансляции AUG или близко к нему, и те последовательности, которые в значительной степени комплементарны 5′-районам мРНК. Указанные анализы вторичной структуры и анализы, связанные с выбором сайта мишени, выполняли, используя версию 4 компьютерной программы для анализа праймеров OLIGO (Rychlik, 1997) и компьютерную программу алгоритма BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., 1997).

Также предусмотрено применение способа доставки антисмысловых последовательностей с использованием короткого пептидного вектора, названного MPG (27 остатков). Пептид MPG содержит гидрофобный домен, полученный из последовательности слияния HIV gp41, и гидрофильный домен из последовательности ядерной локализации Т-антигена SV40 (Morris et al., 1997). Показано, что несколько молекул пептида MPG покрывают антисмысловые олигонуклеотиды и могут быть доставлены в культивируемые клетки млекопитающих менее чем за 1 час с относительно высокой эффективностью (90%). Кроме того, взаимодействие с MPG сильно увеличивает как стабильность олигонуклеотида к нуклеазам, так и способность переходить через плазматическую мембрану (Morris et al., 1997).

РИБОЗИМЫ.

Хотя для катализа нуклеиновых кислот традиционно использовали белки, появился другой класс макромолекул, пригодных для такого подхода. Рибозимы представляют собой РНК-белковые комплексы, которые расщепляют нуклеиновые кислоты сайт-специфичным образом. Рибозимы имеют специфичные каталитические домены, которые обладают эндонуклеазной активностью (Kim and Cech, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster and Symons, 1987). Например, большое количество рибозимов ускоряют реакции переноса фосфоэфиров с высокой степенью специфичности, часто расщепляя только один из нескольких фосфоэфиров в олигонуклеотидном субстрате (Cech et al., 1981; Michel and Westhof, 1990; Reinhold-Hurek and Shub, 1992). Указанная специфичность объясняется тем, что необходимым условием является связывание субстрата перед химической реакцией с внутренней направляющей последовательностью («IGS») рибозима посредством специфичных взаимодействий спаривания оснований.

Сначала рибозимный катализ был обнаружен как часть специфичных для последовательности реакций расщепления/лигирования, в которые вовлечены нуклеиновые кислоты (Joyce, 1989; Cech et al., 1981). Например, в патенте США No. 5354855 (специально включенном здесь в виде ссылки) сообщается, что некоторые рибозимы могут действовать как эндонуклеазы с большей специфичностью в отношении последовательностей, чем специфичность известных рибонуклеаз, приближаясь к специфичности ферментов рестрикции ДНК. Таким образом, специфичное в отношении последовательностей опосредованное рибозимами ингибирование экспрессии генов может быть чрезвычайно полезным для терапевтических применений (Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990). Недавно сообщили, что рибозимы вызывали генетические изменения в некоторых линиях клеток, в отношении которых их использовали; измененные гены включали онкогены H-ras, c-fos и гены HIV. Большая часть этой работы включала в себя модификацию мРНК-мишени, основанную на специфичном мутантном кодоне, который расщепляется специфичным рибозимом.

В настоящее время известно шесть основных видов ферментных РНК природного происхождения. Каждый вид может катализировать гидролиз фосфодиэфирных связей РНК в trans-положении (и, таким образом, может расщеплять другие молекулы РНК) при физиологических условиях. В общем, ферментные нуклеиновые кислоты действуют сначала посредством связывания с РНК-мишенью. Такое связывание осуществляется за счет части ферментной нуклеиновой кислоты, связывающей мишень, которая имеется вблизи ферментной части молекулы, которая действует, расщепляя РНК-мишень. Таким образом, ферментная нуклеиновая кислота сначала узнает, а затем связывается с РНК-мишенью посредством комплементарного спаривания оснований, и после того, как свяжется с правильным сайтом, действует энзиматически, разрезая РНК-мишень. Расщепление в стратегически важной части такой РНК-мишени будет нарушать ее способность направлять синтез кодируемого белка. После того, как ферментная нуклеиновая кислота свяжется и расщепит свою РНК-мишень, она высвобождается от такой РНК, чтобы найти другую мишень, и может многократно связываться и расщеплять новые мишени.

Ферментная природа рибозима обладает преимуществами по сравнению со многими способами, такими как технология антисмысловых последовательностей (где молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью, чтобы блокировать ее трансляцию), так как концентрация рибозима, необходимая для того, чтобы оказать терапевтическое действие, ниже, чем концентрация антисмыслового олигонуклеотида. Это преимущество отражает способность рибозима действовать ферментативно. Таким образом, одна молекула рибозима способна расщепить много молекул РНК-мишени. Кроме того, рибозим является высоко специфичным ингибитором, со специфичностью ингибирования, обусловленным не только механизмом спаривания оснований при связывании с РНК-мишенью, но также механизмом расщепления РНК-мишени. Единственное ошибочное спаривание оснований или замена основания вблизи сайта расщепления может полностью устранить каталитическую активность рибозима. Сходные ошибочные спаривание оснований в антисмысловых молекулах не препятствуют их действию (Woolf et al., 1992). Таким образом, специфичность действия рибозима выше, чем специфичность антисмыслового олигонуклеотида, связывающегося с тем же сайтом РНК.

Молекула ферментной нуклеиновой кислоты может быть образована в виде мотива головки молота, шпильки, вируса гепатита , интрона группы I или РНК РНКазы Р (в соединении с направляющей молекулой РНК) или РНК Neurospora VS. Примеры мотивов в виде головки молота описаны Rossi et al. (1992). Примеры мотивов в виде шпильки описаны Hampel et al. (опубликованная заявка на выдачу европейского патента No. ЕР 0360257), Hampel and Tritz (1989), Hampel et al. (1990) и патенте США 5631359 (специально включенные здесь в виде ссылки). Пример мотива вируса гепатита описан Perrotta and Been (1992); пример мотива РНКазыР описан Guerrier-Takada et al. (1983); мотив рибозима РНК Neurospora VS описан Collins (Saville and Collins, 1990; Saville and Collins, 1991; Collins and Olive, 1993); и пример интрона группы I описан в патенте США 4987071 (специально включенном здесь в виде ссылки). Единственное что важно в молекуле ферментной нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению – это то, что она имеет специфичный сайт связывания субстрата, который комплементарен одному или нескольким районам РНК гена-мишени, и что она имеет нуклеотидные последовательности в этом связывающем субстрат сайте или вокруг него, которые придают молекуле активность в расщеплении РНК. Таким образом, рибозимные конструкции не нуждаются в ограничении указанными здесь специфичными мотивами.

В некоторых вариантах может быть важным получение ферментных расщепляющих средств, которые проявляют высокую степень специфичности в отношении РНК требуемой мишени, такой как одна из заявленных здесь последовательностей. Молекула ферментной нуклеиновой кислоты предпочтительно нацелена на район высококонсервативной последовательности мРНК-мишени. Такие молекулы ферментной нуклеиновой кислоты могут быть при необходимости доставлены экзогенно в конкретную клетку. Альтернативно рибозимы можно экспрессировать с ДНК- или РНК-векторов, которые доставляют в конкретные клетки. Небольшие мотивы ферментной нуклеиновой кислоты (например, структура головки молота или шпильки) также можно использовать для экзогенной доставки. Простая структура этих молекул повышает способность ферментной нуклеиновой кислоты вторгаться в выбранные в качестве мишени районы в структуре мРНК. Альтернативно каталитические молекулы РНК можно экспрессировать внутри клеток с эукариотических промоторов (например, Scanlon et al., 1991; Kashani-Sabet et al., 1992; Dropulic et al., 1992; Weerasinghe et al., 1991; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Sarver et al., 1990). Специалисты в данной области понимают, что любой рибозим можно экспрессировать в эукариотических клетках с подходящего ДНК-вектора. Активность таких рибозимов можно повысить посредством их высвобождения из первичного транскрипта вторым рибозимом (опубликованная международная заявка на выдачу патента No. WO 93/23569, и опубликованная международная заявка на выдачу патента No. WO 94/02595, при этом обе заявки включены в виде ссылки; Ohkawa et al., 1992; Taira et al., 1991; и Ventura et al., 1993).

Рибозимы можно добавлять непосредственно к клеткам-мишеням, или доставлять в комплексе с катионными липидами, липидными комплексами, упакованными в липосомы, или другим способом. РНК или РНК-комплексы можно вводить местно в соответствующие ткани ex vivo, или in vivo посредством инъекции, аэрозольной ингаляции, насоса для инфузии или стента, с включением или без включения их в биополимеры. Рибозимы можно сконструировать, как описано в опубликованной международной заявке на выдачу патента No. WO 93/23569 и опубликованной международной заявке на выдачу патента No. WO 94/02595 (каждая из которых специально включена здесь в виде ссылки) и синтезировать для тестирования in vitro и in vivo, как описано. Такие рибозимы также можно оптимизировать для доставки. Несмотря на то, что предоставлены конкретные примеры, специалисты в данной области поймут, что при необходимости можно использовать эквивалентные РНК-мишени других видов.

Укладку рибозимов в виде головки молота или шпильки можно отдельно анализировать с помощью компьютера (Jaeger et al., 1989), чтобы определить, укладываются ли последовательности рибозима в подходящую вторичную структуру. Рибозимы с неудачными внутримолекулярными взаимодействиями между связывающими плечами и каталитическим кором исключают из рассмотрения. Можно выбрать различные длины связывающего плеча, чтобы оптимизировать активность. Как правило, по меньшей мере, 5 или около этого оснований каждого плеча способны связываться или взаимодействовать другим образом с РНК-мишенью.

Рибозимы с мотивом головки молота или шпильки можно сконструировать, чтобы отжигать с различными сайтами мРНК-матрицы, и можно синтезировать химическим путем. В используемом способе синтеза придерживаются процедуры синтеза нормальной РНК, как описано в Usman et al. (1987) и в Scaringe et al. (1990), и при этом пользуются обычными группами для защиты и связывания нуклеиновых кислот, такими как диметокситритил на 5′-конце и фосфорамидиты на 3′-конце. Обычное ступенчатое связывание обычно дает выход >98%. Рибозимы, имеющие форму шпильки, можно синтезировать в виде двух частей и отжигать, чтобы реконструировать активный рибозим (Chowrira and Burke, 1992). Рибозимы можно в значительной степени модифицировать, чтобы повысить стабильность посредством модификации устойчивыми к нуклеазам группами, например, 2′-аминогруппой, 2′-С-аллилом, 2′-фтором, 2′-о-метилом, 2′-Н (для обзора смотрите, например Usman and Cedergren, 1992). Рибозимы можно очищать гель-электрофорезом, используя общепринятые способы, или жидкостной хроматографией высокого давления и ресуспендировать в воде.

Активность рибозима можно оптимизировать изменением длины связывающих плечей рибозима или химически синтезируя рибозимы с модификациями, которые предотвращают их деградацию рибонуклеазами сыворотки (смотри, например, опубликованную международную заявку на выдачу патента No. WO 92/07065; Perrault et al. 1990; Pieken et al., 1991; Usman and Cedergren, 1992; опубликованную международную заявку на выдачу патента No. WO 93/15187; опубликованную международную заявку на выдачу патента No. WO 91/03162; опубликованную заявку на выдачу европейского патента No. 92110298.4; патент США 5334711; и опубликованную международную заявку на выдачу патента No. WO 94/13688, которые описывают различные химические модификации, которые можно осуществить по отношению к компонентам молекул ферментной РНК, представленных сахарами), модификациями, которые повышают их эффективность в клетках, и исключением оснований ствола II для сокращения времени синтеза РНК и уменьшения химических требований.

Sullivan et al. (опубликованная международная заявка на выдачу патента WO 94/02595) описывает общепринятые способы доставки молекул ферментной РНК. Рибозимы можно вводить в клетки различными способами, известными тем, кто хорошо знаком с данной областью, включая, но не ограничивая этим, инкапсулирование в липосомы, посредством ионтофореза или включением в другие носители, такие как гидрогели, циклодекстрины, биодеградируемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы. При некоторых показаниях рибозимы можно непосредственно доставлять к клеткам или тканям ex vivo с вышеуказанными носителями или без них. Альтернативно комбинацию РНК/носитель можно местно доставлять прямой ингаляцией, прямой инъекцией или с использованием катетера, насоса для инфузии или стента. Другие пути доставки включают, но не ограничены этим, внутрисосудистую, внутримышечную, подкожную инъекцию или инъекцию в сустав, аэрозольную ингаляцию, пероральную (в форме таблеток или пилюль), местную, системную, глазную, внутрибрюшинную и/или подоболочечную доставку. Более подробные описания доставки рибозимов и введения даны в опубликованной международной заявке на выдачу патента No. WO 94/02595 и опубликованной международной заявке на выдачу патента No. WO 93/23569, каждая из которых специально включена здесь в виде ссылки.

Другим способом накопления высоких концентраций рибозима(ов) внутри клеток является включение последовательностей, кодирующих рибозим, в экспрессирующий ДНК-вектор. Транскрипция последовательностей рибозима управляется с промотора для эукариотической РНК-полимеразы I (pol I), РНК-полимеразы II (pol II) или РНК-полимеразы III (pol III). Транскрипты с промоторов pol II или pol III будут экспрессироваться на высоком уровне во всех клетках; уровни данного промотора pol II в данном типе клеток будут зависеть от природы присутствующих рядом регуляторных последовательностей гена (энхансеров, сайленсеров, и т.д.). Также можно использовать промоторы прокариотической РНК-полимеразы, при условии, что фермент прокариотическая РНК-полимераза экспрессируется в соответствующих клетках (Elroy-Stein and Moss, 1990; Gao and Huang, 1993; Lieber et al., 1993; Zhou et al., 1990). Рибозимы, экспрессированные с таких промоторов, могут функционировать в клетках млекопитающих (например, Kashani-Saber et al., 1992; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992 Yu et al., 1993; L’Huillier et al., 1992; Lisziewicz et al., 1993). Такие транскрипционные единицы можно включать в различные векторы для введения в клетки млекопитающих, включая, но не ограничиваясь этим, векторы на основе плазмидной ДНК, векторы на основе вирусной ДНК (такие как аденовирусные или аденоассоциированные векторы) или векторы на основе вирусной РНК (такие как векторы на основе ретровирусов, вируса леса Семлики, вируса Синдбис).

Рибозимы можно использовать в качестве диагностических средств для того, чтобы исследовать генетический дрейф и мутации в больных клетках. Рибозимы также можно использовать для оценки уровней молекул РНК-мишеней. Тесная взаимосвязь между активностью рибозима и структурой РНК-мишени позволяет определять мутации в каком-либо районе молекулы, которая изменяет спаривание оснований и трехмерную структуру РНК-мишени. При использовании многочисленных рибозимов можно картировать изменения нуклеотидов, которые важны для структуры и функции РНК in vitro, а также в клетках и тканях. Расщепление РНК-мишеней рибозимами можно использовать для ингибирования экспрессии генов и определения роли (по существу) специфичных продуктов гена в развитии заболевания. Таким образом, можно установить другие генетические мишени в качестве важных медиаторов заболевания. Эти исследования приведут к улучшению лечения при развитии заболевания посредством предоставления возможности комбинированной терапии (например, многочисленные рибозимы, мишенями которых являются разные гены, рибозимы, связанные с известными ингибиторами малых молекул, или периодическая обработка комбинациями рибозимов и/или комбинациями других химических или биологических молекул). Другие применения рибозимов in vitro хорошо известны в данной области и включают выявления наличия мРНК, ассоциированной с состоянием, связанным с IL-5. Такую РНК выявляют, определяя наличие продуктов расщепления после обработки рибозимом, используя стандартный способ.

ПЕПТИДОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ.

В некоторых вариантах авторы изобретения предполагают использование пептидонуклеиновых кислот (ПНК) в практике применения способов изобретения. ПНК представляет собой имитацию ДНК, в которой основания нуклеотидов связаны с псевдопептидным остовом (Good and Nielsen, 1997). ПНК можно использовать в ряде способов, в которых традиционно использовали РНК или ДНК. Часто последовательности ПНК проявляют большую эффективность в способах, чем соответствующие последовательности РНК или ДНК, и имеют применения, которые не свойственны РНК или ДНК. Обзор, касающийся ПНК, включая способы получения, характеристики и способы применения, приведен Corey (1997) и включен здесь в виде ссылки. По существу в некоторых вариантах можно получить последовательности ПНК, которые комплементарны одной или нескольким частям последовательности мРНК ACE, и такие соединения ПНК можно использовать для того, чтобы регулировать, изменить, уменьшить или снизить трансляцию АСЕ-специфичной мРНК, и тем самым изменить уровень активности АСЕ в клетке-хозяине, в которую такие соединения ПНК были введены.

ПНК имеют 2-аминоэтилглициновые связи вместо обычного фосфодиэфирного остова ДНК (Nielsen et al., 1991; Hanvey et al., 1992; Hyrup and Nielsen, 1996; Nielsen, 1996). Эта химическая структура имеет три важных последствия: во-первых, в противоположность ДНК или фосфоротиоатным олигонуклеотидам, ПНК являются нейтральными молекулами; во-вторых, ПНК являются нехиральными молекулами, что отменяет необходимость разработки стереоселективного синтеза; и в-третьих, при синтезе ПНК используется стандартный Boc-протокол (Dueholm et al., 1994) или Fmoc-протокол (Thomson et al., 1995) для твердофазного синтеза пептидов, хотя использовали и другие способы, включая модифицированный способ Меррифилда (Christensen et al., 1995).

Мономеры ПНК или готовые олигомеры коммерчески доступны из PerSeptive Biosystems (Framingham, MA). Синтезы ПНК по Boc- или Fmoc-протоколам являются прямыми синтезами с использованием протоколов ручного или автоматизированного синтеза (Norton et al., 1995). Протокол синтеза вручную подходит для продукции химически модифицированных ПНК или одновременного синтеза семейств близкородственных ПНК.

Как в случае с пептидным синтезом успех синтеза конкретной ПНК будет зависеть от свойств выбранной последовательности. Например, хотя теоретически ПНК могут включать любые комбинации нуклеотидных оснований, присутствие близлежащих пуринов может привести к делециям одного или нескольких остатков в продукте. В ожидании указанной трудности, предполагается, что при получении ПНК с близлежащими пуринами следует повторить связывание остатков, которые возможно будут присоединяться неэффективно. После этого должна следовать очистка ПНК обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (Norton et al., 1995), обеспечивающей выходы и чистоту продукта, сходные с таковыми, наблюдаемыми во время синтеза пептидов.

Модификации ПНК для данного применения можно выполнить связыванием аминокислот во время твердофазного синтеза или связыванием компонентов, которые содержат группу карбоновой кислоты, с открытым N-концевым амином. Альтернативно ПНК можно модифицировать после синтеза связыванием с введенным лизином или цистеином. Простота, с которой можно модифицировать ПНК, облегчает оптимизацию для лучшей растворимости или для специфичных функциональных требований. После того, как ПНК синтезированы, идентичность ПНК и их производных можно подтвердить масс-спектрометрией. В нескольких исследованиях были произведены и использованы модификации ПНК (Norton et al., 1995; Haaima et al., 1996; Stetsenko et al., 1996; Petersen et al., 1995; Ulmann et al., 1996; Koch et al., 1995; Orum et al., 1995; Footer et al., 1996; Griffith et al., 1995; Kremsky et al., 1996; Pardridge et al., 1995; Boffa et al., 1995; Landsdorp et al., 1996; Gambacorti-Passerini et al., 1996; Armitage et al., 1997; Seeger et al., 1997; Ruskowski et al., 1997). В патенте США No. 5700922 обсуждаются химерные молекулы ПНК-ДНК-ПНК и их применения в диагностике, модулировании белка в организмах и лечении состояний, поддающихся терапии.

В отличие от ДНК и РНК, которые содержат отрицательно заряженные связи, остов ПНК нейтрален. Несмотря на это существенное изменение, ПНК узнают комплементарные ДНК и РНК посредством образования пар Уотсона-Крика (Egholm et al., 1993), подтверждая начальное моделирование Nielsen et al. (1991). ПНК не имеют полярности от 3′ к 5′-концу и могут связываться либо параллельным, либо антипараллельным образом, при этом антипараллельный способ предпочтителен (Egholm et al., 1993).

Гибридизация ДНК-олигонуклеотидов с ДНК и РНК дестабилизируется электростатическим отталкиванием между отрицательно заряженными фосфатными остовами комплементарных нитей. В противоположность этому отсутствие отталкивания зарядов в дуплексах ПНК-ДНК или ПНК-РНК увеличивает температуру плавления (Т_m) и уменьшает зависимость Т_m от концентрации моно- и дивалентных катионов (Nielsen et al., 1991). Повышенная скорость и аффинность гибридизации имеют важное значение, поскольку они отвечают за удивительную способность ПНК осуществлять инвазию комплементарных последовательностей в релаксированную двунитевую ДНК. Кроме того, эффективная гибридизация в инвертированных повторах свидетельствует о том, что ПНК могут эффективно узнавать вторичную структуру в двунитевой ДНК. Лучшее узнавание также имеет место в случае с ПНК, иммобилизованными на поверхностях, и Wang et al. показали, что связанные с подложкой ПНК можно использовать для выявления событий гибридизации (Wang et al., 1996).

Можно ожидать, что прочное связывание ПНК с комплементарными последовательностями также будет увеличивать связывание со сходными (но не идентичными) последовательностями, снижая специфичность ПНК в узнавании последовательностей. Однако, как и в случае ДНК-гибридизации, избирательного узнавания можно достичь, выбирая длину олигомера и температуру инкубации. Кроме того, избирательной гибридизации ПНК способствует то, что ПНК-ДНК-гибридизация является менее толерантной к ошибочному спариванию оснований, чем ДНК-ДНК-гибридизация. Например, единственное ошибочное спаривание в пределах дуплекса ПНК-ДНК длиной 16 п.н. может снижать T_m на величину вплоть до 15⁰С (Egholm et al., 1993). Такой высокий уровень распознавания позволил разработать несколько стратегий на основе ПНК для анализа точечных мутаций (Wang et al., 1996; Carlsson et al., 1996; Thiede et al., 1996; Webb and Hurskainen, 1996; Perry-O’Keefe et al., 1996).

Высокоаффинное связывание предоставляет явные преимущества для молекулярного распознавания и разработки новых применений ПНК. Например, ПНК из 11-13 нуклеотидов ингибирует активность теломеразы, рибонуклеопротеида, который удлиняет теломерные концы, используя основную РНК-матрицу, в то время как аналогичные ДНК-олигомеры этого не делают (Norton et al., 1996).

Нейтральные ПНК более гидрофобны, чем аналогичные ДНК-олигомеры, и это может приводить к трудности их растворения при нейтральном рН, особенно если ПНК имеют высокое содержание пурина, или если они обладают возможностью формировать вторичные структуры. Растворимость ПНК можно повысить присоединением одного или нескольких положительных зарядов к концам ПНК (Nielsen et al., 1991).

Данные Allfrey и соавторов свидетельствуют о том, что инвазия нити в последовательности в хромосомной ДНК происходит спонтанно (Boffa et al., 1995; Boffa et al., 1996). В этих исследованиях ПНК нацеливали на мишень, представляющую собой повторы триплетов из нуклеотидов CAG, и использовали это распознавание для того, чтобы очистить транскрипционно активную ДНК (Boffa et al., 1995) и ингибировать транскрипцию (Boffa et al., 1996). Полученный результат свидетельствует о том, что в том случае, если ПНК можно доставить в клетки, они будут способны выполнять роль основных специфичных для последовательности регуляторов экспрессии генов. Исследования и обзоры, касающиеся применения ПНК в качестве антисмысловых и антигенных агентов, включают работы Nielsen et al. (1993b), Hanvey et al., (1992) и Good and Nielsen (1997). Koppelhus et al. (1997) использовали ПНК для того, чтобы ингибировать обратную транскрипцию HIV-1, показав, что ПНК можно использовать для антивирусной терапии.

Способы получения характеристик связывающих свойств ПНК в отношении антисмысловых последовательностей обсуждаются в Rose (1993) и Jensen et al. (1997). Rose использовал капиллярный гель-электрофорез для того, чтобы определить связывание ПНК с комплементарным им олигонуклеотидом, измеряя относительную кинетику связывания и стехиометрию. Сходные виды измерений были сделаны Jensen et al. с использованием технологии BIAcore^TM.

Другие применения ПНК включают применение для инвазии нитей ДНК (Nielsen et al., 1991), антисмыслового ингибирования (Hanvey et al., 1992), мутационного анализа (Orum et al., 1993), энхансеров транскрипции (Mollegaard et al., 1994), очистки нуклеиновых кислот (Orum et al., 1995), выделения транскрипционно активных генов (Boffa et al., 1995), блокирования связывания факторов транскрипции (Vickers et al., 1995), расщепления генома (Veselkov et al., 1996), биосенсоров (Wang et al., 1996) гибридизации in situ (Thisted et al., 1996) и в качестве альтернативы Саузерн-блоттингу (Perry-O’Keefe, 1996).

ПОЛИПЕПТИДНЫЕ КОМПОЗИЦИИ.

В других аспектах данное изобретение относится к полипептидным композициям. В общем полипептидом согласно изобретению будет изолированный полипептид (или его эпитоп, вариант, или активный фрагмент), полученный из видов млекопитающих. Предпочтительно полипептид кодируется заявленной здесь полинуклеотидной последовательностью или последовательностью, которая в условиях умеренной жесткости гибридизуется с заявленной здесь полинуклеотидной последовательностью. Альтернативно полипептид можно определить как полипептид, который содержит последовательность непрерывно следующих друг за другом аминокислот из заявленной здесь аминокислотной последовательности, или полипептид, который содержит полную заявленную здесь аминокислотную последовательность.

В данном изобретении также подразумевается, что полипептидная композиция включает в себя один или несколько полипептидов, которые иммунологически реактивны по отношению к антителам, выработанным против полипептида согласно изобретению, в частности, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 176, 179, 181, 469-473, 475, 485, 487 и 488, или его активные фрагменты, или варианты, или биологически функциональные эквиваленты.

Сходным образом подразумевается, что полипептидная композиция согласно данному изобретению содержит один или несколько полипептидов, которые способны вызывать появление антител, которые иммунологически реагируют с одним или несколькими полипептидами, кодируемыми одним или несколькими непрерывными последовательностями нуклеиновых кислот, которые входят в состав SEQ ID NO: 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 и 489; или их активными фрагментами, или вариантами, или одной или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот, которые в условиях от умеренной до высокой жесткости гибридизуются с одной или несколькими указанными последовательностями. В частности, приведенные для иллюстрации полипептиды содержат аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 176, 179, 181, 469-473, 475, 485, 487 и 488.

В используемом здесь смысле активный фрагмент полипептида включает в себя полный или часть полипептида, который модифицирован традиционными способами, например, мутагенезом, или присоединением, делецией или заменой, но при этом активный фрагмент в значительной степени демонстрирует такую же структуру, функцию, антигенность и т.д., как и описанный здесь полипептид.

В некоторых иллюстративных вариантах полипептиды согласно изобретению будут содержать, по меньшей мере, иммуногенную часть белка опухоли молочной железы или его вариант, которые здесь описаны. Как указано выше «белок опухоли молочной железы» является белком, который экспрессируется клетками опухоли молочной железы. Белки, которые являются белками опухоли молочной железы, при иммуноанализе (таком как ELISA) также реагируют на выявленном уровне с антисывороткой от пациента с раком молочной железы. Описанные здесь полипептиды могут иметь любую длину. Могут присутствовать дополнительные последовательности, полученные из нативного белка, и/или гетерологичные последовательности, и такие последовательности могут (но не обязательно) обладать дополнительными иммуногенными или антигенными свойствами.

«Иммуногенная часть» в используемом здесь смысле представляет собой часть белка, которую узнает (т.е. специфично связывает) поверхностный рецептор антигенов В-клетки и/или Т-клетки. Такие иммуногенные части обычно содержат, по меньшей мере, 5 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере, 10, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 20 аминокислотных остатков белка опухоли молочной железы или его варианта. Некоторые предпочтительные иммуногенные части включают пептиды, в которых была делетирована N-концевая лидерная последовательность и/или трансмембранный домен. Другие предпочтительные иммуногенные части могут содержать небольшую N- и/или С-концевую делецию (например, 1-30 аминокислот, предпочтительно 5-15 аминокислот), относительно зрелого белка.

Иммуногенные части, как правило, можно идентифицировать, используя хорошо известные способы, такие как способы, суммированные в Paul, Fundamental Immunology, 3^rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993) и цитированных в этой работе ссылках. Такие способы включают скрининг полипептидов по их способности реагировать с антиген-специфичными антителами, антисывороткой и/или линиями или клонами Т-клеток. В используемом здесь смысле антисыворотка и антитела являются «антиген-специфичными», если они специфично связываются с антигеном (т.е. они реагируют с белком при ELISA или другом иммуноанализе и не реагируют на выявленном уровне с неродственными белками). Такие антисыворотки и антитела можно получить, как здесь описано и используя хорошо известные способы. Иммуногенной частью нативного белка опухоли молочной железы является часть, которая реагирует с такой антисывороткой и/или Т-клетками на таком уровне, который не существенно ниже, чем реактивность полипептида полной длины (например, в ELISA и/или в анализе реактивности Т-клеток). Такие иммуногенные части могут реагировать в таких анализах на уровне, который сходен или выше, чем реактивность полипептида полной длины. Обычно такие скрининговые исследования можно проводить, используя способы, хорошо известные специалистам в данной области, такие как способы, описанные в Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Например, полипептид можно иммобилизовать на твердом носителе и осуществить его контакт с сывороткой пациента, чтобы обеспечить связывание антител в сыворотке с иммобилизованным полипептидом. Затем не связавшуюся сыворотку можно удалить и связавшиеся антитела выявить с использованием, например, ¹²⁵I-меченого белка А.

Как указано выше композиция может содержать вариант нативного белка опухоли молочной железы. В используемом здесь смысле «вариант» полипептида представляет собой полипептид, который отличается от нативного белка опухоли молочной железы одним или несколькими замещениями, делециями, присоединениями и/или инсерциями, так что иммуногенность полипептида существенно не снижается. Другими словами, способность варианта реагировать с антиген-специфичной антисывороткой по сравнению с нативным белком может быть усилена или остаться неизменной, или может быть снижена менее чем на 50%, и предпочтительно менее чем на 20% относительно нативного белка. Обычно такие варианты можно идентифицировать, модифицируя одну из указанных выше полипептидных последовательностей и оценивая реактивность модифицированного полипептида с антиген-специфичными антителами или антисыворотками, как здесь описано. Предпочтительные варианты включают такие варианты, в которых одна или несколько частей, таких как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Другие предпочтительные варианты включают варианты, в которых небольшая часть (например, 1-30 аминокислот, предпочтительно 5-15 аминокислот) были удалены из N- и/или С-конца зрелого белка.

Варианты полипептидов, охватываемые данным изобретением включают варианты, проявляющие, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или большую идентичность (определенную как описано выше) с заявленными здесь полипептидами.

Предпочтительно вариант содержит консервативные замены. «Консервативная замена» представляет собой замену, при котором аминокислота заменена другой аминокислотой, которая имеет сходные свойства, так чтобы специалист в области химии пептидов мог бы ожидать, что вторичная структура и гидропатическая природа полипептида существенно не изменится. Как правило, замены аминокислот можно сделать на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с группами незаряженных полярных головок, имеющие сходные значения гидрофильности, включают лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глутамин; и серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Другие группы аминокислот, которые могут давать консервативные изменения, включают: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; и (5) phe, tyr, trp, his. Вариант может также или альтернативно содержать неконсервативные изменения. В предпочтительном варианте варианты полипептидов отличаются от нативной последовательности заменой, делецией или присоединением пяти аминокислот или меньше. Варианты могут быть также (или альтернативно) модифицированы, например, делецией или присоединением аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на иммуногенность, вторичную структуру и гидропатическую природу полипептида.

Как указано выше полипептиды могут содержать сигнальную (или лидерную) последовательность на N-конце белка, которая котрансляционно или посттрансляционно направляет перенос белка. Полипептид также можно конъюгировать с линкерной или другой последовательностью для облегчения синтеза, очистки или идентификации полипептида (например, поли-His), или для того, чтобы усилить связывание полипептида с твердым носителем. Например, полипептид можно конъюгировать с районом Fc иммуноглобулина.

Полипептиды можно получить, используя любой из множества хорошо известных способов. Рекомбинантные полипептиды, кодируемые последовательностями ДНК, которые описаны выше, легко можно получить из последовательностей ДНК, используя любой из множества экспрессирующих векторов, известных специалистам в данной области. Экспрессии можно добиться в любой подходящей клетке-хозяине, которая была трансформирована или трансфицирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу ДНК, которая кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящие клетки-хозяева включают прокариоты, дрожжи и клетки высших эукариотов, такие как клетки млекопитающих и клетки растений. Предпочтительно используемыми клетками-хозяевами являются E. coli, дрожжи или линия клеток млекопитающих, такая как COS или CHO. Надосадки подходящих систем хозяин/вектор, которые секретируют рекомбинантный белок или полипептид в культуральную среду, можно сначала концентрировать, используя коммерчески доступный фильтр. После концентрирования концентрат можно нанести на подходящую матрицу для очистки, такую как аффинную матрицу, или ионообменную смолу. Наконец одну или несколько стадий обращенно-фазовой ВЭЖХ можно использовать для дальнейшей очистки рекомбинантного полипептида.

Части и другие варианты, имеющие примерно менее 100 аминокислот, и обычно примерно менее 50 аминокислот, также можно получить синтетическими способами, используя технологии, хорошо известные специалистам в данной области. Например, такие полипептиды можно синтезировать, используя любые коммерчески доступные твердофазные способы, такие как способ твердофазного синтеза Меррифилда, при котором аминокислоты последовательно присоединяют к растущей аминокислотной цепи. Смотри, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. Оборудование для автоматизированного синтеза полипептидов доступно для приобретения от таких поставщиков, как Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), и с ним можно работать согласно инструкциям производителей.

В некоторых конкретных вариантах полипептид может представлять собой гибридный белок, который содержит составные полипептиды, которые здесь описаны, или который содержит, по меньшей мере, один полипептид, который здесь описан, и не родственную последовательность, такую как известный белок опухоли. Партнер при слиянии может, например, принимать участие в предоставлении Т-хелперных эпитопов (иммунологический партнер в гибриде), предпочтительно Т-хелперные эпитопы, узнаваемые организмом человека, или может содействовать экспрессии белка (энхансер экспрессии) с более высоким выходом, чем для нативного рекомбинантного белка. Некоторыми предпочтительными партнерами при слиянии являются как иммунологические, так и усиливающие экспрессию партнеры при слиянии. Другие партнеры при слиянии можно выбрать так, чтобы увеличить растворимость белка или обеспечить возможность целенаправленной доставки белка в необходимые внутриклеточные компартменты. Еще одни партнеры при слиянии включают аффинные метки, которые облегчают очистку белка.

Гибридные белки, как правило, можно получить, используя стандартные способы, включая химическое связывание. Предпочтительно гибридный белок экспрессируется в виде рекомбинантного белка, обеспечивая в экспрессирующей системе продукцию повышенных уровней относительно не гибридного белка. Коротко, последовательности ДНК, кодирующие компоненты полипептида, могут быть скомпонованы отдельно, или лигированы в соответствующем векторе экспрессии. 3′-Конец последовательности ДНК, кодирующей один компонент полипептида, лигируют с помощью пептидного линкера или без него с 5′-концом последовательности ДНК, кодирующей второй компонент полипептида, так чтобы рамки считывания последовательностей находились в фазе. Это обеспечивает возможность для трансляции единого гибридного белка, который сохраняет биологическую активность обоих компонентов полипептидов.

Можно использовать последовательность пептидного линкера, чтобы разделить первый и второй компоненты полипептида на расстояние, достаточное для того, чтобы обеспечить укладку каждого полипептида во вторичную и третичную структуры. Такую последовательность пептидного линкера включают в гибридный белок, используя стандартные способы, хорошо известные в данной области. Подходящие последовательности пептидных линкеров можно выбрать на основе следующий факторов: (1) их способности принимать гибкую удлиненную конформацию; (2) их неспособности принимать вторичную структуру, которая может взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептидах; и (3) отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могут реагировать с функциональными эпитопами полипептида. Предпочтительные последовательности пептидного линкера содержат остатки Gly, Asn и Ser. В линкерной последовательности также можно использовать другие близкие к нейтральным аминокислоты, такие как Thr и Ala. Аминокислотные последовательности, которые могут быть успешно использованы в качестве линкеров, включают последовательности, приведенные в Maratea et al., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; патенте США No. 4935233 и патенте США No. 4751180. Обычно линкерная последовательность может иметь длину от 1 до приблизительно 50 аминокислот. Линкерные последовательности не требуются, когда первый и второй полипептиды имеют не существенные N-концевые районы аминокислот, которые можно использовать для разделения функциональных доменов и предотвращения стерических помех.

Лигированные последовательности ДНК функционально связаны с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами. Регуляторные элементы, ответственные за экспрессию ДНК, локализованы только с 5′-стороны относительно последовательности ДНК, кодирующей первые полипептиды. Сходным образом, стоп-кодоны, требуемые для окончания трансляции, и сигналы терминации транскрипции присутствуют только с 3′-стороны по отношению к последовательности ДНК, кодирующей второй полипептид.

Также предоставляются гибридные белки. Такие белки содержат полипептид, который здесь описан, вместе с неродственным иммуногенным белком. Предпочтительно иммуногенный белок способен вызывать вторичный иммунный ответ. Примеры таких белков включают белки столбняка, туберкулеза и гепатита (смотри, например, Stoute et al. New Engl. J. Med., 336: 86-91, 1997).

В предпочтительных вариантах иммунологический партнер для слияния получают из белка D, поверхностного белка грам-отрицательной бактерии Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Предпочтительно производное белка D содержит примерно первую треть белка (например, первые N-концевые 100-110 аминокислот), и производное белка D можно связывать с липидом. В некоторых предпочтительных вариантах первые 109 остатков партнера в слиянии, полученного из липопротеида D, помещают на N-конец, чтобы обеспечить полипептид дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и чтобы увеличить уровень экспрессии в E. coli (таким образом, партнер функционирует при этом как усилитель экспрессии). Липидный хвост обеспечивает оптимальную презентацию антигена антиген-презентирующим клеткам. Другие партнеры для слияния включают не структурные белки вируса гриппа, NS1 (гемагглютинин). Обычно используют 81 N-концевых аминокислот, хотя можно использовать различные фрагменты, которые включают в себя Т-хелперные эпитопы.

В другом варианте иммунологическим партнером при слиянии является белок, известный как LYTA, или его часть (предпочтительно С-концевая часть). LYTA получают из Streptococcus pneumoniae, которая синтезирует N-ацетил-L-аланинамидазу, известную как амидаза LYTA (кодируемая геном LytA; Gene 43: 265-292, 1986). LYTA является аутолизином, который специфично вызывает деградацию некоторых связей в основной цепи пептидогликана. С-концевой домен белка LYTA ответственен за аффинность к холину или некоторым аналогам холина, таким как DEAE. Это свойство использовали для разработки экспрессирующих плазмид C-LYTA E. coli, пригодных для экспрессии гибридных белков. Описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент C-LYTA на аминоконце (смотри Biotechnology 10: 795-798, 1992). В предпочтительном варианте в гибридный белок может быть включена часть повтора LYTA. Часть повтора обнаружена в С-концевом районе, начиная с остатка 178. Особенно предпочтительная часть повтора содержит остатки 188-305.

В общем, описанные здесь полипептиды (включая гибридные белки) или полинуклеотиды являются изолированными. «Изолированный» полипептид или полинуклеотид представляет собой полипептид или полинуклеотид, который был удален из своего исходного окружения. Например, белок природного происхождения является изолированным, если его отделяют от некоторых или от всех совместно присутствующих в природной системе материалов. Предпочтительно чистота таких полипептидов составляет, по меньшей мере, около 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, около 95% и наиболее предпочтительно чистота составляет, по меньшей мере, около 99%. Полинуклеотид считается изолированным, если его, например, клонируют в векторе, который не является частью природного окружения.

Для того чтобы повысить антигенность и/или иммуногенность белков опухоли молочной железы согласно данному изобретению можно получить гибридные белки, содержащие антигенные и/или иммуногенные части двух или более белков опухоли молочной железы. Примеры гибридных белков опухоли молочной железы можно получить обычным методом рекомбинантной ДНК, комбинируя последовательность ДНК, кодирующую маммаглобин, с последовательностью ДНК, кодирующей либо (1) объединенные «левую» и «правую» ORF B726P (SEQ ID NO: 490); (2) «левую» ORF B726P (SEQ ID NO: 491); и/или (3) «правую» ORF B726P (SEQ ID NO: 492). Смотри, например, Ausubel, F.M. et al. “Short Protocols in Molecular Biology” (4^nd ed. 1999); включенную здесь в виде ссылки в полном объеме). Примеры гибридных белков указаны здесь в SEQ ID NO: 493 (маммаглобин – объединенная ORF B726P), SEQ ID NO: 494 (маммаглобин – «левая» ORF B726P) и SEQ ID NO: 495 (маммаглобин – «правая» ORF B726P). Последовательность ДНК, кодирующая маммаглобин, изображена здесь нуклеотидами 1-279 SEQ ID NO: 490-492, а соответствующая аминокислотная последовательность маммаглобина изображена здесь аминокислотами 1-93 SEQ ID NO: 493-495. Смотри также патент США No. 5668267; патент США No. 5922836; патент США No. 5855889; патент США No. 5968754; и патент США No. 6004756, каждый из указанных патентов США включен здесь в виде ссылки в полном объеме.

Кроме приведенных в качестве примеров гибридных белков, полученных слиянием района, кодирующего маммаглобин полной длины, с различными кодирующими районами B726P данное изобретение также относится к гибридным белкам, содержащим иммуногенные части из 9 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот либо из одного из двух, либо из обоих белков – маммаглобина и B726P. Более предпочтительно иммуногенные части могут представлять собой 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот либо из одного из двух, либо из обоих белков – маммаглобина и/или B726P. Альтернативно иммуногенные части могут представлять собой, по меньшей мере, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 250, 500, или 1095 непрерывно следующих друг за другом аминокислот либо из одного из двух, либо из обоих белков – маммаглобина и/или B726P, или также могут включать в себя любое целое число аминокислот от 20 до 1095 непрерывно следующих друг за другом аминокислот либо из одного из двух, либо из обоих белков – маммаглобина и/или B726P.

Типичные иммуногенные части маммаглобина описаны в поданной для совместного рассмотрения заявке на выдачу патента США 60/136528. Примеры иммуногенных частей включают следующие пептидные последовательности маммаглобина:IDELKECFLNQTDETLSNVE (аминокислоты 59-78 SEQ ID NO: 493); TTNAIDELKECFLNQ (аминокислоты 55-69 SEQ ID NO: 493); SQHCYAGSGCPLLENVISKTI (аминокислоты 13-33 SEQ ID NO: 493); EYKELLQEFIDDNATTNAID (аминокислоты 41-60 SEQ ID NO: 493) и/или KLLMVLMLA (аминокислоты 2-10 SEQ ID NO: 493). Другие предпочтительные эпитопы включают в себя сайт гликозилирования маммаглобина. Такие эпитопы, в частности, пригодны для создания антител, которые специфично связываются с гликозилированным маммаглобином. Два таких сайта представляют собой N-связанные сайты гликозилирования аспарагин (Asp)-53 (QEFIDDNATTNAI; аминокислоты 47-59 SEQ ID NO: 493) и Asp-68 (LKECFLNQTDETL; аминокислоты 62-74 SEQ ID NO: 493).

В данном изобретении также предполагается, что в гибридных белках маммаглобин-В726Р может найти применение широкое множество иммуногенных частей из объединенных, «левой» и/или «правой» аминокислотных последовательностей В726Р. Например, особенно подходящий гибридный белок маммаглобин-B726P можно получить слиянием маммаглобина с «правым» эпитопом B726P, узнаваемым B726P-специфичными клонами CTL, описанными здесь в примере 4, и указанный эпитоп входит в состав N-конца «правого» района B726P (т.е. аминокислоты 1-129 SEQ ID NO: 176).

Специалистам в данной области будет понятно, что точную аминокислотную последовательность и первичное расположение последовательности частей маммаглобина и/или B726P гибридных белков можно варьировать, не выходя за рамки данного изобретения. Например, можно осуществить консервативные аминокислотные замены либо в одной из двух, либо в обеих частях – маммаглобине или B726P, например, чтобы добиться того, чтобы гибридные белки обладали улучшенными свойствами, такими как повышенная стабильность белка и/или иммуногенность. Кроме того, в данном изобретении предполагается, что часть маммаглобина можно слить либо с N-концом, либо с С-концом части B726P, чтобы добиться того, чтобы гибридные белки обладали требуемыми антигенными и/или иммуногенными свойствами.

Гибридные белки согласно данному изобретению, в качестве примера которых приведены гибридные белки маммаглобин-B726P, описанные здесь данным примером, найдут применение в качестве вакцин против злокачественных опухолей, реагентов для терапевтических средств на основе антител и/или в различных диагностических анализах. Предполагается, что указанные гибридные белки будут обладать улучшенными антигенными и/или иммуногенными свойствами по сравнению только либо с маммаглобином и/или белком B726P.

СВЯЗЫВАЮЩИЕ АГЕНТЫ.

Данное изобретение, кроме того, относится к таким агентам, как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с белком опухоли молочной железы. В используемом здесь смысле говорят, что антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент «специфично связывается» с белком опухоли молочной железы, если оно реагирует на выявляемом уровне,(например, при ELISA) с белком опухоли молочной железы, но не реагирует на регистрируемом уровне с неродственными белками в сходных условиях. В используемом здесь смысле «связывание» относится к нековалентной ассоциации между двумя отдельными молекулами, так что формируется комплекс. Способность связываться можно оценить, например, определяя константу связывания для образования комплекса. Константа связывания представляет собой значение, полученное при делении концентрации комплекса на произведение концентраций компонентов. В общем, в контексте данного изобретения говорят, что два соединения «связываются» в том случае, когда константа связывания для образования комплекса превышает примерно 10³ л/моль. Константу связывания можно определить, используя способы, хорошо известные в данной области.

Связывающие агенты, кроме того, позволяют устанавливать различия между пациентами, не имеющими злокачественной опухоли и имеющими злокачественную опухоль, такую как рак молочной железы, используя предоставляемые здесь репрезентативные анализы. Другими словами, антитела и другие связывающие агенты, которые связываются с белком опухоли молочной железы, будут генерировать сигнал, свидетельствующий о наличии злокачественной опухоли, по меньшей мере, примерно у 20% пациентов с заболеванием, и будут генерировать отрицательный сигнал, свидетельствующий об отсутствии болезни, по меньшей мере, у 90% субъектов, не имеющих злокачественной опухоли. Чтобы определить удовлетворяет ли связывающий агент этому требованию, биологические образцы (например, кровь, сыворотку, мокроту, мочу и/или биопсии опухоли) от пациентов, имеющих или не имеющих злокачественной опухоли (которую определяют с использованием стандартных клинических тестов), можно анализировать, как здесь описано, на наличие полипептидов, которые связываются со связывающим агентом. Будет очевидно, что следует анализировать статистически значимое количество образцов при наличии заболевания и при его отсутствии. Каждый связывающий агент должен удовлетворять указанным выше критериям; однако, специалисты в данной области поймут, что связывающие агенты можно использовать в комбинации, чтобы повысить чувствительность.

Любой агент, который удовлетворяет указанным выше требованиям, может быть связывающим агентом. Например, связывающим агентом может быть рибосома при наличии или без пептидного компонента, молекула РНК или полипептид. В предпочтительном варианте связывающим агентом является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела можно получить любым из множества способов, известных специалистам в данной области. Смотри, например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. В общем, антитела можно получать посредством технологии культур клеток, включая создание моноклональных антител, как здесь описано, или посредством трансфекции генов антител в подходящие клетки-хозяева бактерий или млекопитающих для того, чтобы обеспечить продукцию рекомбинантных антител. В одном способе иммуноген, содержащий полипептид, сначала инъецируют любому из широкого круга млекопитающих (например, мышам, крысам, кроликам, овцам или козам). На этой стадии полипептиды согласно изобретению могут служить в качестве иммуногена без модификации. Альтернативно особенно для относительно коротких полипептидов больший иммунный ответ можно вызвать в том случае, если полипептид связан с белком-носителем, таким как бычий сывороточный альбумин или гемоцианин морского блюдечка «замочная скважина». Иммуноген инъецируют животному-хозяину, предпочтительно в соответствии с предварительно определенным режимом, включая одну или несколько бустер-иммунизаций, и у животных периодически берут кровь. Затем поликлональные антитела, специфичные для полипептида, можно очистить из такой сыворотки, например, аффинной хроматографией, используя полипептид, связанный с подходящим твердым носителем.

Моноклональные антитела, специфичные для представляющего интерес антигенного полипептида, можно, например, получить, используя способ Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, и его модификации. Коротко, указанные способы включают в себя подготовку иммортализованных линий клеток, способных продуцировать антитела, имеющие требуемую специфичность (т.е. реактивность по отношению к представляющему интерес полипептиду). Такие линии клеток можно, например, получить из клеток селезенки, полученных от животных, иммунизированных, как описано выше. Затем клетки селезенки иммортализуют, например, слиянием с гибридным партером – клетками миеломы, предпочтительно партнером, который является сингенным по отношению к иммунизированному животному. Можно использовать множество технологий слияния. Например, клетки селезенки и клетки миеломы можно смешать с неионным детергентом на несколько минут и затем поместить при низкой плотности на селективной среде, которая поддерживает рост гибридных клеток, но не клеток миеломы. В предпочтительном способе селекции используют HAT-селекцию (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). По истечении достаточного периода времени, обычно примерно от 1 до 2 недель, наблюдают колонии гибридов. Собирают отдельные колонии и надосадки их культур тестируют в отношении связывающей способности, направленной против полипептида. Предпочтительны гибридомы, обладающие высокой реактивностью и специфичностью.

Моноклональные антитела можно выделять из надосадков растущих колоний гибридомы. Кроме того, можно использовать различные способы, чтобы повысить выход, такие как инъекции линии клеток гибридомы в брюшную полость подходящего хозяина – позвоночного, такого как мышь. Затем моноклональные антитела можно собрать из асцитной жидкости или крови. Загрязнения можно удалить из антител традиционными способами, такими как хроматография, гель-фильтрация, преципитация и экстракция. Полипептиды согласно данному изобретению можно использовать в процессе очистки, например на стадии аффинной хроматографии.

В некоторых вариантах может быть предпочтительным применение антигенсвязывающих фрагментов антител. Такие фрагменты включают Fab-фрагменты, которые можно получить, используя стандартные способы. Коротко, иммуноглобулины можно очистить из сыворотки кролика аффинной хроматографией на колонках с шариками с белком А (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) и расщепить папаином, получая фрагменты Fab и Fc. Фрагменты Fab и Fc можно разделить аффинной хроматографией на колонках с шариками, содержащими белок А.

Моноклональные антитела согласно данному изобретению можно связать с одним или несколькими терапевтическими средствами. Подходящие в этом отношении средства включают радионуклиды, индукторы дифференцировки, лекарственные средства, токсины и их производные. Предпочтительные радионуклиды включают ⁹⁰Y, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹¹At и ²¹²Bi. Предпочтительные лекарственные средства включают метотрексат и аналоги пиримидина и пурина. Предпочтительные индукторы дифференцировки включают сложные форболовые эфиры и масляную кислоту. Предпочтительные токсины включают рицин, абрин, дифтерийный токсин, холерный токсин, гелонин, экзотоксин Pseudomonas, токсин Shigella и антивирусный белок лаконоса.

Терапевтическое средство может быть связано (например, ковалентно связано) с подходящим моноклональным антителом либо прямо, либо опосредованно (например, через линкерную группу). Прямая реакция между средством и антителом возможна в том случае, когда каждый из них имеет заместитель, способный реагировать с другим заместителем. Например, нуклеофильная группа, такая как амино- или сульфгидрильная группа, на одном реагенте может быть способна реагировать с группой, содержащей карбонил, такой как ангидрид или галогенангидрид, или с алкильной группой, содержащей легко удаляемую группу (например, галид) на другом. Альтернативно может быть желательным связывание терапевтического средства и антитела посредством линкерной группы. Линкерная группа может функционировать как спейсер, чтобы расположить антитело на расстоянии от средства, чтобы не мешать связывающей способности. Линкерная группа также может служить для того, чтобы увеличить химическую реакционную способность заместителя на средстве или антителе, и таким образом увеличить эффективность связывания. Увеличение химической реакционной способности также может способствовать применению средств, или функциональных групп лекарственных средств, которое иначе не возможно.

Специалистам в данной области будет очевидно, что в качестве линкерной группы можно использовать ряд бифункциональных или полифункциональных реагентов, как гомо-, так и гетеро-функциональных (таких как реагенты, описанные в каталоге Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Связывание можно, например, осуществить, через аминогруппы, карбоксильные группы, сульфгидрильные группы или остатки окисленного углевода. Имеются многочисленные ссылки, описывающие такой способ, например, патент США No. 4671958, Rodwell et al.

В тех случаях, когда терапевтическое средство более эффективно, когда оно не содержит части иммуноконъюгатов согласно данному изобретению, представленной антителом, желательным может быть применение линкерной группы, которая расщепляется во время или после интернализации в клетку. Описан ряд разных расщепляемых линкерных групп. Механизмы внутриклеточного высвобождения средства от таких линкерных групп включают расщепление посредством восстановления дисульфидной связи (например, патент США No. 4489710, Spitler), облучением фотолабильной связи (например, патент США No. 4625014, Senter et al.), гидролизом боковых цепей дериватизированных аминокислот (например, патент США No. 4638045, Kohn et al.), гидролизом, опосредованным комплементом сыворотки (например, патент США No. 4671958, Rodwell et al.), и гидролизом, катализируемым кислотой (например, патент США No. 4569789, Blattler et al.).

Желательным может быть связывание более чем одного средства с антителом. В одном варианте многочисленные молекулы средства связывают с одной молекулой антитела. В другом варианте с одним антителом может быть связано более одного типа средства. Независимо от конкретного варианта иммуноконъюгаты с более чем одним лекарственным средством можно получить различными способами. Например, более одного средства можно связать прямо с молекулой антитела или можно использовать линкеры, которые обеспечивают множественные сайты для связывания. Альтернативно можно использовать носитель.

Носитель может нести агенты разными способами, включая ковалентное связывание, непосредственно или через линкерную группу. Подходящие носители включают белки, такие как альбумины (например, патент США No. 4507234, Kato et al.), пептиды и полисахариды, такие как аминодекстран (например, патент США No. 4699784, Shih et al.). Носитель также может нести агент посредством нековалентного связывания или инкапсулирования, такого как инкапсулирование в липосомном носителе (например, патенты США No. 4429008 и 4873088). Носители, специфичные для радионуклидных агентов, включают малые радиогалогенированные молекулы и хелатирующие соединения. Например, в патенте США No. 4735792 описаны репрезентативные радиогалогенированные малые молекулы и их синтез. Хелатирующий радионуклиды агент можно образовать из хелатирующих соединений, которые включают соединения, содержащие атомы азота и серы в качестве донорных атомов для связывания радионуклида, представленного металлом, или оксидом металла. Например, в патенте No. 4673562 Davison et al., описаны образцы хелатирующих соединений и их синтез.

Можно использовать множество путей введения антител и иммуноконъюгатов. Обычно введение является внутривенным, внутримышечным, подкожным или в ложе опухоли после резекции. Будет очевидно, что точная доза антитела/иммуноконъюгата будет варьировать в зависимости от используемого антитела, плотности антигенов на опухоли и скорости клиренса антитела.

Т-КЛЕТКИ.

Иммунотерапевтические композиции могут также или альтернативно содержать Т-клетки, специфичные для белка опухоли молочной железы. Такие клетки обычно можно получить in vitro или ex vivo, используя стандартные процедуры. Например, Т-клетки можно выделить из костного мозга, периферической крови или фракции костного мозга или периферической крови пациента, используя коммерчески доступную систему разделения клеток, такую, как система Isolex^TM, доступная из Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; смотри патент США No. 5240856; патент США No. 5215926; WO 89/06280; WO 91/16116 и WO 92/07243). Альтернативно Т-клетки можно получить от людей – родственников и не родственников, других млекопитающих, линий или культур клеток.

Т-клетки можно стимулировать полипептидом опухоли молочной железы, полинуклеотидом, кодирующим пептид опухоли молочной железы, и/или антиген-презентирующей клеткой (АПК), которая экспрессирует такой полипептид. Такую стимуляцию выполняют в условиях и в течение времени, достаточного для того, чтобы обеспечить возможность для образования Т-клеток, специфичных в отношении полипептида. Предпочтительно полипептид опухоли молочной железы или полинуклеотид находится в носителе для доставки, таком как микросфера, чтобы облегчить образование специфичных Т-клеток.

Т-клетки считаются специфичными в отношении полипептида опухоли молочной железы, если Т-клетки специфично пролиферируют, секретируют цитокины или убивают клетки-мишени, покрытые полипептидом или экспрессирующие ген, кодирующий полипептид. Специфичность Т-клеток можно оценить, используя любой из множества стандартных способов. Например, анализом высвобождения хрома или анализом пролиферации, повышение индекса стимуляции при лизисе и/или пролиферации более чем в два раза по сравнению с негативными контролями свидетельствует о специфичности Т-клеток. Такие анализы, например, можно выполнить, как описано в Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070, 1994. Альтернативно регистрацию пролиферации Т-клеток можно осуществлять посредством ряда известных способов. Например, Т-клеточную пролиферацию можно регистрировать измерением повышенной скорости синтеза ДНК (например, импульсным мечением культур Т-клеток меченным тритием тимидином и измерением количества меченного тритием тимидина, включенного в ДНК). Контакт с полипептидом опухоли молочной железы (100 нг/мл – 100 мкг/мл, предпочтительно 200 нг/мл – 25 мкг/мл) в течение 3-7 дней должен в результате привести, по меньшей мере, к двукратному увеличению пролиферации Т-клеток. Как описано выше, контакт в течение 2-3 часов должен в результате привести к активации Т-клеток, что измеряют с использованием стандартного анализа цитокинов, при этом двукратное увеличение уровня высвобождения цитокинов (например, TNF или IFN-) является показателем активации Т-клеток (смотри Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1988)). Т-клетки, которые были активированы в ответ на полипептид опухоли молочной железы, полинуклеотид или экспрессирующие полипептид АПК, могут быть CD4⁺ и/или CD8⁺. Специфичные для белка опухоли молочной железы Т-клетки можно размножить с использованием стандартных способов. В предпочтительных вариантах Т-клетки получают от пациента, донора-родственника или донора, не являющегося родственником, и вводят пациенту после стимуляции и размножения.

Для терапевтических целей количество CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеток, которые пролиферируют в ответ на полипептид опухоли молочной железы, полинуклеотид или АПК, можно увеличить либо in vitro, либо in vivo. Пролиферацию таких Т-клеток in vitro можно осуществить рядом способов. Например, Т-клетки можно повторно подвергнуть воздействию полипептида опухоли молочной железы, или короткого пептида, соответствующего иммуногенной части такого полипептида, с добавлением или без добавления факторов роста Т-клеток, таких как интерлейкин-2, и/или стимулирующих клеток, которые синтезируют полипептид опухоли молочной железы. Альтернативно одна или несколько Т-клеток, которые пролиферируют в присутствии белка опухоли молочной железы, можно размножить клонированием. Способы клонирования клеток хорошо известны в данной области и включают лимитирующее разведение.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ.

В дополнительных вариантах данное изобретение касается приготовления одной или нескольких заявленных здесь композиций полинуклеотидов, полипептидов, Т-клеток и/или антител, в виде фармацевтически приемлемых растворов для введения в клетку или животному либо отдельно, либо в комбинации с одним или несколькими другими видами терапии.

Также будет понятно, что при желании можно вводить композиции сегмента нуклеиновой кислоты, РНК, ДНК или ПНК, которые экспрессируют заявленный здесь полипептид, также в комбинации с другими агентами, например, такими как другие белки или полипептиды, или различные фармацевтически активные средства. На самом деле практически нет ограничения на другие компоненты, которые также можно включать, при условии, что дополнительные агенты не вызывают существенного побочного действия при контакте с клетками-мишенями или тканями хозяина. Таким образом, в отдельных случаях, когда это требуется, композиции можно доставлять наряду с различными другими агентами. Такие композиции можно очистить из клеток-хозяев или других биологических источников, или альтернативно можно химически синтезировать, как здесь описано. Также такие композиции могут кроме того содержать замещенные или дериватизированные РНК- или ДНК-композиции.

Технология приготовления фармацевтически приемлемых наполнителей и растворов носителей хорошо известна специалистам в данной области, как и разработка подходящих режимов дозирования и лечения в случае применения описанных здесь конкретных композиций при различных схемах лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение и технологию приготовления.

1. ПЕРОРАЛЬНАЯ ДОСТАВКА.

При некоторых применениях заявленные здесь фармацевтические композиции можно доставлять посредством перорального введения животному. Как таковые указанные композиции можно приготовить в композиции с инертным разбавителем или с усваиваемым съедобным носителем, или их можно заключить в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, или их можно прессовать в таблетки, или их можно непосредственно смешивать с пищевыми продуктами.

Активные компоненты можно даже смешивать с наполнителями и использовать в форме принимаемых вовнутрь таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобного (Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; патент США 5641515; патент США 5580579 и патент США 5792451, каждый из которых специально включен здесь в виде ссылки в полном объеме). Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и тому подобное также могут содержать следующее: связывающее вещество как трагакантовая камедь, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; наполнители, такие как фосфат кальция двузамещенный; дезинтегрирующее средство, такое как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и тому подобное; скользящее вещество, такое как стеарат магния; и может быть добавлен подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин, или корригенты, такие как корригирующее средство из мяты, масла грушанки или вишни. В том случае, когда дозированная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать в дополнение к материалам, указанным выше, жидкий носитель. Могут присутствовать различные другие материалы в качестве покрытия или для того чтобы другим образом модифицировать физическую форму дозированной формы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком или сахаром или двумя этими материалами. Сироп или эликсир может содержать активное соединение, сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и корригирующее средство, такое как корригент вишни или апельсина. Конечно любой материал, используемый для приготовления любой дозированной лекарственной формы, должен быть фармацевтически чистым и в значительной степени нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, активные соединения могут быть включены в препарат и композиции длительного высвобождения.

Обычно указанные композиции могут содержать, по меньшей мере, 0,1% активного соединения или более, хотя процентное содержание активного ингредиента(тов), конечно, можно легко варьировать примерно от 1 или 2% до примерно 60% или 70% или более от массы или объема суммарной композиции. Естественно количество активного соединения(ий) в каждой терапевтически пригодной композиции можно приготовить таким образом, чтобы была получена подходящая доза в любой данной стандартной дозе соединения. Специалистом в области приготовления таких фармацевтических композиций будут предусмотрены такие факторы как растворимость, биодоступность, время биологической полужизни, путь введения, срок хранения продукта, а также другие фармакологические соображения, и по существу могут требоваться различные режимы дозирования и лечения.

Для перорального введения композиции согласно данному изобретению альтернативно можно смешивать с одним или несколькими наполнителями в форме жидкости для полоскания рта, средства для чистки зубов, буккальной таблетки, перорального спрея или подъязычной перорально вводимой композиции. Например, жидкость для полоскания рта можно приготовить с включением активного ингредиента в требуемом количестве в подходящий растворитель, таком как раствор бората натрия (раствор Добелля). Альтернативно активный ингредиент можно включить в пероральный раствор, такой как раствор, содержащий борат натрия, глицерин и бикарбонат калия, или диспергировать в средстве для чистки зубов, или добавить в терапевтически эффективном количестве в композицию, которая может содержать воду, связывающие вещества, абразивные материалы, корригирующие средства, пенообразующие средства и увлажнители. Альтернативно композициям можно придать форму таблетки или раствора, которые можно поместить под язык или другим образом растворить во рту.

2. ИНЪЕКЦИОННАЯ ДОСТАВКА.

В некоторых случаях будет желательна доставка заявленных здесь фармацевтических композиций парентерально, внутривенно, внутримышечно или даже внутрибрюшинно, как описано в патенте США 5543158; в патенте США 5641515 и патенте США 5399363 (каждый специально включен здесь в виде ссылки в полном объеме). Растворы активных соединений в виде свободного основания или фармацевтически приемлемых солей можно приготовить в воде, соответствующим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Также можно приготовить дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант, чтобы предотвратить рост микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовляемого непосредственно перед использованием препарата стерильных инъекционных растворов или дисперсий (патент США 5466468, специально включенный здесь в виде ссылки в полном объеме). Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей в такой степени, чтобы легко проходить через шприц. Она должна быть стабильна в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, высокомолекулярный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и тому подобное), их подходящие смеси и/или растительные масла. Надлежащую текучесть можно, например, поддерживать, применяя покрытия, такие как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и посредством применения поверхностно-активных веществ. Предотвращению действия микроорганизмов могут способствовать различные антибактериальные и противогрибковые средства, например, парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимеросал и тому подобное. Во многих случаях предпочтительным будет включение средств, обеспечивающих изотоничность, например, сахаров и хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно осуществить благодаря использованию в композициях агентов, снижающих всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

Для парентерального введения, например, в водном растворе раствор при необходимости должен быть соответствующим образом забуферен и жидкий разбавитель сначала доведен до изотонического достаточным количеством раствора соли или глюкозы. Указанные конкретные водные растворы особенно пригодны для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи стерильная водная среда, которую можно использовать в свете данной заявки, хорошо известна специалистам в данной области. Например, одну дозу можно растворить в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавить к 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, либо инъецировать в предполагаемое место инфузии (смотри, например, “Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15^th Edition, стр. 1035-1038 и 1570-1580). Некоторое варьирование дозы обязательно будет иметь место в зависимости от состояния субъекта, подвергающегося лечению. Человек, ответственный за введение, в любом случае будет определять соответствующую дозу для конкретного субъекта. Кроме того, для введения человеку препараты должны удовлетворять стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты, как требуется управлением FDA по стандартам биологических препаратов.

Стерильные инъекционные растворы готовят, объединяя активные соединения в необходимом количестве в соответствующем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, которые необходимы, после чего стерилизуют фильтрованием. В общем, дисперсии готовят, включая различные стерильные активные ингредиенты в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются способы вакуумной сушки и сушки вымораживанием, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный требуемый ингредиент из их предварительно стерильно профильтрованного раствора.

Заявленные здесь композиции можно приготовить в нейтральной форме или форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами белка), и эти соли образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и тому подобные. Также можно получить соли, образованные со свободными карбоксильными группами, из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и такими органическими основаниями, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и им подобные. После приготовления растворы будут вводить способом, совместимым с дозированной композицией, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Композиции легко вводят в различных дозированных формах, таких как инъекционные растворы, капсулы, высвобождающие лекарственное средство, и тому подобное.

В используемом здесь смысле термин «носитель» включает в себя любой и все растворители, дисперсионные среды, наполнители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые средства, средства, обеспечивающие изотоничность и понижающие всасывание, буферы, растворы носителей, суспензии, коллоиды и тому подобное. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Применение любой традиционной среды или агента предусматривается в терапевтических композициях за исключением тех ограничений, при которых они не совместимы с активным ингредиентом. В композиции также могут быть включены дополнительные активные ингредиенты.

Фраза «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным частицам и композициям, которые не дают аллергической или другой подобной неблагоприятной реакции при введении человеку. Приготовление водной композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента белок, хорошо известно в данной области. Обычно такие композиции готовят в виде инъецируемых композиций, либо в виде водных растворов, либо суспензий; также можно приготовить твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат также может быть эмульгированным.

3. НАЗАЛЬНАЯ ДОСТАВКА.

В некоторых вариантах фармацевтические композиции могут быть доставлены посредством интраназальных спреев, ингаляции и/или других носителей для аэрозольной доставки. Способы доставки генов, нуклеиновых кислот и пептидных композиций непосредственно в легкие посредством назальных аэрозольных спреев описаны, например, в патенте США 5756353 и патенте США 5804212 (каждый специально включен в виде ссылки в полном объеме). Подобным образом в фармацевтической области также хорошо известна доставка лекарственных средств с использованием интраназальных смол с микрочастицами (Takenaga et al., 1998) и соединений лизофосфатидилглицерина (патент США 5725871, специально включенный здесь в виде ссылки в полном объеме). Подобно этому доставка лекарственного средства через слизистую оболочку в форме политетрафторэтиленового матрикса носителя описана в патенте США 5780045 (специально включенном здесь в виде ссылки в полном объеме).

4. ДОСТАВКА, ОПОСРЕДОВАННАЯ ЛИПОСОМАМИ, НАНОКАПСУЛАМИ И МИКРОЧАСТИЦАМИ.

В некоторых вариантах авторы изобретения предусматривают применение липосом, нанокапсул, микрочастиц, микросфер, липидных частиц, везикул и тому подобного для введения композиций согласно данному изобретению в подходящие клетки-хозяева. В частности, композиции согласно данному изобретению можно приготовить для доставки либо инкапсулированными в липидную частицу, липосому, везикулу, наносферу, либо наночастицу, или тому подобное.

Такие композиции могут быть предпочтительными для введения заявленных здесь фармацевтически приемлемых композиций нуклеиновых кислот или конструкций. В основном образование и применение липосом известно специалистам в данной области (смотри, например, Couvreur et al., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998, которые описывают применение липосом и нанокапсул в целенаправленной терапии антибиотиками внутриклеточных бактериальных инфекций и заболеваний). Недавно были разработаны липосомы с повышенной стабильностью в сыворотке и полупериодом циркуляции (Gabizon and Papahadjopoulos, 1988; Allen and Choun, 1987; патент США 5741516, специально включенные здесь в виде ссылки в полном объеме). Кроме того, представлены обзоры различных способов, касающихся препаратов липосом и подобных липосомам частиц в качестве потенциальных носителей лекарственных средств (Takakura, 1998; Chandran et al., 1997; Margalit, 1995; патент США 5567434; патент США 5552157; патент США 5565213; патент США 5738868 и патент США 5795587 (каждый специально включен здесь в виде ссылки в полном объеме).

Липосомы успешно использовали для ряда типов клеток, которые обычно резистентны к трансфекции другими способами, включая суспензии Т-клеток, первичные культуры гепатоцитов и клетки РС 12 (Renneisen et al., 1990; Muller et al., 1990). Кроме того, липосомы не имеют ограничений по длине ДНК, что обычно для систем доставки на основе вирусов. Липосомы эффективно использовали для введения генов, лекарственных средств (Heath and Martin, 1986; Heath et al., 1986; Balazsovits et al., 1989; Fresta and Puglisi, 1996), радиотерапевтических средств (Pikul et al., 1987), ферментов (Imaizumi et al., 1990a; Imaizumi et al., 1990b), вирусов (Faller and Baltimore, 1984), транскрипционных факторов и аллостерических эффекторов (Nicolau and Gersonde, 1979) в различные линии культивируемых клеток и животных. Кроме того, завершено несколько успешных клинических испытаний по оценке эффективности опосредованной липосомами доставки лекарственных средств (Lopez-Berestein et al., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al., 1988). Кроме того, несколько исследований свидетельствуют о том, что применение липосом не связано с аутоиммунными ответами, токсичностью или локализацией в гонадах после системной доставки (Mori and Fukatsu, 1992).

Липосомы образуют из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и спонтанно формируют многослойные концентрические пузырьки из бислойных структур (также называемые многослойными пузырьками (MLV). MLV обычно имеют диаметры от 25 нм до 4 мкм. Обработка MLV ультразвуком приводит к образованию небольших однослойных пузырьков (SUV) с диаметрами в пределах от 200 до 500 Å, содержащих водный раствор в ядре.

Липосомы обладают сходством с клеточными мембранами и планируются для применения в связи с данным изобретением в качестве носителей для пептидных композиций. Они широко применимы, так как могут захватывать как водорастворимые, так и липидорастворимые вещества, т.е. в заполненных водой пространствах и в самом бислое, соответственно. Вероятно, что липосомы, несущие лекарственное средство, даже можно использовать для сайт-специфичной доставки активных агентов посредством избирательного модифицирования композиции липосом.

Кроме руководств Couvreur et al. (1977; 1988) для создания композиций липосом можно использовать следующую информацию. Фосфолипиды могут формировать ряд структур, отличных от липосом, в том случае, когда они диспергированы в воде, в зависимости от молярного отношения липида к воде. При низких соотношениях предпочтительными структурами являются липосомы. Физические характеристики липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия дивалентных катионов. Липосомы могут проявлять низкую проницаемость для ионных и полярных веществ, но при повышенных температурах подвергаются фазовому переходу, который заметно изменяет их проницаемость. Фазовый переход включает в себя превращение плотно упакованной, упорядоченной структуры, известной как гелеобразное состояние, в неплотно упакованную менее упорядоченную структуру, известную как жидкое состояние. Это происходит при характерной температуре фазового перехода и в результате приводит к увеличению проницаемости для ионов, сахаров и лекарственных средств.

Кроме температуры проницаемость липосом может изменяться при воздействии белков. Некоторые растворимые белки, такие как цитохром с, связываются, деформируют и проникают в бислой, тем самым, вызывая изменения проницаемости. Холестерин ингибирует указанное проникновение белков, по-видимому, из-за более плотной упаковки фосфолипидов. Предполагается, что наиболее пригодные для доставки антибиотиков и ингибиторов липосомные образования будут содержать холестерин.

Способность улавливать различные растворенные вещества различна у разных типов липосом. Например, MLV умеренно эффективны в улавливании растворенных веществ, а SUV крайне неэффективны. Однако SUV предоставляют преимущество, состоящее в гомогенности и воспроизводимости в распределении по размеру, и компромиссное решение между размером и улавливающей способностью предоставляют большие однослойные пузырьки (LUV). Их получают выпариванием в эфире, и они в три-четыре раза более эффективны в отношении захвата, чем MLV.

Кроме характеристик липосом важным определяющим фактором в захвате соединений являются физико-химические свойства самого соединения. Полярные соединения захватываются в пространстве, содержащем воду, а неполярные соединения связываются с липидным бислоем пузырька. Полярные соединения высвобождаются, проникая через бислой, или в том случае, когда бислой нарушен, а неполярные соединения остаются в составе бислоя до тех пор, пока он не будет разрушен температурой или воздействием липопротеидов. Оба типа соединений проявляют максимальные скорости выхода при температуре фазового перехода.

Липосомы взаимодействуют с клетками посредством четырех разных механизмов: эндоцитоз фагоцитирующими клетками ретикулоэндотелиальной системы, такими как макрофаги и нейтрофилы; адсорбция на поверхности клеток, либо за счет неспецифических слабых гидрофобных сил, либо электростатических сил, или посредством специфичных взаимодействий с компонентами поверхности клеток; слияние с плазматической мембраной клеток посредством встраивания липидного бислоя липосомы в плазматическую мембрану с одновременным высвобождением содержимого липосом в цитоплазму; и посредством переноса липидов липосом в клеточные или субклеточные мембраны, или, наоборот, без какого-либо связывания содержимого липосом. Часто трудно определить какой механизм действует, и в одно и то же время могут действовать более одного механизма.

Судьба и расположение внутривенно инъецированных липосом зависят от их физических свойств, таких как размер, текучесть и заряд поверхности. Они могут сохраняться в тканях в течение часа или дней, в зависимости от их состава, и время полужизни в крови находится в пределах от мин до нескольких час. Большие липосомы, такие как MLV и LUV, быстро захватываются фагоцитирующими клетками ретикулоэндотелиальной системы, но физиология системы циркуляции ограничивает существование таких крупных видов частиц в большинстве мест. Они могут существовать только в местах, где существуют большие отверстия или поры в эндотелии капилляров, в таких, как синусоиды печени или селезенки. Таким образом, указанные органы являются преобладающими местами захвата. С другой стороны, SUV показывают более широкое распределение в тканях, но все же на высоком уровне удерживаются в печени и селезенке. В общем, такое поведение in vivo ограничивает возможность направленной доставки липосом к мишени только указанными органами и тканями, доступным для липосом большого размера. Органы и ткани включают кровь, печень, селезенку, костный мозг и лимфоидные органы.

Направленная доставка к мишени, в общем, не является ограничением для данного изобретения. Однако если должна требоваться специфичная доставка к мишени, имеются способы, чтобы это осуществить. Можно использовать антитела, чтобы связать их с поверхностью липосомы и направить антитело и содержимое, представленное лекарственным средством, к специфичным антигенным рецепторам, локализованным на поверхности конкретного типа клеток. Углеводные детерминанты (гликопротеидные или гликолипидные компоненты клеточной поверхности, которые играют роль в межклеточном узнавании, взаимодействии и адгезии) также можно использовать в качестве сайтов узнавания, так как они обладают потенциальной возможностью направлять липосомы к конкретному типу клеток. Главным образом, предполагается, что может быть использована внутривенная инъекция препаратов липосом, но также возможны другие пути введения.

Альтернативно изобретение относится к фармацевтически приемлемым составам нанокапсул на основе композиций согласно данному изобретению. Обычно нанокапсулы могут захватывать соединения стабильным и воспроизводимым образом (Henry-Michelland et al., 1987; Quintanar-Guerrero et al., 1998; Douglas et al., 1987). Чтобы избежать побочных эффектов из-за внутриклеточной перегрузки полимерами, такие сверхмелкие частицы (размером около 0,1 мкм) должны быть сконструированы с использованием полимеров, способных деградировать in vivo. Для использования в данном изобретении предлагаются биодеградируемые полиалкил-цианоакрилатные наночастицы, которые удовлетворяют этим требованиям. Такие частицы можно легко получить, как описано (Couvreur et al., 1980; 1988; zur Muhlen et al., 1998; Zambaux et al.,1998; Pinto-Alphandry et al., 1995 и патент США 5145684, специально включенный здесь в виде ссылки в полном объеме).

ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ.

В некоторых вариантах данного изобретения предоставлены иммуногенные композиции или вакцины. Иммуногенные композиции, как правило, будут включать в себя одну или несколько фармацевтических композиций, таких как обсуждалось выше, в комбинации с иммуностимулятором. Иммуностимулятором может быть любое вещество, которое увеличивает или усиливает иммунный ответ (опосредованный антителами и/или клетками) на экзогенный антиген. Примеры иммуностимуляторов включают адъюванты, биодеградируемые микросферы (например, полилактатгалактид) и липосомы (в которые включают соединение; смотри, например, Fullerton, патент США No. 4235877). Получение вакцин в основном описано, например, в M.F. Powell and M.J. Newman, eds., “Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach),” Plenum Press (NY, 1995). Фармацевтические композиции и иммуногенные композиции в рамках данного изобретения также могут содержать другие соединения, которые могут быть биологически активными или неактивными. Например, в композиции может присутствовать одна или несколько частей других опухолевых антигенов, либо включенных в гибридный полипептид, либо в виде отдельного соединения.

Иллюстративные иммуногенные композиции могут содержать ДНК, кодирующую один или несколько полипептидов, которые описаны выше, так чтобы полипептид вырабатывался in situ. Как указано выше, ДНК может присутствовать в любой из множества систем доставки, известных специалистам в данной области, включая системы экспрессии нуклеиновых кислот, бактерии и вирусные экспрессирующие системы. В данной области известны многочисленные способы доставки генов, такие как способы, описанные Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998 и в цитированных в этой работе ссылках. Подходящие системы экспрессии нуклеиновых кислот содержат необходимые для экспрессии у пациента последовательности ДНК (такие как подходящий промотор и сигнал терминации). Бактериальные системы доставки включают введение бактерии (такой как Bacillus-Calmette-Guerrin), которая экспрессирует иммуногенную часть полипептида на своей поверхности или секретирует такой эпитоп. В предпочтительном варианте ДНК можно вводить с использованием вирусной экспрессирующей системы (например, вируса осповакцины или другого поксвируса, ретровируса или аденовируса), который может включать применение непатогенного (дефектного), компетентного в отношении репликации вируса. Подходящие системы описаны, например в Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17-21, 1990; патентах США No. 4603112, 4769330 и 5017487; WO 89/01973; патенте США No. 4777127; GB 2200651; EP 0345242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502, 1993; Guzman et al. Circulation 88: 2838-2848, 1993; и Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202-1207, 1993. Способы включения ДНК в такие экспрессирующие системы хорошо известны специалистам в данной области. ДНК также может быть «голой», как описано, например, в Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993 и в обзоре Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993. Захват «голой» ДНК можно увеличить, покрывая ДНК биодеградируемые шарики, которые эффективно транспортируются в клетки. Будет очевидно, что иммуногенная композиция может содержать как полинуклеотидный, так и полипептидный компонент. Такие иммуногенные композиции могут давать усиленный иммунный ответ.

Будет очевидно, что иммуногенная композиция может содержать фармацевтически приемлемые соли предоставляемых здесь полинуклеотидов и полипептидов. Такие соли можно получить из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, включая органические основания (например, соли первичных, вторичных и третичных аминов и основных аминокислот) и неорганических оснований (например, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния).

Несмотря на то, что в композициях согласно изобретению можно использовать любой подходящий носитель, известный специалистам в данной области, тип носителя будет варьировать в зависимости от способа введения. Можно приготовить композиции согласно данному изобретению для любого подходящего способа введения, включая, например, местное, пероральное, назальное, внутривенное, внутричерепное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно содержит воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из указанных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. В качестве носителей для фармацевтических композиций согласно данному изобретению также можно использовать биодеградируемые микросферы (например, полилактат-полигликолата). Подходящие биодеградируемые микросферы описаны, например, в патентах США No. 4897268; 5075109; 5928647; 5811128; 5820883; 5853763; 5814344 и 5942252. Также можно использовать носитель, содержащий комплексы частиц с белками, описанные в патенте США 5928647, которые способны индуцировать в хозяине ответы цитотоксических Т-лимфоцитов, ограниченные классом I.

Такие композиции также могут содержать буферы (например, нейтральный забуференный физиологический раствор или забуференный фосфатами физиологический раствор), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, бактериостатические средства, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия), растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной, гипотоничной или слабо гипертоничной по отношению к крови реципиента, суспендирующие агенты, загустители и/или консерванты. Альтернативно композиции данного изобретения можно приготовить в виде лиофилизата. Соединения также можно инкапсулировать в липосомы, используя хорошо известные способы.

В иммуногенных композициях согласно данному изобретению можно использовать любой из множества иммуностимуляторов. Например, можно включить адъювант. Большинство адъювантов содержат вещество, предназначенное для защиты антигена от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунных ответов, такой как липид А, белки, полученные из Bortadella pertussis или Mycobacterium tuberculosis. Подходящие адъюванты доступны для приобретения, как, например, неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, MI); адъювант Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (alum) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионно или анионно дериватизированные полисахариды; полифосфазены; биодеградируемые микросферы; монофосфорил-липид А и производное сапонина «quil A». В качестве адъювантов также можно использовать цитокины, такие как GM-CSF или интерлейкин-2, -7 или -12.

В предоставленных здесь иммуногенных композициях композиция адъюванта предпочтительно предназначена для того, чтобы индуцировать иммунный ответ преимущественно Th1-типа. Высокие уровни цитокинов Th1-типа (например, IFN-, TNF, IL-2 и IL-12) благоприятствуют индукции опосредованных клетками иммунных ответов на введенный антиген. Напротив, высокие уровни цитокинов типа Th2 (например, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10) благоприятствуют индукции гуморальных иммунных ответов. После применения предоставленной здесь иммуногенной композиции у пациента будет поддерживаться иммунный ответ, который включает ответы Th1- и Th2-типа. В предпочтительном варианте, в котором ответ преимущественно представляет собой ответ Th1-типа, уровень цитокинов Th1-типа будет увеличиваться в большей степени, чем уровень цитокинов Th2-типа. Уровни этих цитокинов легко можно оценить стандартными анализами. Для обзора семейств цитокинов смотрите Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989.

Предпочтительные адъюванты, применяемые для того, чтобы вызвать преимущественно ответ Th1-типа, включают, например, комбинацию монофосфорил-липида А, предпочтительно 3-де-О-ацилированный монофосфорил-липид А (3D-MPL), вместе с солью алюминия. Адъюванты MPL доступны для приобретения из Corixa Corporation (Seattle, WA; смотри патенты США No. 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094). Олигонуклеотиды, содержащие CpG (в которых динуклеотид CpG не метилирован), также преимущественно индуцируют Th1-ответ. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в WO 96/02555, WO 99/33488 и патентах США No. 6008200 и 5856462. Также описаны иммуностимулирующие последовательности ДНК, например Sato et al., Science 273: 352, 1996. Другим предпочтительным адъювантом является сапонин, предпочтительно QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), который можно использовать отдельно или в комбинации с другими адъювантами. Например, усиленная система включает в себя комбинацию монофосфорил-липида А и производного сапонина, такую как комбинацию QS21 и 3D-MPL, как описано в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, в которой QS21 погашен холестерином, как описано в WO 96/33739. Другие предпочтительные композиции содержат эмульсию типа «масло в воде» и токоферол. Особенно эффективная композиция адъюванта, включающая в себя QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии типа «масло в воде», описана в WO 95/17210.

Другие предпочтительные адъюванты включают Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, California, United States), ISCOM (CSL), MF-59 (Chiron), серию адъювантов SBAS (например, SBAS-2 или SBAS-4, доступные для приобретения из SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Detox (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) и другие 4-фосфаты аминоалкилглюкозаминида (AGP), такие как описанные в находящихся на рассмотрении заявках на выдачу патента США No. 08/853826 и 09/074720, изложенные материалы которых включены здесь в виде ссылки в полном объеме.

Любую предоставленную здесь иммуногенную композицию можно приготовить, используя известные способы, в результате которых получают комбинацию антигена, усилителя иммунного ответа и подходящего носителя или наполнителя. Описанные здесь композиции можно вводить в виде части композиции длительного высвобождения (т.е. такой композиции, как капсула, губка или гель (состоящий, например, из полисахаридов), которая осуществляет медленное высвобождение соединения после введения). Такие композиции, как правило, можно приготовить с использованием хорошо известной технологии (смотри, например, Coombes et al., Vaccine 14: 1429-1438, 1996) и ввести, например, перорально, ректально или подкожной имплантацией, или имплантацией в требуемое место-мишень. Композиции замедленного высвобождения могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитело, диспергированные в матриксе носителя и/или заключенные в емкость, окруженную мембраной, которая контролирует скорость.

Носители, применяемые в таких композициях, являются биосовместимыми, а также могут быть биодеградируемыми; предпочтительно композиция обеспечивает относительно постоянный уровень высвобождения активного компонента. Такие носители включают микрочастицы сополимера поли(лактида-гликолида), полиакрилата, латекса, крахмала, целлюлозы, декстрана и тому подобного. Другие носители замедленного высвобождения включают надмолекулярные биовекторы, которые содержат не жидкое гидрофильное ядро (например, перекрестно сшитый полисахарид или олигосахарид) и, необязательно, наружный слой, содержащий амфифильное соединение, такое как фосфолипид (смотри, например, патент США No. 5151254 и заявки РСТ WO 94/20078, WO 94/23701 и WO 96/06638). Количество активного соединения, содержащееся в композиции длительного высвобождения, зависит от места имплантации, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения и природы состояния, которое предстоит лечить или предотвратить.

В фармацевтических композициях и иммуногенных композициях можно использовать любой из множества носителей для доставки, чтобы способствовать продукции антиген-специфичного иммунного ответа, мишенью которого являются опухолевые клетки. Носители для доставки включают антиген-презентирующие клетки (АПК), такие как дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, моноциты и другие клетки, которые можно сконструировать так, чтобы они были эффективными АПК. Такие клетки можно, но не обязательно, генетически модифицировать, чтобы увеличить способность презентировать антиген, повысить активацию и/или сохранение ответа Т-клеток, чтобы клетки сами по себе обладали противоопухолевым действием и/или были иммунологически совместимы с реципиентом (т.е. совпадали по HLA-гаплотипу). Обычно АПК можно выделить из любой из множества биологической жидкостей или органов, включая опухолевые или периопухолевые ткани, и они могут быть аутологичными, аллогенными, сингенными или ксенногенными клетками.

В некоторых предпочтительных вариантах данного изобретения в качестве антиген-презентирующих клеток используют дендритные клетки или их предшественники. Дендритные клетки являются высоко эффективными АПК (Banchereau and Steinman, Nature 392: 245-251, 1998), и было показано, что они являются эффективными в качестве физиологического адъюванта, вызывающего профилактический или терапевтический противоопухолевый иммунитет (смотри Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529, 1999). В общем, дендритные клетки можно идентифицировать на основе их типичной формы (звездообразной in situ с заметными цитоплазматическими отростками (дендритами), видимыми in vitro), по их способности с высокой эффективностью захватывать, процессировать и презентировать антигены, и по их способности активировать нативные Т-клеточные ответы. Конечно, дендритные клетки можно сконструировать так, чтобы они экспрессировали специфичные рецепторы клеточной поверхности или лиганды, которые обычно не выявляются на дендритных клетках in vivo или ex vivo, и такие модифицированные дендритные клетки предусмотрены данным изобретением. В качестве альтернативы дендритным клеткам в иммуногенной композиции можно использовать секретируемые пузырьки нагруженных антигеном дендритных клеток (называемые экзосомами) (смотри Zitvogel et al., Nature Med. 4: 594-600, 1998).

Дендритные клетки и предшественники можно получить из периферической крови, костного мозга, клеток, инфильтрующих опухоль, клеток, инфильтрующих периопухолевые ткани, лимфатических узлов, селезенки, кожи, пуповинной крови или любой другой подходящей ткани или жидкости. Например, дифференцировку дендритных клеток можно осуществить ex vivo, добавляя комбинацию таких цитокинов, как GM-CSF, IL-4, IL-13 и/или TNF к культурам моноцитов, собранных из периферической крови. Альтернативно CD34-позитивные клетки, собранные из периферической крови, пуповинной крови или костного мозга, могут быть дифференцированы в дендритные клетки добавлением к культуральной среде комбинаций GM-CSF, IL-3, TNF, лиганда CD40, ЛПС, flt3 и/или другого(их) соединения(ий), которое индуцирует дифференцировку, созревание и пролиферацию дендритных клеток.

Дендритные клетки удобно делить на «незрелые» и «зрелые» клетки, что дает простой способ распознавания двух хорошо охарактеризованных фенотипов. Однако нельзя считать, что такая терминология исключает все возможные промежуточные стадии дифференцировки. Незрелые дендритные клетки характеризуются как АПК с высокой способностью к захвату и процессингу антигена, которая коррелирует с высокой экспрессией рецептора Fc и рецептора маннозы. Зрелый фенотип обычно характеризуется более низкой экспрессией указанных маркеров, но высокой экспрессией молекул поверхности клеток, ответственных за активацию Т-клеток, таких как молекулы МНС класса I и II, адгезионных молекул (например, CD54 и CD11) и костимулирующих молекул (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1BB).

Обычно АПК можно трансфицировать полинуклеотидом, кодирующим белок опухоли молочной железы (или его часть или другой вариант) так, чтобы полипептид опухоли молочной железы или его иммуногенная часть экспрессировались на поверхности клеток. Такая трансфекция может иметь место ex vivo, и композицию, содержащую такие трансфицированные клетки, затем можно использовать в терапевтических целях, как здесь описано. Альтернативно пациенту можно вводить носитель для доставки генов, мишенью которого является дендритная или другая антиген-презентирующая клетка, в результате получая трансфекцию, которая происходит in vivo. Трансфекцию дендритных клеток in vivo и ex vivo, как правило, можно, например, выполнить, используя любой способ, известный в данной области, такой как способы, описанные в WO 97/24447, или подход с применением генной «пушки», описанный Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75: 456-460, 1997. Антигенной нагрузки дендритных клеток можно достичь, инкубируя дендритные клетки или клетки-предшественники с полипептидом опухоли молочной железы, ДНК («голой» или в плазмидном векторе) или РНК; или с экспрессирующими антиген рекомбинантными бактериями или вирусами (например, векторами на основе вируса осповакцины, поксвируса птиц, аденовируса или лентивируса). Перед нагрузкой пептид можно ковалентно конъюгировать с иммунологическим партнером, который обеспечивает помощь Т-клеток (например, молекулой носителя). Альтернативно на дендритную клетку можно импульсно воздействовать неконьюгированным иммунологическим партнером, отдельно или в присутствии полипептида.

Иммуногенные композиции и фармацевтические композиции могут быть представлены в емкостях, содержащих стандартную дозу или многократные дозы, в таких как запаянные ампулы или флаконы. Такие емкости предпочтительно герметично запаивают, чтобы сохранить стерильность композиции вплоть до использования. В общем, композиции можно хранить в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных наполнителях. Альтернативно иммуногенную или фармацевтическую композицию можно хранить в высушенном вымораживанием состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед использованием.

ТЕРАПИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ.

В следующих аспектах данного изобретения описанные здесь композиции можно использовать для иммунотерапии злокачественной опухоли, такой как рак молочной железы. При таких способах пациенту обычно вводят фармацевтические композиции и иммуногенные композиции. В используемом здесь смысле «пациент» относится к любому теплокровному животному, предпочтительно человеку. Пациент может быть поражен или не поражен злокачественной опухолью. Соответственно указанные выше фармацевтические композиции и иммуногенные композиции можно использовать для предотвращения развития злокачественной опухоли или для лечения пациента, пораженного злокачественной опухолью. Рак можно диагностировать, используя критерии, обычно принятые в данной области, включая наличие злокачественной опухоли. Фармацевтические композиции и иммуногенные композиции можно вводить либо перед, либо после хирургического удаления первичных опухолей и/или лечения, такого как проведение лучевой терапии или введение традиционных химиотерапевтических лекарственных средств. Введение можно осуществлять любым подходящим способом, включая введение внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, интраназальным, интрадермальным, анальным, вагинальным, локальным или пероральным путями. В некоторых вариантах иммунотерапия может представлять собой активную иммунотерапию, при которой лечение основано на стимуляции in vivo реакции эндогенной иммунной системы хозяина против опухолей с помощью введения агентов, модифицирующих иммунный ответ (таких как представленные здесь полипептиды и полинуклеотиды).

В других вариантах иммунотерапия может представлять собой пассивную иммунотерапию, при которой лечение включает в себя доставку агентов с установленной иммунореактивностью по отношению к опухоли (таких как эффекторные клетки или антитела), которые могут прямо или косвенно опосредовать противоопухолевое действие и не обязательно зависят от интактной иммунной системы хозяина. Примеры эффекторных клеток включают Т-клетки, которые обсуждались выше, Т-лимфоциты (такие как цитотоксические Т-лимфоциты CD8⁺ и инфильтрующие опухоль Т-хелперные лимфоциты CD4⁺), клетки-киллеры (такие как естественные киллерные клетки и активируемые лимфокинами киллерные клетки), В-клетки и антиген-презентирующие клетки (такие как дендритные клетки и макрофаги), экспрессирующие представленный здесь полипептид. Рецепторы Т-клеток и рецепторы антител, специфичные для перечисленных здесь полипептидов, можно клонировать, экспрессировать и переносить в другие векторы или эффекторные клетки для адоптивной иммунотерапии. Представленные здесь полипептиды также можно использовать для того, чтобы создать антитела или антиидиотипические антитела (как описано выше и в патенте США No. 4918164) для пассивной иммунотерапии.

Эффекторные клетки обычно можно получить в достаточных количествах для адоптивной иммунотерапии выращиванием in vitro, как здесь описано. Условия культивирования для размножения отдельной антиген-специфичной эффекторной клетки в количестве до нескольких миллиардов с сохранением узнавания антигена in vivo хорошо известны в данной области. В таких условиях культивирования in vitro обычно используют периодическую стимуляцию антигеном, часто в присутствии цитокинов (таких как IL-2) и неделящихся питающих клеток. Как указано выше, представленные здесь иммунореактивные полипептиды можно использовать, чтобы быстро размножить культуры антиген-специфичных Т-клеток для того, чтобы получить достаточное количество клеток для иммунотерапии. В частности, антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и/или В-клетки, можно импульсно подвергнуть воздействию иммунореактивных полипептидов, или трансфицировать одним или несколькими полинуклеотидами, используя стандартные способы, хорошо известные в данной области. Например, антиген-презентирующие клетки можно трансфицировать полинуклеотидом, имеющим промотор, подходящий для усиления экспрессии в рекомбинантном вирусе или другой экспрессирующей системе. Культивируемые эффекторные клетки для применения в терапии должны обладать способностью расти и широко распространяться и выживать в течение длительного времени in vivo. Исследования показали, что культивируемые эффекторные клетки можно индуцировать к росту in vivo и выживаемости в течение длительного периода времени в больших количествах многократными стимуляциями антигеном с добавлением IL-2 (смотри, например, Cheever et al., Immunological Reviews 157: 177, 1997).

Альтернативно вектор, экспрессирующий указанный здесь полипептид, можно ввести в антиген-презентирующие клетки, взятые у пациента, и клонально размножить ex vivo для трансплантации назад тому же пациенту. Трансфицированные клетки можно повторно ввести пациенту, используя любые способы, известные в данной области, предпочтительно в стерильной форме посредством внутривенного, внутриполостного, внутрибрюшинного или внутриопухолевого введения.

Пути и частота введения описанных здесь терапевтических композиций, а также доза будут варьировать от человека к человеку, и могут быть легко установлены с использованием стандартных способов. В общем, фармацевтические композиции и иммуногенные композиции можно вводить посредством инъекции (например, внутрикожной, внутримышечной, внутривенной или подкожной), интраназально (например, аспирацией) или перорально. Предпочтительно можно вводить от 1 до 10 доз в течение 52-недельного периода. Предпочтительно вводят 6 доз с интервалами в 1 месяц и после этого периодически можно проводить бустер-вакцинации. Для отдельных пациентов подходящими могут быть альтернативные протоколы. Подходящая доза представляет собой количество соединения, которое при введении, как описано выше, способно стимулировать противоопухолевый иммунный ответ и, по меньшей мере, на 10-50% выше основного (т.е. без лечения) уровня. Такой ответ можно контролировать, измеряя противоопухолевые антитела у пациента, или на основании зависимой от вакцины продукции цитолитических эффекторных клеток, способных убивать опухолевые клетки пациента in vitro. Такие иммуногенные композиции также должны обладать способностью вызывать иммунный ответ, который приводит к улучшенному клиническому исходу (например, более частым ремиссиям, полному или частичному или более длительному выживанию без признаков болезни) у пациентов, которым проводили лечение, по сравнению с пациентами, которым лечение не проводилось. В общем, для фармацевтических композиций и иммуногенных композиций, содержащих один или несколько полипептидов, количество каждого полипептида находится в пределах доз примерно от 25 мкг до 5 мг на кг массы хозяина. Подходящие величины доз будут варьировать с изменением массы пациента, но обычно будут в пределах примерно от 0,1 мл до примерно 5 мл.

В общем, подходящая доза и схема лечения обеспечивают активным соединением(ями) в количестве, достаточном для того, чтобы принести терапевтическую и/или профилактическую пользу. Такой ответ можно наблюдать при установлении улучшенного клинического исхода (например, более частых ремиссий, полного или частичного или более длительного выживания без признаков болезни) у пациентов, подвергавшихся лечению, по сравнению с пациентами, которых не лечили. Усиление предсуществующих иммунных ответов на белок опухоли молочной железы обычно коррелирует с улучшенным клиническим исходом. Такие иммунные ответы обычно оценивают, используя стандартные анализы пролиферации, цитотоксичности или цитокинов, которые можно выполнить с использованием образцов, полученных от пациента до и после лечения.

ВЫЯВЛЕНИЕ И ДИАГНОСТИКА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ.

В общем, злокачественную опухоль у пациента можно обнаружить на основе наличия одного или нескольких белков опухоли молочной железы и/или полинуклеотидов, кодирующих такие белки, в биологическом образце (например, крови, сыворотке, мокроте, моче и/или биопсиях опухолей), полученных от пациента. Другими словами, такие белки можно использовать в качестве маркеров, чтобы показать наличие или отсутствие злокачественной опухоли, такой как рак молочной железы. Кроме того, такие белки могут быть пригодны для выявления других видов злокачественных опухолей. Представленные здесь связывающие агенты обычно позволяют выявить уровень антигена, который связывается с агентом в биологическом образце. Полинуклеотидные праймеры и зонды можно использовать для того, чтобы определить уровень мРНК, кодирующей белок опухоли, который также является показателем наличия или отсутствия злокачественной опухоли. В общем, последовательность опухоли молочной железы должна присутствовать на уровне, который, по меньшей мере, в три раза выше в опухолевой ткани, чем в нормальной ткани.

Существует множество разновидностей анализа, известных специалистам в данной области, с использованием связывающего агента для выявления полипептидных маркеров в образце. Смотри, например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. В общем, наличие или отсутствие злокачественной опухоли у пациента можно обнаружить посредством: (а) осуществления контакта биологического образца, полученного от пациента, со связывающим агентом; (b) определения в образце уровня полипептида, который связывается со связывающим агентом; и (с) сравнения уровня полипептида с предварительно определенным отсекающим “cut-off” значением.

В предпочтительном варианте анализ включает в себя применение связывающего агента, иммобилизованного на твердом носителе, для того, чтобы связать и удалить полипептид из остальной части образца. Затем связанный полипептид можно обнаружить, используя реагент для детекции, который содержит репортерную группу, и специфично связывается с комплексом связывающий агент/полипептид. Такие реагенты для детекции могут содержать, например связывающий агент, который специфично связывается с полипептидом или антителом, или другим агентом, который специфично связывается со связывающим агентом, такой как анти-иммуноглобулин, белок G, белок А или лектин. Альтернативно можно использовать конкурентный анализ, при котором полипептид метят репортерной группой и дают возможность связаться с иммобилизованным связывающим агентом после инкубации связывающего агента с образцом. Степень, с которой соединения образца ингибируют связывание меченого полипептида со связывающим агентом, является показателем реактивности образца с иммобилизованным связывающим агентом. Подходящие полипептиды для применения в таких анализах включают белки опухоли молочной железы полной длины и их части, с которыми связывается связывающий агент, как описано выше.

Твердым носителем может быть любой материал, известный специалистам в данной области, с которым может связываться белок опухоли. Например, твердым носителем может быть опытная лунка в планшете для микротитрования или нитроцеллюлоза или другая подходящая мембрана. Альтернативно носителем может быть шарик или диск, такой как носитель из стекла, стекловолокна, латекса или пластмассы, такой как полистирол или поливинилхлорид. Носителем также может быть магнитная частица или волоконно-оптический сенсор, такой как сенсоры, описанные, например, в патенте США No. 5359681. Связывающий агент может быть иммобилизован на твердом носителе с использованием ряда способов, известных специалистам в данной области, которые подробно описаны в патентной и научной литературе. В контексте данного изобретения термин «иммобилизация» относится как к нековалентной ассоциации, такой как адсорбция, так и к ковалентному связыванию (которое может представлять собой образование прямой связи между агентом и функциональными группами носителя, или может быть связыванием с помощью перекрестно сшивающего агента). Предпочтительна иммобилизация путем адсорбции в лунке планшета для микротитрования или на мембране. В таких случаях адсорбцию можно достичь, обеспечивая контакт связывающего агента в подходящем буфере с твердым носителем в течение подходящего количества времени. Время контакта варьирует с изменением температуры, но обычно составляет примерно между 1 часом и 1 сутками. В общем, контактирование лунки пластмассового планшета для микротитрования (такого как из полистирола или поливинилхлорида) с количеством связывающего агента в пределах примерно от 10 нг до примерно 10 мкг, и предпочтительно примерно от 100 нг до 1 мкг, достаточно для того, чтобы иммобилизовать адекватное количество связывающего агента.

Ковалентное связывание связывающего агента с твердым носителем, как правило, можно осуществить сначала путем реакции носителя с бифункциональным реагентом, который будет реагировать как с носителем, так и функциональной группой, такой как гидроксильная или аминогруппа в связывающем агенте. Например, связывающий агент можно ковалентно связать с носителями, имеющими подходящее полимерное покрытие, с использованием бензохинона или путем конденсации альдегидной группы носителя с амином и активным водородом связывающего партнера (смотри, например, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13).

В некоторых вариантах анализ представляет собой анализ с двумя антителами типа «сэндвича». Указанный анализ можно выполнить, обеспечивая сначала контакт антитела, которое было иммобилизовано на твердом носителе, обычно в лунке планшета для микротитрования, с образцом, так чтобы дать возможность полипептидам в образце связаться с иммобилизованным антителом. Затем несвязанный образец удаляют из иммобилизованных комплексов полипептида-антитела и добавляют детектирующий реагент (предпочтительно второе антитело, способное связываться с другим сайтом полипептида), содержащий репортерную группу. Затем определяют количество детектирующего агента, которое остается связанным с твердым носителем, используя способ, подходящий для конкретной репортерной группы.

Более конкретно, после того, как антитело иммобилизуют на носителе, как описано выше, оставшиеся сайты связывания белка на носителе обычно блокируют любым подходящим блокирующим агентом, известным специалистам в данной области, таким как бычий сывороточный альбумин или Твин 20^TM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Затем иммобилизованное антитело инкубируют с образцом и дают возможность полипептиду связаться с антителом. Образец перед инкубацией можно разбавлять подходящим разбавителем, таким как забуференный фосфатами солевой раствор (PBS). В общем, соответствующее время контакта (т.е. время инкубации) представляет собой период времени, который достаточен для того, чтобы обнаружить присутствие полипептида в образце, полученном от индивидуума с раком молочной железы. Предпочтительно время контакта является достаточным для того, чтобы добиться уровня связывания, который составляет, по меньшей мере, приблизительно 95% от уровня, достигаемого при равновесии между связанным и несвязанным полипептидом. Специалисты в данной области поймут, что время, необходимое для того, чтобы достичь равновесия, можно легко определить, анализируя уровень связывания, которое происходит в течение периода времени. При комнатной температуре обычно достаточно время инкубации около 30 минут.

Затем несвязанный образец можно удалить промывкой твердого носителя соответствующим буфером, таким как PBS, содержащим 0,1% Твина 20^ТМ. Затем к твердому носителю можно добавить второе антитело, которое содержит репортерную группу. Предпочтительные репортерные группы включают группы, которые перечислены выше.

Затем детектирующий реагент инкубируют с иммобилизованным комплексом антитело-полипептид в течение времени, достаточного для того, чтобы обнаружить связанный пептид. Соответствующий период времени обычно можно определить, анализируя уровень связывания, которое происходит в течение некоторого периода времени. Затем несвязанный детектирующий реагент удаляют, а связанный детектирующий реагент определяют, используя репортерную группу. Используемый для выявления репортерной группы способ зависит от природы репортерной группы. Для радиоактивных групп обычно подходят способы сцинтилляционного подсчета или авторадиографии. Спектроскопические способы можно использовать для детекции красителей, люминесцентных групп и флуоресцентных групп. Биотин можно выявлять, используя авидин, связанный с другой репортерной группой (обычно радиоактивной или флуоресцентной группой или ферментом). Ферментные репортерные группы обычно можно детектировать добавлением субстрата (обычно в течение определенного периода времени) с последующим спектроскопическим или другим анализом продуктов реакции.

Чтобы определить наличие или отсутствие злокачественной опухоли, такой как рак молочной железы, сигнал, детектируемый от репортерной группы, которая остается связанной с твердым носителем, обычно сравнивают с сигналом, соответствующим предварительно определенному отсекающему (“cut-off”) значению. В одном предпочтительном варианте отсекающим значением для выявления злокачественной опухоли является среднее значение сигнала, получаемого в том случае, когда иммобилизованное антитело инкубируют с образцами от пациентов, не имеющих злокачественных опухоли. В общем, образец, генерирующий сигнал, который на три стандартных отклонения выше предварительно определенного отсекающего значения, считается позитивным в отношении злокачественной опухоли. В альтернативном предпочтительном варианте отсекающее значение определяют, используя рабочую характеристическую кривую согласно способу Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7. Коротко, в этом варианте отсекающее значение можно определить на основе графика пар истинно позитивных оценок (т.е. чувствительности) и ложно позитивных оценок (100%-специфичности), которые соответствуют каждому возможному отсекающему значению для результата диагностического теста. Отсекающее значение на графике, которое является самым близким к верхнему левому углу (т.е. значение, которое охватывает самую большую площадь), является наиболее точным отсекающим (“cut-off”) значением, и образец, генерирующий сигнал, который выше, чем отсекающее значение, определенное этим способом, может считаться позитивным. Альтернативно отсекающее значение может быть сдвинуто влево вдоль графика, чтобы минимизировать ложно позитивную оценку, или вправо, чтобы минимизировать ложно отрицательную оценку. В общем, образец, генерирующий сигнал, который выше, чем отсекающее значение, определенное этим способом, считается позитивным в отношении злокачественной опухоли.

В связанном варианте анализ выполняют в виде теста в проточном режиме или теста на стрип-полосках, где связывающий агент иммобилизован на мембране, такой как нитроцеллюлоза. В проточном тесте полипептиды в образце связываются с иммобилизованным связывающим агентом по мере того, как образец проходит через мембрану. Затем второй меченый связывающий агент связывается с комплексом, связывающим агент-полипептид по мере того, как раствор, содержащий второй связывающий агент, протекает сквозь мембрану. Затем можно провести детекцию второго связывающего агента, как описано выше. В варианте теста на стрип-полосках один конец мембраны, с которой связан связывающий агент, погружают в раствор, содержащий образец. Образец мигрирует вдоль мембраны через район, содержащий второй связывающий агент, и к области иммобилизованного связывающего агента. Концентрирование второго связывающего агента в области иммобилизованного антитела указывает на наличие злокачественной опухоли. Обычно, концентрирование второго связывающего агента в этом месте создает рисунок, такой как линия, которую можно наблюдать визуально. Отсутствие такого рисунка свидетельствует об отрицательном результате. В общем, количество связывающего агента, иммобилизованного на мембране, выбирают так, чтобы возникал визуально заметный рисунок в том случае, когда биологический образец содержит уровень полипептида, который был бы достаточным для генерации позитивного сигнала при сэндвич-анализе с двумя антителами в обсуждаемой выше форме. Предпочтительными связывающими агентами для применения в таких анализах являются антитела и их антиген-связывающие фрагменты. Предпочтительно количество антитела, иммобилизованного на мембране, находится в пределах примерно от 25 нг до 1 мкг, и более предпочтительно примерно от 50 нг до 500 нг. Такие тесты обычно можно выполнять с очень небольшими количествами биологического образца.

Конечно, существует множество других протоколов анализа, которые подходят для применения с опухолевыми белками или связывающими агентами согласно данному изобретению. Приведенные выше описания предназначены только в качестве примеров. Например, для специалистов в данной области будет очевидно, что указанные выше протоколы легко можно модифицировать для использования полипептидов опухоли молочной железы, чтобы выявить антитела, которые связываются с такими полипептидами в биологическом образце. Выявление таких антител, специфичных для белка опухоли молочной железы, может коррелировать с наличием злокачественной опухоли.

Злокачественную опухоль также или альтернативно можно обнаружить на основе наличия Т-клеток, которые специфично реагируют с белком опухоли молочной железы в биологическом образце. В некоторых способах биологический образец, содержащий CD4⁺ и/или CD8⁺ Т-клетки, выделенный из организма пациента, инкубируют с полипептидом опухоли молочной железы, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид и/или АПК, которая экспрессирует, по меньшей мере, иммуногенную часть такого полипептида, и выявляют наличие или отсутствие специфичной активации Т-клеток. Подходящие биологические образцы включают, но не ограничены этим, изолированные Т-клетки. Например, Т-клетки можно выделить из организма пациента обычными способами (такими как посредством центрифугирования лимфоцитов периферической крови в градиенте плотности Фикола/Гипака). Т-клетки можно инкубировать с полипептидом (например, 5-25 мкг/мл) in vitro в течение 2-9 дней (обычно 4 дня) при 37⁰С. Может потребоваться инкубация другой аликвоты образца Т-клеток в отсутствии полипептида опухоли молочной железы, что служит в качестве контроля. Для Т-клеток CD4⁺ активацию предпочтительно определяют посредством оценки пролиферации Т-клеток. Для Т-клеток CD8⁺ активацию предпочтительно определяют по оценке цитолитической активности. Уровень пролиферации, который, по меньшей мере, в два раза выше, и/или уровень цитолитической активности, который, по меньшей мере, на 20% выше, чем у пациентов без признаков болезни, свидетельствует о наличии злокачественной опухоли у пациента.

Как указано выше злокачественную опухоль можно также, или альтернативно, обнаружить на основе уровня мРНК, кодирующей белок опухоли молочной железы, в биологическом образце. Например, можно использовать, по меньшей мере, два олигонуклеотидных праймера в анализе, основанном на полимеразной цепной реакции (ПЦР), чтобы амплифицировать часть кДНК опухоли молочной железы, полученной из биологического образца, при этом, по меньшей мере, один из олигонуклеотидных праймеров специфичен по отношению к полинуклеотиду (т.е. гибридизуется с ним), кодирующему белок опухоли молочной железы. Затем амплифицированную кДНК отделяют и определяют, используя способы, хорошо известные в данной области, такие как гель-электрофорез. Сходным образом, олигонуклеотидные зонды, которые специфично гибридизуются с полинуклеотидом, кодирующим белок опухоли молочной железы, можно использовать в гибридизационном анализе, чтобы выявить наличие полинуклеотида, кодирующего белок опухоли, в биологическом образце.

Чтобы обеспечить возможность гибридизации в условиях анализа олигонуклеотидные праймеры и зонды должны содержать олигонуклеотидную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 60%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 75% и более предпочтительно, по меньше мере, примерно на 90% идентична части полинуклеотида, кодирующего белок опухоли молочной железы, которая имеет длину, по меньшей мере, 10 нуклеотидов и предпочтительно, по меньшей мере, 20 нуклеотидов. Предпочтительно олигонуклеотидные праймеры и/или зонды гибридизуются с полинуклеотидом, кодирующим описанный здесь полипептид, в условиях средней жесткости, которые определены выше. Олигонуклеотидные праймеры и/или зонды, которые можно успешно использовать в описанных здесь диагностических способах, предпочтительно имеют длину, по меньшей мере, 10-40 нуклеотидов. В предпочтительном варианте олигонуклеотидные праймеры содержат, по меньшей мере, 10 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов молекулы ДНК, имеющей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 и 489. Способы проведения как анализов, основанных на ПЦР, так и гибридизационных анализов хорошо известны в данной области (смотри, например, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

В одном предпочтительном анализе используют ОТ-ПЦР, при которой ПЦР применяют вместе с обратной транскрипцией. Обычно, РНК экстрагируют из биологического образца, такого как ткань биопсии, и обратно транскрибируют, чтобы получить молекулы кДНК. ПЦР-амплификация с использованием, по меньшей мере, одного специфичного праймера дает молекулу кДНК, которую можно отделить и визуализировать, например, с использованием гель-электрофореза. Амплификацию можно выполнять на биологических образцах, взятых у тестируемого пациента и у индивидуума, который не поражен злокачественной опухолью. Реакцию амплификации можно выполнить при нескольких разведениях кДНК, охватывающих два порядка значений. Двукратное или большее увеличение экспрессии в нескольких разведениях образца тестируемого пациента по сравнению с такими же разведениями не ракового образца обычно считают позитивным.

В другом варианте описанные здесь композиции можно использовать в качестве маркеров прогрессирования злокачественной опухоли. В этом варианте анализы, которые описаны выше для диагностики злокачественной опухоли, можно выполнять в течение некоторого периода времени и оценить изменение в уровне реактивного полипептида(дов) или полинуклеотида(дов). Например, можно выполнять анализ каждые 24-72 часов в течение периода времени от 6 месяцев до 1 года и после этого выполнять по необходимости. В общем, злокачественная опухоль является прогрессирующей у тех пациентов, у которых выявляемый уровень полипептида или полинуклеотида увеличивается с течением времени. Напротив, злокачественная опухоль не является прогрессирующей, когда уровень реактивного полипептида или полинуклеотида либо остается постоянным, либо снижается со временем.

Некоторые диагностические анализы in vivo можно выполнять непосредственно на опухоли. Один такой анализ включает в себя осуществление контакта опухолевых клеток со связывающим агентом. Связанный связывающий агент затем можно детектировать непосредственно или косвенно посредством репортерной группы. Такие связывающие агенты также можно использовать для гистологического применения. Альтернативно для таких применений можно использовать полинуклеотидные зонды.

Как указано выше, чтобы повысить чувствительность, в данном образце можно анализировать различные белковые маркеры опухоли молочной железы. Будет очевидно, что связывающие агенты, специфичные для различных представленных здесь белков, можно комбинировать в одном анализе. Кроме того, можно согласовано использовать многочисленные праймеры или зонды. Выбор белковых маркеров опухоли может быть основан на рутинных экспериментах, чтобы определить комбинации, которые в результате дают оптимальную чувствительность. Дополнительно или альтернативно анализы представленных здесь белков опухоли можно комбинировать с анализами других известных опухолевых антигенов.

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ НАБОРЫ.

Данное изобретение, кроме того, относится к наборам для использования в любом указанном выше диагностическом способе. Такие наборы обычно содержат два или несколько компонентов, необходимых для выполнения диагностического анализа. Компонентами могут быть соединения, реагенты, емкости и/или оборудование. Например, один контейнер с набором может содержать моноклональное антитело или его фрагмент, который специфично связывается с белком опухоли молочной железы. Такие антитела или фрагменты могут быть предоставлены связанными с материалом носителя, как описано выше. Один или несколько дополнительных контейнеров могут содержать элементы, такие как реагенты или буферы для использования в анализе. Такие наборы могут также или альтернативно содержать детектирующий реагент, как описано выше, который содержит репортерную группу, пригодную для прямой или косвенной детекции связывания антитела.

Альтернативно набор может быть предназначен для определения уровня мРНК, кодирующей белок опухоли молочной железы, в биологическом образце. Такие наборы обычно содержат, по меньшей мере, один олигонуклеотидный зонд или праймер, описанный выше, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим белок опухоли молочной железы. Такой олигонуклеотид можно, например, использовать в ПЦР или гибридизационном анализе. Дополнительные компоненты, которые могут присутствовать в таких наборах, включают второй олигонуклеотид и/или диагностический реагент, или контейнер, чтобы облегчить выявление полинуклеотида, кодирующего белок опухоли молочной железы. Следующие примеры предлагаются с целью иллюстрации, но не с целью ограничения.

ПРИМЕР 1.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИПЕПТИДОВ

ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

В данном примере описано выделение полипептидов опухоли молочной железы из библиотеки кДНК опухоли молочной железы.

Вычтенную библиотеку кДНК, содержащую кДНК из опухоли молочной железы, вычтенную с использованием кДНК нормальной молочной железы, конструировали следующим образом. Суммарную РНК экстрагировали из первичных тканей, используя реагент Tryzol (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD), как описано производителем. ПолиА⁺-РНК очищали, используя колонку с олиго-dT-целлюлозой согласно стандартным протоколам. Первую нить кДНК синтезировали, используя праймер, поставляемый в наборе для вычитания кДНК при избирательной ПЦР Clontech (Clontech, Palo Alto, CA). Драйверная ДНК состояла из кДНК из двух нормальных тканей молочной железы, при этом тестируемая ДНК была из трех первичных опухолей молочной железы. Двунитевую кДНК синтезировали как в случае тестируемой, так и в случае драйверной ДНК и расщепляли комбинацией эндонуклеаз (MluI, MscI, PvuII, SalI и StuI), которые узнают шесть пар оснований ДНК. Указанная модификация значительно увеличивала средний размер кДНК по сравнению с кДНК, образуемыми согласно протоколу Clontech (Palo Alto, CA). Расщепленные тестируемые кДНК лигировали с двумя разными адаптерами и вычитание выполняли согласно протоколу Clontech. Вычтенную кДНК подвергали двум раундам ПЦР-амплификации, следуя протоколу производителя. Полученные в результате продукты ПЦР субклонировали в клонирующем векторе ТА, pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) и посредством электропорации трансформировали клетки E. coli DH10B ElectroMax (Gibco BRL Life, Technologies). Из независимых клонов выделяли ДНК и секвенировали, используя автоматический секвенатор модели 373А Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (Foster City, CA).

В вычтенной специфичной для опухоли молочной железы библиотеке кДНК обнаружено шестьдесят три отдельных клона кДНК. Определенные последовательности кДНК одной нити (5′ или 3′) представлены в SEQ ID NO: 1-61, 72 и 73, соответственно. Сравнение указанных последовательностей кДНК с известными последовательностями в банке генов с использованием баз данных EMBL и GenBank (выпуск 97) не выявило значимой гомологии с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 14, 21, 22, 27, 29, 30, 32, 38, 44, 45, 53, 72 и 73. Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 1, 3, 16, 17, 34, 48, 57, 60 и 61 представляют известные гены человека. Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 2, 4, 23, 39 и 50 проявляют некоторое сходство с ранее идентифицированными генами не человека, а других организмов. Обнаружено, что остальные клоны (SEQ ID NO: 5-13, 15, 18-20, 24-26, 28, 31, 33, 35-37, 40-43, 46, 47, 49, 51, 52, 54-56, 58 и 59) проявляют, по меньшей мере, некоторую степень гомологии с ранее идентифицированными маркерными экспрессируемыми последовательностями (EST).

Чтобы определить уровни экспрессии мРНК изолированных клонов кДНК, случайным образом отбирали клоны кДНК после описанного выше вычитания в случае молочной железы и проводили ПЦР-амплификацию колоний. Уровни экспрессии мРНК этих клонов в опухоли молочной железы, нормальной молочной железе и различных других нормальных тканях определяли, используя технологию микроматриц (Synteni, Palo Alto, CA). Коротко, продукты ПЦР-амплификации располагали на предметном стекле в виде матрицы, при этом каждый продукт занимал единственное положение в матрице. мРНК экстрагировали из образца ткани для тестирования, обратно транскрибировали и получали флуоресцентно меченые кДНК-зонды. Микроматрицы зондировали с помощью меченых кДНК-зондов, предметные стекла сканировали и измеряли интенсивность флуоресценции. Данные анализировали с использованием компьютерной программы GEMTOOLS, предоставленной Synteni. Обнаружено, что из семнадцати проверенных клонов кДНК, клоны кДНК, представленные SEQ ID NO: 40, 46, 59 и 73, сверхэкспрессировались в опухоли молочной железы, и на низких уровнях экспрессировались во всех тестированных нормальных тканях (молочной железе, PBMC, ободочной кишке, ткани плода, слюнной железе, костном мозге, легком, толстом кишечнике, спинном мозге, надпочечнике, почке, печени, желудке, скелетной мышце, сердце, тонком кишечнике, коже, головном мозге и эпителиальных клетках молочной железы человека). Обнаружено, что клоны SEQ ID NO: 41 и 48 сверхэкспрессировались в опухоли молочной железы и экспрессировались на низких уровнях во всех других тестированных тканях, за исключением костного мозга. Обнаружено, что клон SEQ ID NO: 42 сверхэкспрессировался в опухоли молочной железы и экспрессировался на низких уровнях во всех других тестированных тканях, за исключением костного мозга и спинного мозга. Обнаружено, что клон SEQ ID NO: 43 сверхэкспрессировался в опухоли молочной железы и экспрессировался на низких уровнях во всех других тестированных тканях, за исключением спинного мозга, сердца и тонкого кишечника. Обнаружено, что клон SEQ ID NO: 51 сверхэкспрессировался в опухоли молочной железы и экспрессировался на низких уровнях во всех других тестированных тканях, за исключением толстого кишечника. Обнаружено, что клон SEQ ID NO: 54 сверхэкспрессировался в опухоли молочной железы и экспрессировался на низких уровнях во всех других тестированных тканях, за исключением PBMC, желудка и тонкого кишечника. Обнаружено, что клон SEQ ID NO: 56 сверхэкспрессировался в опухоли молочной железы и экспрессировался на низких уровнях во всех других тестированных тканях, за исключением толстого и тонкого кишечника, клеток эпителия молочной железы человека и опухоли молочной железы, пассированной у мышей SCID. Обнаружено, что клон SEQ ID NO: 60 сверхэкспрессировался в опухоли молочной железы и экспрессировался на низких уровнях во всех других тестированных тканях, за исключением спинного мозга и сердца. Обнаружено, что клон SEQ ID NO: 61 сверхэкспрессировался в опухоли молочной железы и экспрессировался на низких уровнях во всех других тестированных тканях, за исключением тонкого кишечника. Обнаружено, что клон SEQ ID NO: 72 сверхэкспрессировался в опухоли молочной железы и экспрессировался на низких уровнях во всех других тестированных тканях, за исключением ободочной кишки и слюнной железы.

Результаты Нозерн-блот-анализа клона SYN18C6 (SEQ ID NO: 40) показаны на чертеже. Рассчитанная последовательность белка, кодируемого SYN18C6, представлена в SEQ ID NO: 62.

Дополнительные клоны кДНК, которые сверхэкспрессируются в ткани опухоли молочной железы, выделяли из вычтенных библиотек кДНК молочной железы следующим образом. Вычтенные библиотеки молочной железы получали, как описано выше посредством основанного на ПЦР вычитания с использованием пулов кДНК опухоли молочной железы в качестве тестируемой ДНК и либо пулов кДНК нормальной молочной железы, либо пулов кДНК из других нормальных тканей в качестве драйверной ДНК. Клоны кДНК из молочной железы после вычитания отбирали случайным образом и проводили ПЦР-амплификацию колоний, и определяли уровни экспрессии их мРНК в опухоли молочной железы, нормальной молочной железе и различных других нормальных тканях, используя технологию микроматриц, описанную выше. Обнаружено, что двадцать четыре отдельных клона кДНК сверхэкспрессируются в опухоли молочной железы и экспрессируются на низких уровнях во всех тестированных нормальных тканях (молочной железе, головном мозге, печени, поджелудочной железе, легком, слюнной железе, желудке, ободочной кишке, почке, костном мозге, скелетной мышце, PBMC, сердце, тонком кишечнике, надпочечнике, спинном мозге, толстом кишечнике и коже). Определенные последовательности кДНК указанных клонов представлены в SEQ ID NO: 63-87. Сравнение последовательностей SEQ ID NO: 74-87 с последовательностями в банке генов как описано выше выявило гомологию с ранее идентифицированными генами человека. Не выявлено значимой гомологии с последовательностями SEQ ID NO: 63-73.

Три изоформы ДНК для клона B726P (неполная последовательность указана в SEQ ID NO: 71) выделяли следующим образом. Синтезировали радиоактивный зонд на основе B726P вырезанием ДНК B726P из вектора pT7Blue (Novagen) посредством расщепления рестриктазами BamHI/XbaI и используя полученную в результате ДНК в качестве матрицы в однонитевой ПЦР в присутствии [-32P] dCTP. Последовательность используемого праймера для данной ПЦР представлена в SEQ ID NO: 177. Полученный в результате радиоактивный зонд использовали для исследования библиотеки кДНК, полученной с направленным праймером, и библиотеки кДНК, полученной со случайным праймером, созданных с использованием РНК, выделенной из опухолей молочной железы. Восемьдесят пять клонов идентифицировали, вырезали, очищали и секвенировали. Обнаружено, что из указанных 85 клонов три содержат значащую открытую рамку считывания. Определенная последовательность кДНК изоформы B726P-20 представлена в SEQ ID NO: 175, при этом соответствующая рассчитанная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 176. Определенная последовательность кДНК изоформы B726P-74 представлена в SEQ ID NO: 178, а соответствующая рассчитанная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 179. Определенная последовательность кДНК изоформы B726P-79 представлена в SEQ ID NO: 180, а соответствующая рассчитанная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 181.

Попытки получить полноразмерный клон B726P с использованием стандартных способов привели к выделению пяти дополнительных клонов, которые представляют дополнительные 5′-последовательности B726P. Указанные клоны, по-видимому, являются формами альтернативного сплайсинга одного и того же гена. Определенные последовательности кДНК указанных клонов приведены в SEQ ID NO: 464-468, а рассчитанные аминокислотные последовательности, кодируемые SEQ ID NO: 464-467, соответственно представлены в SEQ ID NO: 470-473. Используя стандартные компьютерные технологии, создали консенсусную последовательность ДНК длиной 3681 п.н. (SEQ ID NO: 463), которая содержит две большие открытые рамки считывания. «Правая» ORF кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 181. Рассчитанная аминокислотная последовательность, кодируемая «левой» ORF, представлена в SEQ ID NO: 469. Последующие исследования привели к выделению дополнительной формы сплайсинга B726P, которая имеет вставку размером 184 п.н. по сравнению с другими формами. Указанная вставка размером 184 п.н. вызывает сдвиг рамки считывания, который сводит вместе «левую» и «правую» ORF в одну ORF, которая имеет длину 1002 а/к. Определенная последовательность кДНК указанной альтернативной формы сплайсинга указана в SEQ ID NO: 474, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 475.

Дальнейшее выделение отдельных клонов, которые сверхэкспрессируются в ткани опухоли молочной железы, проводили с использованием технологии библиотеки вычтенной кДНК, описанной выше. В частности, в указанном скрининге использовали библиотеку вычтенной кДНК, содержащую кДНК из опухолей молочной железы, вычтенную с использованием кДНК из пяти других нормальных тканей (головного мозга, печени, PBMC, поджелудочной железы и нормальной молочной железы). Исходя из начального вычитания отобрано сто семьдесят семь клонов для дальнейшей характеристики посредством секвенирования ДНК и анализа на микроматрицах. Анализ на микроматрицах показал, что последовательности SEQ ID NO: 182-251 и 479 экспрессировались в тканях опухоли молочной железы человека на уровне, в два или более раз превышающем уровень экспрессии в нормальных тканях человека. Не выявлено значимой гомологии для девятнадцати из указанных клонов, включая SEQ ID NO: 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246 и 479, за исключением некоторых ранее идентифицированных маркерных экспрессируемых последовательностей (EST). Остальные клоны проявляли некоторую гомологию с ранее идентифицированными генами, в частности, SEQ ID NO: 181-184, 187-193, 195-198, 200-204, 206, 207, 209, 210, 212, 213, 217, 218, 220, 221, 223-225, 227-231, 233-235, 237-239, 242-244 и 247-251.

Обнаружено, что один из клонов кДНК, выделенных вычитанием на основе ПЦР, как описано выше, (SEQ ID NO: 476; обозначаемый B720P), который, как показано в анализе на микроматрице, сверхэкспрессировался в тканях опухоли молочной железы, идентичен известному гену кератина. Последовательность кДНК полной длины известного гена кератина представлена в SEQ ID NO: 477, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 478. На основе последовательности SEQ ID NO: 477 созданы праймеры и использованы для того, чтобы клонировать кДНК полной длины на основе мРНК, которую получали из суммарной РНК, дающей высокий уровень экспрессии B720P в анализе ПЦР в режиме реального времени. Затем продукты клонировали и секвенировали. Определенная последовательность кДНК B720P полной длины представлена в SEQ ID NO: 484, а соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 485.

В последующих анализах идентифицировали укороченную форму B720P (названную B720P-tr) в карциномах молочной железы. Указанный антиген клонировали на основе мРНК, полученной из суммарной РНК опухоли молочной железы, которая давала высокий уровень экспрессии B720P-tr при ПЦР-анализе в реальном времени. мРНК использовали для того, чтобы создать пул кДНК, который затем использовали в качестве матрицы для амплификации посредством ПЦР кДНК, соответствующей B720P-tr. Определенная последовательность кДНК B720P-tr представлена в SEQ ID NO: 486. B720P-tr имеет ORF размером 708 пар нуклеотидов, которая кодирует белок из 236 аминокислот (SEQ ID NO: 487). Размер транскрипта подтвердили посредством Нозерн-анализа.

Из семидесяти клонов, показывающих сверхэкспрессию в тканях опухолей молочной железы, пятнадцать показали особенно высокие уровни экспрессии в опухоли молочной железы по сравнению с нормальными тканями человека. Следующие одиннадцать клонов не проявили какой-либо значимой гомологии с какими-либо известными генами. Клон 19463.1 (SEQ ID NO: 185) сверхэкспрессировался в большинстве тестируемых опухолей молочной железы, а также в опухолях молочной железы SCID (смотри пример 2); кроме того, сверэкспрессия была обнаружена в большинстве нормальных тканей молочной железы. Клон 19483.1 (SEQ ID NO: 216) сверхэкспрессировался в нескольких опухолях молочной железы и при этом не сверхэкспрессировался ни в какой из тестированных нормальных тканей. Обнаружили, что клон 19470.1 (SEQ ID NO: 219) слабо сверхэкспрессировался в некоторых опухолях молочной железы. Обнаружили, что клон 19468.1 (SEQ ID NO: 222) слабо сверхэкспрессировался в большинстве тестированных опухолей молочной железы. Обнаружили, что клон 19505.1 (SEQ ID NO: 226) слабо сверхэкспрессировался в 50% опухолей молочной железы, а также в тканях опухолей SCID, при этом некоторая степень сверхэкспрессии выявлялась в нормальной молочной железе. Обнаружили, что клон 1509.1 (SEQ ID NO: 232) сверхэкспрессировался в очень немногих опухолях молочной железы, при этом некоторая степень сверхэкспрессии наблюдалась в тканях метастазирующей опухоли молочной железы, а также не обнаружено значительной сверхэкспрессии в нормальных тканях. Показали, что клон 19513.1 (SEQ ID NO: 236) незначительно сверхэкспрессировался в немногих опухолях молочной железы, при этом в нормальных тканях не выявляли значимых уровней сверхэкспрессии. Клон 19575.1 (SEQ ID NO: 240) давал низкий уровень сверхэкспрессии в некоторых опухолях молочной железы, а также в нормальной молочной железе. Клон 19560.1 (SEQ ID NO: 241) сверхэкспрессировался в 50% тестированных опухолей молочной железы, а также в некоторых нормальных тканях молочной железы. Клон 19583.1 (SEQ ID NO: 245) незначительно сверхэкспрессировался в некоторых опухолях молочной железы, при этом в нормальных тканях выявляли очень низкие уровни сверхэкспрессии. Клон 19587.1 (SEQ ID NO: 246) показывал низкий уровень сверхэкспрессии в некоторых опухолях молочной железы и не давал значимой сверхэкспрессии в нормальных тканях.

Обнаружили, что клон 19520.1 (SEQ ID NO: 233), проявляющий гомологию с клоном 102D24 хромосомы 11q13.31, сверхэкспрессировался в опухолях молочной железы и в опухолях SCID. Обнаружили, что клон 19517.1 (SEQ ID NO: 237), проявляющий гомологию с клоном 128М19 PAC человека, незначительно сверхэкспрессировался в большинстве тестированных опухолей молочной железы. Показали что клон 19392.2 (SEQ ID NO: 247), проявляющий гомологию с хромосомой 17 человека, сверхэкспрессировался в 50% тестированных опухолей молочной железы. Показали, что клон 19399.2 (SEQ ID NO: 250), проявляющий гомологию с GSHB-184P14 ВАС Хр22 человека, незначительно сверхэкспрессировался в ограниченном количестве тестированных опухолей молочной железы.

В последующих исследованиях выделили 64 отдельных клона из вычтенной библиотеки кДНК, содержащей кДНК из пула опухолей молочной железы, вычтенного с использованием кДНК из пяти нормальных тканей (головного мозга, печени, PBMC, поджелудочной железы и нормальной молочной железы). Вычтенную библиотеку кДНК готовили как описано выше со следующими модификациями. Чтобы расщепить кДНК вместо RsaI использовали комбинацию пяти разрезающих шести-нуклеотидные сайты ферментов (MluI, MscI, PvuII, SalI и StuI). Результатом этого было увеличение среднего размера вставки с 300 п.н. до 600 п.н. 64 Выделенных клона подвергали ПЦР-амплификации колоний и оценивали уровни экспрессии их мРНК в ткани опухоли молочной железы, нормальной молочной железе и различных других нормальных тканях с помощью технологии микроматриц, как описано выше. Определенные последовательности кДНК 11 клонов, которые, как было обнаружено, сверхэкспрессировались в ткани опухоли молочной железы, представлены в SEQ ID NO: 405-415. Сравнение указанных последовательностей с последовательностями опубликованных баз данных, как указано выше, выявило гомологию последовательностей SEQ ID NO: 408, 411, 413 и 414 и ранее выделенных EST. Обнаружили, что последовательности SEQ ID NO: 405-407, 409, 410, 412 и 415 проявляли некоторую гомологию с ранее идентифицированными последовательностями.

В следующих исследованиях вычтенную библиотеку кДНК получали на основе кДНК из метастазирующих опухолей молочной железы, вычтенных с использованием пула кДНК из пяти нормальных тканей (молочной железы, головного мозга, легкого, поджелудочной железы и PBMC), применяя протокол ПЦР-вычитания Clontech, описанный выше. Определенные последовательности кДНК 90 клонов, выделенных из библиотеки, представлены в SEQ ID NO: 316-404. Сравнение указанных последовательностей с последовательностями в опубликованных базах данных, как описано выше, не выявило значимой гомологии с последовательностью SEQ ID NO: 366. Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 321-325, 343, 354, 368, 369, 377, 382, 385, 389, 395, 397 и 400 проявляли некоторую гомологию с ранее выделенными EST. Обнаружено, что остальные последовательности проявляют гомологию с ранее идентифицированными генными последовательностями.

В следующих исследованиях вычтенную библиотеку кДНК (названную 2BT) получали на основе кДНК из опухолей молочной железы, вычтенной с использованием пула кДНК шести нормальных тканей (печени, головного мозга, желудка, тонкого кишечника, почки и сердца) с применением протокола ПЦР-вычитания Clontech, описанного выше. Клоны кДНК, выделенные после указанного вычитания, подвергали анализу ДНК на микроматрице, как описано выше, и полученные в результате данные подвергали четырем модифицированным анализам Gemtools. В первом анализе сравнивали 28 опухолей молочной железы с 28 нормальными тканями, не относящимися к молочной железе. В качестве отсекающего значения при отборе использовали, по меньшей мере, 2,1-кратную среднюю сверхэкспрессию. Во втором анализе сравнивали 6 метастазирующих опухолей молочной железы с 29 нормальными тканями, не относящимися к молочной железы. В качестве отсекающего значения использовали, по меньшей мере, 2,5-кратную среднюю сверхэкспрессию. В третьем и четвертом анализах сравнивали 2 опухоли ранних пассажей у мышей SCID с двумя опухолями поздних пассажей у мышей SCID. В качестве отсекающего значения при отборе использовали 2,0-кратную или более высокую среднюю сверхэкспрессию в опухолях ранних или поздних пассажей. Кроме того, проводили визуальный анализ данных по микроматрицам для клонов 2BT. Определенные последовательности кДНК 13 клонов, идентифицированных в визуальном анализе, представлены в SEQ ID NO: 427-439. Определенные последовательности кДНК 22 клонов, идентифицированных с использованием модифицированного анализа Gemtools, представлены в SEQ ID NO: 440-462, где SEQ ID NO: 453 и 454 представляют собой две неполные перекрывающиеся последовательности одного и того же клона.

Сравнение последовательностей клонов SEQ ID NO: 436 и 437 (названных 263G6 и 262B2) с последовательностями в опубликованных базах данных, как описано выше, не выявило значимой гомологии с ранее идентифицированными последовательностями. Последовательности SEQ ID NO: 427, 429, 431, 435, 438, 441, 443, 444, 445, 446, 450, 453 и 454 (названные 266B4, 266G3, 264B4, 263G1, 262B6, 2BT2-34, 2BT1-77, 2BT1-62, 2BT1-60,61, 2BT1-59, 2BT1-52 и 2BT1-40, соответственно) проявили некоторую гомологию с ранее выделенными маркерными экспрессирующими последовательностями (EST). Последовательности SEQ ID NO: 428, 430, 432, 433, 434, 439, 440, 442, 447, 448, 449, 451, 452 и 455-462 (названные клонами 22892, 22890, 22883, 22882, 22880, 22869, 21374, 21349, 21093, 21091, 21089, 21085, 21084, 21063, 21062, 21060, 21053, 21050, 21036, 21037 и 21048, соответственно) проявляли некоторую гомологию с последовательностями генов, ранее идентифицированными у человека.

ПРИМЕР 2.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИПЕПТИДОВ ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ ОСНОВАННОМ НА ПЦР ВЫЧИТАНИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РНК ОПУХОЛИ, ПАССИРОВАННОЙ НА МЫШАХ SCID.

Антигены опухоли молочной железы человека получали посредством основанного на ПЦР вычитания с использованием РНК опухоли молочной железы, пассируемой у мышей SCID, следующим образом. Опухоль молочной железы человека имплантировали мышам SCID и собирали при первом или шестом серийном пассаже, как описано в заявке на выдачу патента с регистрационным No. 08/556659, поданной 11/13/95, патенте США No. 5986170. Гены, которые как было выявлено дифференциально, экспрессируются в опухолях ранних и поздних пассажей SCID, могут быть специфичными в отношении стадии, и поэтому пригодными для применения в терапии и диагностике. Суммарную РНК получали из быстрозамороженной опухоли молочной железы человека, пассированной на мышах SCID как первого, так и шестого пассажей.

Основанное на ПЦР вычитание выполняли в основном как описано выше. При первом вычитании (названном Т9) РНК из опухоли первого пассажа вычитали из РНК опухоли шестого пассажа, чтобы идентифицировать более агрессивные антигены, специфичные для поздних пассажей. Из 64 клонов, выделенных и секвенированных в случае указанного вычитания, не выявлено значимой гомологии для 30 из указанных клонов, в дальнейшем называемых: 13053, 13057, 13059, 13065, 13067, 13068, 13071-13073, 13075, 13078, 13079, 13081, 13082, 13092, 13097, 13101, 13102, 13131, 13133, 13119, 13135, 13139, 13140, 13146-13149 и 13151, за исключением некоторых ранее идентифицированных маркерных экспрессирующих последовательностей (EST). Определенные последовательности кДНК для указанных клонов представлены в SEQ ID NO: 88-116, соответственно. Выделенные последовательности кДНК SEQ ID NO: 117-140 проявляли гомологию с известными генами. При втором основанном на ПЦР вычитании РНК опухоли шестого пассажа вычитали из РНК опухоли первого пассажа, чтобы идентифицировать антигены подавляемые при множественных пассажах. Из 36 выделенных и секвенированных клонов не выявлено значимой гомологии для девятнадцати из указанных клонов, называемых в дальнейшем: 14376, 14377, 14383, 14384, 14387, 14392, 14394, 14398, 14401, 14402, 14405, 14409, 14412, 14414-14416, 14419, 14426 и 14427, за исключением некоторых ранее идентифицированных маркерных экспрессирующих последовательностей (EST). Определенные последовательности кДНК для указанных клонов представлены в SEQ ID NO: 141-159, соответственно. Обнаружено, что выделенные последовательности кДНК SEQ ID NO: 160-174 проявляли гомологию с ранее известными генами.

Далее проводили анализ антигенов опухоли молочной железы человека посредством основанного на ПЦР вычитания с использованием РНК опухоли SCID первого и шестого пассажей. Обнаружено, что шестьдесят три клона экспрессируются дифференциально с двукратной или большей разницей, как было определено при анализе на микроматрице, т.е. более высокая экспрессия в опухоли раннего пассажа по сравнению с опухолью позднего пассажа, или наоборот. Семнадцать из этих клонов не проявляли значимой гомологии с какими-либо известными генами, хотя была выявлена некоторая степень гомологии с ранее идентифицированными маркерными экспрессирующими последовательностями (EST), и указанные клоны в дальнейшем обозначены 20266, 20270, 20274, 20276, 20277, 20280, 20281, 20294, 20303, 20310, 20336, 20341, 20941, 20954, 20961, 20965 и 20975 (SEQ ID NO: 252-268, соответственно). Обнаружено, что остальные клоны имеют некоторую степень гомологии с известными генами, которые определены в кратком описании рисунков и разделе идентификаторов последовательностей, и указанные клоны в дальнейшем обозначены 20261, 20262, 20265, 20267, 20268, 20271, 20272, 20273, 20278, 20279, 20293, 20300, 20305, 20306, 20307, 20313, 20317, 20318, 20320, 20321, 20322, 20326, 20333, 20335, 20337, 20338, 20340, 20938, 20939, 20940, 20942, 20943, 20944, 20946, 20947, 20948, 20949, 20950, 20951, 20952, 20957, 20959, 20966, 20976, 20977 и 20978. Определенные последовательности кДНК указанных клонов представлены в SEQ ID NO: 269-314, соответственно.

Клоны 20310, 20281, 20262, 20280, 20303, 20336, 20270, 20341, 20326 и 20977 (также называемые B820P, B821P, B822P, B823P, B824P, B825P, B826P, B827P, B828P и B829P, соответственно) отобрали для дальнейшего анализа на основании результатов, полученных в анализе на микроматрице. В частности, анализ данных, полученных на микроматрице, показал наличие сверхэкспрессии, по меньшей мере, от двукратной до трехкратной, указанных клонов в РНК опухоли молочной железы по сравнению с тестированными нормальными тканями. Последующие исследования привели к определению полной последовательности вставки клонов B820P, B821P, B822P, B823P, B824P, B825P, B826P, B827P, B828P и B829P. Указанные удлиненные последовательности кДНК представлены в SEQ ID NO: 416-426, соответственно.

ПРИМЕР 3.

СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДОВ.

Пептиды можно синтезировать на синтезаторе пептидов Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430A, используя FMOC-химию с активацией HPTU (гексафторфосфат 0-бензотриазол-N,N,N’,N’-тетраметилурония). С аминоконцом пептида можно связать последовательность Gly-Cys-Gly, чтобы обеспечить способ конъюгации, связывание с иммобилизованной поверхностью или мечение пептида. Отщепление пептидов от твердого носителя можно проводить с использованием следующей смеси для отщепления: трифторуксусная кислота: этандитиол: тиоанизол: вода: фенол (40:1:2:2:3). После отщепления в течение 2 часов пептиды можно осадить холодным метил-трет-бутилэфиром. Затем осадки пептидов можно растворить в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ), и лиофильно высушить перед очисткой обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С18. Для того чтобы элюировать пептиды, можно использовать градиент 0%-60% ацетонитрила (содержащего 0,1% ТФУ) в воде (содержащей 0,1% ТФУ). После лиофилизации чистых фракций пептиды можно охарактеризовать, используя масс-спектрометрию с электрораспылением или другие типы масс-спектрометрии и анализом аминокислот.

ПРИМЕР 4.

ВЫЗОВ СПЕЦИФИЧНЫХ ДЛЯ АНТИГЕНОВ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ОТВЕТОВ CTL В КРОВИ ЧЕЛОВЕКА.

Данный пример иллюстрирует способность специфичного для молочной железы антигена B726P вызывать ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) в лимфоцитах периферической крови здоровых людей.

Аутологичные дендритные клетки (ДК) получали в результате дифференцировки из культур моноцитов, полученных из PBMC здоровых доноров, при выращивании в течение пяти дней в среде RPMI, содержащей 10% сыворотки человека, 30 нг/мл GM-CSF и 30 нг/мл IL-4. После культивирования в течение пяти дней ДК инфицировали в течение ночи аденовирусом, экспрессирующим рекомбинантный B726P («правая» ORF; SEQ ID NO: 181), при M.O.I. 2,5 и вызывали созревание добавлением 2 микрограмм/мл лиганда CD40 в течение 8 часов. Проводили обогащение CD8-позитивными клетками путем истощения по CD4- и CD14-позитивным клеткам. Примированные культуры инициировали в отдельных лунках нескольких 96-луночных планшетов цитокинами IL-6 и IL-12. Указанные культуры повторно стимулировали в присутствии IL-2, используя аутологичные фибробласты, обработанные IFN-гамма и трансдуцированные B726P и CD80. После трех циклов стимуляции оценивали наличие специфичной по отношению к B726P активности CTL в анализе IFN-гамма Elispot (Lalvani et al., J Exp. Med. 186: 859-865, 1997), используя обработанные IFN-гамма аутологичные фибробласты, трансдуцированные для экспрессии либо B726P, либо нерелевантного контрольного антигена, в качестве антиген-презентирующих клеток (АПК). Примерно из 96 линий идентифицировали одну линию (названную 6-2B), которая, по-видимому, специфично узнавала трансдуцированные B726P АПК, но не узнавала АПК, трансдуцированные контрольным антигеном. Полученную микрокультуру клонировали, используя стандартные протоколы. CTL, специфичные по отношению к В726Р, идентифицировали при анализе Elispot и размножали для дальнейшего анализа. Используя анализ высвобождения хрома-51, показали, что полученные клоны CTL узнают фибробласты, экспрессирующие B726P, но не контрольный антиген MART-1. Кроме того, используя панель аллогенных фибробластов, трансдуцированных B726P, в анализах блокирования антител идентифицировали элемент HLA-рестрикции для указанных специфичных по отношению к В726Р CTL как HLA-B*1501.

Для того чтобы более точно определить положение эпитопа, узнаваемого клонами CTL, специфичными по отношению к В726Р, конструировали делеционную конструкцию, содержащую только N-концевую половину B726P (B726Pdelta3′) (а/к 1-129), в ретровирусной экспрессирующей плазмиде pBIB. Полученную плазмиду, а также другие плазмиды, содержащие B726P, трансфицировали в клетки COS-7 либо отдельно, либо в комбинации с плазмидой, экспрессирующей HLA-B* 1501. Примерно через 48 часов после трансфекции добавляли клон CTL, специфичный по отношению к B726P (1-9B), в количестве примерно 10⁴ клеток на лунку. Содержимое лунок собирали на следующий день и посредством ELISA измеряли количество высвобожденного IFN-гамма. Ответ CTL на клетки COS-7, которые были трансфицированы и B726P и HLA-B*1501, был выше фона (EGFP). Не наблюдалось ответа выше фона на клетки COS-7, которые были трансфицированы только B726P или только HLA-B*1501. Важно, что более высокий ответ наблюдался в случае клеток COS-7, которые были трансфицированы HLA-B*1501 и B726Pdelta3′. Указанный результат свидетельствовал о том, что эпитоп вероятно был локализован в N-концевом районе (а/к 1-129) B726P. Исследовали указанный район и идентифицировали и синтезировали аминокислотные последовательности, которые соответствовали связывающему пептид мотиву HLA-B*1501 (J. Immunol. 1999, 162: 7277-84). Указанные пептиды импульсно добавляли при концентрации 10 мкг/мл к аутологичным B-LCL в течение ночи. На следующий день клетки промывали и способность клеток стимулировать специфичный по отношению к B726P клон CTL 1-9B оценивали в анализе IFN-гамма ELISPOT. Из одиннадцати тестированных пептидов только один пептид, имеющий аминокислотную последовательность SLTKRASQY (а/к 76-84; SEQ ID NO: 488), мог узнаваться CTL. Полученный результат идентифицирует данный пептид как эпитоп природного происхождения, узнаваемый данным специфичным по отношению к B726P клоном CTL.

ПРИМЕР 5.

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИТЕЛ ПРОТИВ ПОЛИПЕПТИДОВ ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

Поликлональные антитела против антигена B726P опухоли молочной железы получали следующим образом.

«Правую» ORF B726P (SEQ ID NO: 181), экспрессируемую в рекомбинантной экспрессирующей системе E. coli, получали выращиванием культуры в течение ночи в бульоне LB с соответствующими антибиотиками при 37⁰C в инкубаторе со встряхиванием. На следующее утро 10 мл ночной культуры добавляли к 500 мл 2x YT плюс соответствующие антибиотики в колбу Эрленмейера с отведением объемом 2 л. Когда оптическая плотность (при 560 нм) культуры достигала 0,4-0,6, клетки индуцировали IPTG (1 мМ). Через четыре часа после индукции IPTG клетки собирали центрифугированием. Затем клетки промывали фосфатно-солевым буфером и снова центрифугировали. Надосадок сливали и клетки либо замораживали для использования в будущем, либо сразу обрабатывали. К осадкам клеток добавляли двадцать мл лизирующего буфера и встряхивали. Чтобы разрушить клетки E. coli полученную смесь затем прогоняли через Френч-пресс при давлении 16000 фунт/кв. дюйм (110316142 Па). Затем клетки снова центрифугировали и надосадок и осадок проверяли в SDS-ПААГ в отношении распределения рекомбинантного белка. В случае белков, которые были локализованы в осадке клеток, осадок ресуспендировали в 10 мМ Трис, pH 8,0, 1% CHAPS и осадок телец включения промывали и снова центрифугировали. Указанную процедуру повторяли еще два раза. Промытый осадок телец включения солюбилизировали 8 М мочевиной или 6 М гуанидином-HCl, содержащим 10 мМ Трис, pH 8,0, плюс 10 мМ имидазол. Солюбилизированный белок добавляли к 5 мл никель-хелатной смолы (Qiagen) и инкубировали в течение от 45 мин до 1 часа при комнатной температуре и непрерывном перемешивании. После инкубации смолу и белковую смесь пропускали через одноразовую колонку и собирали проходящую жидкость. Затем колонку промывали 10-20 объемами колонки буфера для солюбилизации. Затем антиген элюировали с колонки, используя 8 М мочевину, 10 мМ Трис, pH 8,0, и 300 мМ имидазол, и собирали фракции объемом 3 мл. Разгоняли в SDS-ПААГ-геле, чтобы определить, какие фракции объединить для дальнейшей очистки.

В качестве конечной стадии очистки сильную анионообменную смолу, такую как HiPrepQ (Biorad), уравновешивали соответствующим буфером и на колонку наносили объединенные фракции, указанные выше. Антиген элюировали с колонки возрастающим градиентом соли. Фракции по мере выхода из колонки собирали и разгоняли в другом SDS-ПААГ-геле, чтобы определить, какие фракции с колонки объединить. Объединенные фракции диализовали против 10 мМ Трис, pH 8,0. Затем белок разносили по флаконам после фильтрования через фильтр с диаметром пор 0,22 микрона и антигены замораживали до того, как они потребуются для иммунизации.

Четыреста микрограмм антигена B726P смешивали со 100 микрограммами мурамилдипептида (MDP). Каждые четыре недели кроликов подвергали бустер-иммунизации 100 микрограммами, смешанными с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Через семь дней после каждой бустер-иммунизации у животного брали кровь. Сыворотку получали инкубированием крови при 4^°С в течение 12-24 часов с последующим центрифугированием.

Девяностошестилуночные планшеты покрывали антигеном В726Р, инкубируя с 50 микролитрами (обычно 1 микрограмм) рекомбинантного белка при 4^°C в течение 20 часов. 250 Микролитров блокирующего буфера с БСА добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Планшеты 6 раз промывали PBS/0,01% Твин. Сыворотку кроликов разбавляли PBS. Пятьдесят микролитров разбавленных сывороток добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Планшеты промывали как описано выше перед тем, как добавляли 50 микролитров меченого пероксидазой хрена (HRP) антикроличьего антитела козы в разведении 1:10000, и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Планшеты снова промывали как описано выше и в каждую лунку добавляли 100 микролитров субстрата пероксидазы TMB Microwell. После инкубации в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре колориметрическую реакцию останавливали добавлением 100 микролитров 1N H₂SO₄ и сразу же регистрировали при 450 нм. Поликлональные антитела проявляли иммунореактивность по отношению к B726P.

ПРИМЕР 6.

ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ АНТИГЕНОВ ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

«Правую» ORF В726Р (SEQ ID NO: 181) вместе с С-концевой 6Х His-меткой экспрессировали в клетках насекомых, используя бакуловирусную систему экспрессии, следующим образом.

кДНК «правой» ORF B726P полной длины ПЦР-амплифицировали, используя праймеры SEQ ID NO: 480 и 481. Продукт ПЦР ожидаемого размера извлекали из агарозного геля, расщепляли ферментами рестрикции EcoRI и HindII и лигировали в плазмиду для переноса pFastBac1, которую расщепляли такими же ферментами рестрикции. Последовательность вставки подтверждали секвенированием ДНК. Рекомбинантную плазмиду для переноса pFBB726P использовали для того, чтобы получить рекомбинантную ДНК бакмиды и вирус, используя бакуловирусную систему экспрессии Bac-To-Bac (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD). Клетки High Five инфицировали рекомбинантным вирусом BVB726P, чтобы получить белок. Последовательности кДНК и аминокислот экспрессируемого рекомбинантного белка В726Р представлены в SEQ ID NO: 482 и 483, соответственно.

Исходя из сказанного выше, будет очевидно, что хотя здесь в целях иллюстрации описаны конкретные варианты изобретения, можно осуществить различные модификации, не отходя от сути и не выходя за рамки изобретения.

Формула изобретения

1. Изолированный полипептид, содержащий по меньшей мере часть белка опухоли молочной железы или его варианта, причем полипептид включает аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из

(a) последовательности, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489;

(b) последовательностей, которые гибридизуются с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489, в условиях умеренной жесткости; и

(c) последовательностей, комплементарных последовательностям (а) или (b).

2. Изолированный полипептид по п.1, где полипептид включает в себя аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489, или комплементарной ей последовательностью.

3. Изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.1.

4. Изолированный полинуклеотид, кодирующий белок опухоли молочной железы, или его вариант, при этом белок опухоли включает в себя аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидом, содержащим последовательность, указанную в SEQ ID NO: 474, 482 или 489, или комплементарную ей последовательность.

5. Изолированный полинуклеотид, содержащий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 474, 482 или 489.

6. Изолированный полинуклеотид, содержащий последовательность, которая гибридизуется с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489, в условиях умеренной жесткости.

7. Изолированный полинуклеотид, комплементарный полинуклеотиду по любому из пп.3-6.

8. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.3-7.

9. Вектор по п.8 для трансформации или трансфекции клетки-хозяина.

10. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывается с белком опухоли молочной железы, содержащим аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489, или комплементарной ей последовательностью.

11. Гибридный белок, содержащий первую часть аминокислот и вторую часть аминокислот, где указанная первая часть аминокислот включает в себя 9 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот из маммаглобина, которые представлены аминокислотами 59-78, 55-69, 13-33, 41-60, 2-10, 47-59, 62-74 SEQ ID NO: 493; где указанная вторая часть аминокислот включает в себя 9 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот из В726Р, которые представлены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:

475, кодируемой SEQ ID NO: 474, включая Т-хелперный эпитоп с аминокислотной последовательностью, представленной SLTKRASQY;

и где указанная первая часть аминокислот связана либо с амино-концом, либо с карбоксильным концом указанной второй части аминокислот.

12. Гибридный белок по п.11, где указанный гибридный белок включает аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 493,494 и 495.

13. Гибридный белок по п.12, где указанная первая часть аминокислот связана с амино-концом указанной второй части аминокислот.

14. Гибридный белок по п.12, где указанная первая часть аминокислот связана с карбоксильным концом указанной второй части аминокислот.

15. Изолированный полинуклеотид, кодирующий гибридный белок по п.11 или 12.

16. Способ удаления опухолевых клеток из крови или фракции крови, включающий в себя осуществление контакта указанной крови или фракции крови с Т-клетками, которые специфично реагируют с белком опухоли молочной железы, при этом белок опухоли содержит аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489-492, или комплементарной ей последовательностью, где стадию контактирования выполняют в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы удалить из образца клетки, экспрессирующие антиген.

17. Композиция для использования в подавлении развития рака молочной железы у пациента, включающая в себя биологический образец, обработанный согласно способу по п.16.

18. Способ стимулирования и/или экспансии Т-клеток, специфичных для белка опухоли молочной железы, включающий в себя осуществление ex vivo контакта Т-клеток с по меньшей мере одним компонентом, выбранным из группы, состоящей из

(а) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из

(i) последовательности, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489-492;

(ii) последовательностей, которые гибридизуются с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489-492, в условиях умеренной жесткости;и (iii) последовательностей, комплементарных последовательностям (i) или (ii);

(b) полинуклеотидов, кодирующих полипептид (а); и

(c) антиген-презентирующих клеток, которые экспрессируют полипептид (а);

в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы обеспечить возможность для стимуляции и/или экспансии

Т-клеток.

19. Способ по п.18, дополнительно включающий клонирование по меньшей мере одной разросшейся клетки с обеспечением клонированных Т-клеток.

20. Изолированная популяция Т-клеток, содержащая Т-клетки, полученные согласно способу по п.18 или 19.

21. Композиция, содержащая антигенпредставляющую клетку, которая экспрессирует полипептид, содержащий по меньшей мере иммуногенную часть белка опухоли молочной железы, или его варианта, где белок опухоли содержит аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из

(i) последовательности, указанной в SEQ ID NO: 474, 482

или 489-492;

(ii) последовательностей, которые гибридизуются с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489-492, в условиях умеренной жесткости; и

(iii) последовательностей, комплементарных последовательностям (i) или (ii).

22. Композиция для использования в подавлении развития рака молочной железы у пациента, включающая в себя популяцию Т-клеток по п.20.

23. Способ определения наличия или отсутствия рака молочной железы у пациента, включающий в себя следующие стадии:

(a) контактирование биологического образца, полученного от пациента, с антителом, которое связывается с белком опухоли молочной железы, при этом белок опухоли содержит аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489-492, или комплементарной ей последовательностью;

(b) определение в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; и

(c) сравнение количества полипептида с предварительно определенным отсекающим (“cut-off”) значением, и определение на основе этого наличия или отсутствия рака у пациента.

24. Способ по п.23, где антителом является моноклональное антитело.

25. Способ мониторинга прогрессирования рака молочной железы у пациента, включающий в себя следующие стадии:

(a) контактирование биологического образца, полученного от пациента в первой временной точке, с антителом, которое связывается с белком опухоли молочной железы, при этом белок опухоли содержит аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489-492, или комплементарной ей последовательностью;

(b) определение в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом;

(c) повторение стадий (а) и (Ь) с использованием биологического образца, полученного от пациента в следующей временной точке; и

(d) сравнение количества полипептида, определенного на стадии (с), с количеством, определенным на стадии (Ь), и на основе этого мониторинг прогрессирования рака молочной железы у пациента.

26. Способ по п.25, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

27. Способ определения наличия или отсутствия рака молочной железы у пациента, включающий в себя следующие стадии:

(a) контактирование биологического образца, полученного от пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется в условиях умеренной жесткости с полинуклеотидом, который кодирует белок опухоли молочной железы, где белок опухоли содержит аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489-492, или комплементарной ей последовательностью;

(b) определение в образце количества полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом; и

(c) сравнение количества полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, с предварительно определенным отсекающим (“cut-off”) значением, и на основе этого определение наличия или отсутствия рака молочной железы у пациента.

28. Способ по п.27, где количество полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, определяют, используя полимеразную цепную реакцию.

29. Способ по п.27, где количество полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, определяют, используя гибридизационный анализ.

30. Способ мониторинга прогрессирования рака молочной железы у пациента, включающий в себя следующие стадии:

(а) контактирование биологического образца, полученного от пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется в условиях умеренной жесткости с полинуклеотидом, который кодирует белок опухоли молочной железы, при этом белок опухоли содержит аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489-492, или комплементарной ей последовательностью;

(b) определение в образце количества полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом;

(c) повторение стадий (а) и (b) с использованием биологического образца, полученного от пациента в следующей временной точке; и

(d) сравнение количества полинуклеотида, определенного на стадии (с), с количеством, определенным на стадии (Ь), и на основе этого мониторинг прогрессирования рака у пациента.

31. Способ по п.30, где количество полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, определяют, используя полимеразную цепную реакцию.

32. Способ по п.30, где количество полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, определяют, используя гибридизационный анализ.

33. Диагностический набор, содержащий:

(a) одно или несколько антител по п.10; и

(b) реагент для детекции, содержащий репортерную группу.

34. Набор по п.33, где антитела иммобилизованы на твердом носителе.

35. Набор по п.33, где реагент для детекции дополнительно включает в себя анти-иммуноглобулин, белок G, белок А или лектин.

36. Набор по п.33, где репортерная группа выбрана из группы, состоящей из радиоизотопов, флуоресцентных групп, люминесцентных групп, ферментов, биотина и частиц красителя.

37. Диагностический набор, содержащий

(а) олигонуклеотид, содержащий 10-40 смежных нуклеотидов, который в условиях умеренной жесткости гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует белок опухоли молочной железы, при этом белок опухоли содержит аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 474, 482 или 489-492, или комплементарной ей последовательностью; и

(b) диагностический реагент для применения в полимеразной цепной реакции или гибридизационном анализе.

Приоритет по признакам:

SEQ ID NO:474 и 475 от 17.04.2000; SEQ ID NO: 482 и 489 от 22.06.2000 и SEQ ID NO: 490-495 от 20.07.2000.

РИСУНКИ