Патент на изобретение №2344173

(54) КАССЕТА И РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЗКСПРЕССИИ И СЕКРЕЦИИ МЕХАНОЗАВИСИМОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА (MGF), ШТАММ SACCHAROMYCES CEREVISIAE – ПРОДУЦЕНТ MGF И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ MGF

(57) Реферат:

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного механозависимого фактора роста человека (MGF). Рекомбинантный механозависимый фактор роста человека получают путем выращивания клеток дрожжей, содержащих плазмиду, которая обеспечивает экспрессию секретируемой формы этого белка, и выделения целевого продукта из культуральной жидкости. Плазмида, обеспечивающая экспрессию секретируемой формы механозависимого фактора роста человека, содержит экспрессионную кассету, включающую промотор гена GAL1 и область терминации транскрипции гена CYC1 дрожжей, пре-про область гена MF1 и последовательность ДНК, кодирующую целевой белок. Эту плазмиду конструируют на основе плазмиды рКХ. Для получения механозависимого фактора роста человека используют также штамм Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF – продуцент указанного белка. Применение изобретения позволяет экспрессировать механозависимый фактор роста человека в дрожжах в секретируемой форме. 5 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

Настоящее изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной инженерии и биотехноологии, в частности к способу получения механозависимого фактора роста человека. Рекомбинантный механозависимый фактор роста человека может применяться при лечении кахексии для снижения мышечной массы или для наращивания мышечной массы.

Описание предшествующего уровня техники

Механозависимый фактор роста человека (mechano growth factor, MGF) был обнаружен как изоформа системного инсулиноподобного ростового фактора IGF-1 (Yang S. et al, J.Muscle Res. Cell Motil., 17, 4, 487-495 (1996)).

Позднее этот ростовой фактор был охарактеризован как локальный ростовой/репарирующий фактор мышечных тканей, который синтезируется в подверженных нагрузке или поврежденных мышцах как изоформа инсулиноподобного ростового фактора IGF-1 в результате альтернативного сплайсинга и отличается от системного фактора IGF-1 наличием вставки из 49 нуклеотидных пар в пятом экзоне, что приводит к сдвигу рамки считывания. Таким образом этот фактор, в отличие от IGF-1 с большой вероятностью связывается с другими рецепторами в промежуточных областях мышечных тканей, нейронов и костей (Goldspink G., Int. J.Biochem. Cell Biol., 38(3), 481-489 (2006)). В отличие от зрелого IGF-1 MGF ингибирует терминальную дифференциацию, но повышает пролиферацию миобластов (Yang S.Y., Goldspink G., FEBS Lett, 522(1-3), 156-60 (2002)).

MGF продуцируется в активных мышечных тканях и отвечает за контроль над восстановлением, поддержанием в норме и перестройкой мышечных тканей. Было показано, что в отличие от нормалных мышечных тканей MGF не детектировался в дистрофических мышцах в то время, когда системный фактор IGF-1 был обнаружен в этих же мышцах. Неспособность к экспрессии MGF в ответ на растяжение и нагрузку мышц была обнаружена как в дистрофии типа X-linked Duchenne, при которой отсутствует белок дистрофии, так и дистрофии аутосомального рецессивного типа, при которой отсутствует один из внеклеточных белков, мерозин – мышечная форма ламинина (Goldspink G., J.Anat., 194, 323-334, (1999)).

В мышцах людей преклонного возраста детектируется сниженный уровень гормонов роста, что означает недостаточное количество РНК транскрипта гена IGF-1, необходимого для альтернативного сплайсинга для продукции MGF. Именно это объясняет неспособность к поддержанию мышечной массы в ходе старения. Обработка белком MGF повышает силы как нормальных, так и атрофированных мышц, следовательно, MGF может быть использован как средство для лечени кахексии (Goldspink G., J.Muscle Res. Cell Motil. 24(2-3), 121-126 (2003); Goldspink G., Int. J.Biochem. Cell Biol., 38(3), 481-9 (2006)).

Также было показано, что MGF может обладать важной нейропротекторной функцией. Так, С-концевой пептид MGF может быть использован для предотвращения повреждения нейронов (Dluzniewska J, et al., FASEB J., Epub ahead of print, 2005 Sep 6).

Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих использование дрожжей для продукции полноразмерного рекомбинантного механозависимого фактора роста человека (MGF).

Краткое описание рисунков

На Фиг.1 изображено электрофоретическое разделение белков в ПААГ. 1 – маркер молекулярного веса; 2 – маркер молекулярного веса (12 кДа); 3 – очищенный препарат MGF человека из культуральной жидкости, полученной в результате выращивания штамма Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF – продуцента MGF человека.

На Фиг.2 изображено влияние препарата MGF на рост культуры постнатальных миобластов человека. Показано изменение оптической плотности образца, содержащего препарат MGF, к контролю.

Краткое описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются создание штамма дрожжей – продуцента рекомбинантного MGF человека, способного к эффективной секреции целевого белка в культуральную жидкость, предоставления способа получения рекомбинантного MGF человека. Поставленная задача была решена путем конструирования рекомбинантной плазмиды pKX-MGF, содержащей ген MGF человека, кодирующий регулируемый синтез MGF человека, и штамма Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF, обеспечивающего синтез и продукцию в секретируемой растворимой форме MGF человека с уровнем экспрессии неароматических и ароматических L-аминокислот с использованием этих штаммов бактериальных клеток.

Целью настоящего изобретения является предоставление экспрессионой кассеты, содержащей область промотора гена GAL1 дрожжей; пре-прообласть гена MF1; последовательность ДНК, кодирующую белок (SEQ ID NO:2), обладающий активностью механозависимого фактора роста человека, или его вариант; и область терминации транскрипции гена CYC1 дрожжей.

Также целью настоящего изобретения является предоставление рекомбинантной плазмиды, содержащей описанную выше экспрессионную кассету; фрагмент бактериальной плазмиды pUC18, область инициации репликации 2-mkm дрожжевой плазмиды; гены KAR2 и PDI1, селективный дрожжевой маркер URA3.

Также целью настоящего изобретения является предоставление эукариотической клетки, трансформированной описанной выше плазмидой, – продуцента механозависимого фактора роста человека.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше эукариотической клетки, отличающейся тем, что указанную клетку трансформируют плазмидой pKX-MGF.

Также целью настоящего изобретения является предоставление штамма Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF – продуцента механозависимого фактора роста человека.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантного механозависимого фактора роста человека, включающего стадии выращивания описанной выше эукариотической клетки в питательной среде и выделения рекомбинантного механозависимого фактора роста человека из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что в качестве эукариотической клетки используют дрожжевую клетку.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что в качестве дрожжевой клетки используют штамм Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF.

Также целью настоящего изобретения является предоставление рекомбинантного механозависимого фактора роста человека, полученного описанным выше способом.

Также целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей описанный выше рекомбинантный механозависимый фактор роста человека и фармацевтически приемлемые носители и наполнители, для лечения кахексии, саркопении (снижения мышечной массы) или для наращивания мышечной массы.

Подробное описание настоящего изобретения

Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось создание штамма дрожжей – продуцента MGF, способного к эффективной секреции целевого белка в культуральную жидкость. Поставленная задача была решена путем конструирования рекомбинантной плазмиды pKX-MGF, содержащей ген MGF человека, кодирующий регулируемый синтез MGF человека, и штамма Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF, обеспечивающего синтез и продукцию в секретируемой растворимой форме MGF человека с уровнем экспрессии не менее 10 мг/л.

Рекомбинантная плазмида pKX-MGF была сконструирована путем клонирования гена, кодирующего MGF человека, в плазмиду рКХ. Структура плазмиды рКХ и ее конструирование подробно описаны в Евразийской патентной заявке ЕА200400907.

Рекомбинантная плазмида pKX-MGF содержит ген, кодирующий MGF человека, под контролем промотора гена GAL1, обеспечивающего высокий уровень транскрипции гена, и ген KAR2 (Robinson A.S. et al, J.Biol. Chem., 271(17):10017-22 (1996)), кодирующий шаперонный белок BiP (heavy chain binding protein), участвующий в сворачивании белков в ходе их секреции и обеспечивающий высокий уровень продукции целевого белка в культуральную жидкость.

Рекомбинантная плазмида pKX-MGF содержит ген, кодирующий MGF человека, в составе экспрессионной кассеты. В структуры экспрессионной кассеты входят нуклеотидная последовательность, содержащая область промотора гена GAL1 дрожжей; пре-прообласть гена MF1; последовательность ДНК (SEQ ID NO:2), кодирующая белок, обладающий активностью механозависимого фактора роста человека, или его вариант; и область терминации транскрипции гена CYC1 дрожжей. При введении данной плазмиды в клетку достигается высокий уровень транскрипции гена, кодирующего MGF человека, благодаря использованию высокоэффективного промотора GAL1. Введение пре-про области гена MF1 обеспечивает правильный секреторный процессинг белка MGF человека, сопровождающийся эффективной секрецией белка с ожидаемой последовательностью в культуральную жидкость.

При помощи созданной плазмиды можно трансформировать любую эукариотическую клетку, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии MGF человека может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки-реципиента.

Термин «вариант белка» в значении, в котором она используется в настоящем изобретении, означает белок, который имеет изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, как минимум 10% от активности нативного MGF человека. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять от 1-го до 30-ти, предпочтительно от 1-го до 15-ти и наиболее предпочтительно от 1-го до 5-ти изменений в последовательности белка под номером 2 (SEQ ID NO:2). Эти изменения могут иметь место в областях белка, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который имеет гомологию не менее чем 70%, предпочтительно не менее чем 80%, более предпочтительно не менее чем 90% и наиболее предпочтительно не менее чем 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности, представленной на SEQ ID NO:2 при условии, что активность белка сохраняется. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на He, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp и замену Val на Met, Ile или Leu.

Фрагменты ДНК, которые кодируют, по существу, тот же функциональный белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), кодирующего MGF человека, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.

Фрагменты ДНК, которые кодируют, по существу, тот же функциональный белок MGF человека, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке, и установления активности экспрессируемого продукта. Фрагменты ДНК, которые кодируют, по существу, тот же функциональный белок MGF человека, также могут быть получены путем выделения фрагментов ДНК, которые гибридизуются с зондами, имеющими нуклеотидную последовательность, которая содержит, например, нуклеотидную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающих активностью MGF человека. “Жесткие условия”, в том значении, которое приписывается этому выражению в рамках настоящего изобретения, означают такие условия, при которых так называемые специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды не образуются. Например, демонстрацией жестких условий могут быть такие условия, при которых фрагменты ДНК, имеющие высокую гомологию, например фрагменты ДНК, имеющие гомологию не менее чем 50%, предпочтительней не менее чем 60%, более предпочтительней не менее чем 70%, еще более предпочтительней не менее чем 80%, еще более предпочтительней не менее чем 90% и наиболее предпочтительней не менее чем 95%, способны гибридизоваться друг с другом, а фрагменты ДНК, имеющие гомологию более низкую, чем описано выше, не способны гибридизоваться друг с другом. Кроме того, демонстрацией жестких условий могут служить такие условия, при которых фрагменты ДНК гибридизуются при концентрации соли, эквивалентной условиям однократной отмывки при гибридизации по Саузерну, которые составляют 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа мембраны, используемой для блотинга и, как правило, рекомендуется производителем набора. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для мембраны Hybond N+ nylon (Amersham, США) в жестких условиях составляет приблизительно 15 минут. Желательно отмывку повторять 2-3 раза. В качестве зондов может быть также использована неполная нуклеотидная последовательность, приведенная в Перечне последовательностей под номероми SEQ ID NO:1. Зонды могут быть приготовлены с помощью ПЦР с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1 и на основе фрагментов ДНК, содержащих нуклеотидную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1 в качестве матрицы, В тех случаях, когда фрагмент ДНК, имеющий длину около 300 п.о., используется в качестве зонда, условия отмывки в процессе гибридизации включают, например, 50°С, 2×SSC и 0.1% SDS.

Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, так как они описаны выше, также включают мутации, которые имеют место в природе (мутант или вариант), например, обусловленные изменчивостью.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами нативного MGF человека, определяются по иммунологической реакции и по его способности вызывать усиление роста, например, постнатальных миобластов человека (см. Пример 6) на уровне не ниже 10% активности нативного MGF человека.

«Трансформация клетки с помощью фрагмента ДНК, кодирующего белок» означает введение фрагмента ДНК в клетку, например, хорошо известными методами. Трансформация этой ДНК приведет к усилению экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к увеличению активности белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые известные методы, которые описаны до настоящего времени, например метод, описанный Ito Н. и др. (J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)).

Согласно настоящему изобретению «эукариотическая клетка – продуцент MGF человека» означает эукариотическую клетку, обладающую способностью к продукции и выделению MGF человека в питательную среду, когда эукариотическая клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «эукариотическая клетка – продуцент MGF человека» также означает клетку, которая способна к продукции MGF человека и вызывает накопление MGF человека в питательной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом, таким как штамм Saccharomyces cerevisiae YBS618, и предпочтительно означает, что указанная клетка способна накапливать в среде целевой белок MGF человека в количестве не менее чем 5 мг/л, более предпочтительно не менее чем 10 мг/л.

Примеры штамма – реципиента для получения продуцента рекомбинантного MGF человека согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммом Saccharomyces cerevisiae YBS618, депонированным во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов 22 мая 2002 г.под инвентарным номером ВКПМ Y-3024; штаммом Saccharomyces cerevisiae YBS723, описанным в Евразийской патентной заявке ЕА200400907, и др.

Штамм Saccharomyces cerevisiae YBS618, трансформированный плазмидой рКХ-MGF, содержащей ген, кодирующий белок MGF человека, характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: вегетативные клетки двухсуточной культуры, выращенной на твердой питательной среде с 2% глюкозы в качестве единственного источника углерода, имеют овальную форму, размер клеток 3,6×7,1 мкм, протоплазма гомогенная, размножение почкованием. При выращивании на твердой среде, содержащей дрожжевой экстракт и пептон (YEP) при 30°С, через 72 ч роста колонии имеют следующий вид:

1) на среде YEP с глюкозой колонии белого цвета с ровным краем, блестящей поверхностью, конусообразным профилем, сметанообразной консистенцией;

2) на среде YEP с крахмалом колонии белого цвета с узорчатым краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и крупинчатой консистенцией;

3) на среде YEP с мелассой колонии белого цвета с матовой морщинистой поверхностью, узорчатым краем, выпуклым профилем и сметанообразной консистенцией.

Рост в жидкой среде – на среде YEP с крахмалом при 32°С в течение первых 24 часов культивирования – жидкость мутная, осадок белый, не комкуется, пристеночных пленок не образует.

Физико-химические признаки: факультативный анаэроб. Температура роста – 22-33°С (оптимум – 31°С). рН культивирования – 3,8-6,7 (оптимум – 5,0). Наивысший уровень секреции MGF человека наблюдается при рН 6,8-7,0.

Ассимиляция источников углерода: сбраживает глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, декстрины, крахмал.

Ассимиляция источников азота: усваивает аминокислоты, мочевину, сернокислый аммоний, азотнокислый аммоний.

Отличительные особенности: при культивировании на богатой среде с крахмалом (2%) вокруг колоний образуются зоны просветления крахмала, окруженные темным ободком после инкубации чашек при +4°С в течение 24 ч.

Патогенностъ: штамм Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF непатогенен.

Способ хранения: штамм хранится на агаризованной богатой среде с глюкозой в течение 3 месяцев при +4°С.

Предполагаемый заявителями штамм-продуцент рекомбинантного MGF человека обладает рядом преимуществ перед уже существующими прототипами:

– продукция целевого продукта осуществляется в секретируемой форме в культуральную жидкость;

– аминокислотная последовательность конечного продукта соответствует последовательности нативного MGF человека (SEQ ID NO:2);

– существенно увеличен выход целевого продукта за счет увеличения экспрессии гена KAR2, кодирующего шаперонный белок BiP, обеспечивающий правильную сборку белка и секрецию целевого продукта в культуральную среду.

При практическом применении полученного белка MGF человека в составе фармацевтических композиций используются традиционные дополнительные компоненты, такие как наполнители, разбавители, консерванты, буферные растворы, физиологический раствор, 0,9% раствор хлорида натрия, технологические добавки, используемые при изготовлении лекарственных форм и т.п. Композиции могут быть жидкими (растворы, суспензии, эмульсии и т.п.), твердыми (лиофилизированный порошок, восстанавливаемый перед применением, адсорбированный препарат на носителе и т.п.), предназначенными для парентерального, перорального, внутривенного, внутримышечного введения.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Конструирование синтетической кДНК, кодирующей MGF человека.

Для получения синтетического гена МГФ химическим способом были синтезированы 20 олигонуклеотидов, приведенных в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:3-22. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием этих олигонуклеотидов был получен двуцепочечный фрагмент ДНК. Условия ПЦР: количество олигонуклеотидов: SEQ ID NO:3, 22-20 пмоль, SEQ ID NO: 4-21-0,5 пмоль; 30 циклов 94°С в течение 40 сек, 40°С в течение 40 сек, 72°С в течение 20 сек. Полученный фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазой SmaI и клонировали в вектор pUC18, предварительно обработанный этой же рестриктазой. Правильность первичной структуры гена была подтверждена секвенированием. Полученная плазмида была названа pUC18/MGF.

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pKX-MGF.

Плазмиду pUC18-MGF использовали в качестве матрицы для ПЦР в присутствии праймеров SEQ ID NO:23 и 24. В последовательность праймеров заложены сайты рестрикции NcoI и XhoI. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами NcoI и XhoI и клонировали в плазмиду рКХ (Евразийская патентная заявка ЕА200400907), предварительно обработанную теми же рестриктазами. Поскольку плазмида рКХ содержит два сайта рестрикции NcoI, один в пре-про области гена -фетопротеина за промотором GAL1, а второй – в кодирующей области маркера URA3, расщепление плазмиды рКХ рестриктазой NcoI проводили во вторую очередь в условиях ограниченной рестрикции, лигировали фрагмент ДНК, полученный в ходе ПЦР, и отбирали плазмиды с большим размером. Полученная в результате плазмида была названа pKX-MGF.

Пример 3. Получение штамма – продуцента MGF человека.

Для получения штамма Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF реципиентный штамм YBS618 (ВКПМ Y-3024) был трансформирован плазмидой pKX-MGF по методу Ito Н. и др. (J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)). Трансформанты отбирали по способности к росту на полноценной дрожжевой среде (бактопептон – 20 г/л, дрожжевой экстракт – 10 г/л, бактоагар – 20 г/л), содержащей 2% глюкозы в качестве источника углерода. Один из полученных клонов назвали YBS618/pKX-MGF.

Пример 4. Определение продуктивности штамма-продуцента МГФ человека Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF.

Клетки штамма-продуцента МГФ человека YBS618/pKX-MGF выращивали в колбах при 26°С на качалке (250 об/мин) на среде следующего состава: глюкоза – 2%, глицерин – 1,5%, дрожжевой экстракт – 1%, пептон – 2%, вода дистиллированная. рН среды поддерживали 7,0 добавлением 0,1 М фосфатного буфера. Исходный титр клеток составлял 5·10⁶. По истечении 72 часов выращивания культуры после перехода в стационарную фазу роста при титре 7-8·10⁸ отбирали образцы. Образец культуральной жидкости получали центрифугированием культуры при 10000 об/мин в течение 1 мин и использовали в последующих анализах. Пробы культуральной жидкости анализировали методом электрофореза в 12,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивали Кумасси R-250 и сканировали для определения количества общего белка и относительного содержания белка МГФ человека. По данным электрофореза и сканирования, общее содержание МГФ человека в культуральной жидкости составляет около 10-15% от суммарного белка. Содержание МГФ человека в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА), с использованием набора моноклональных антител. По данным ИФА, среднее содержание МГФ в культуральной жидкости в жидких средах составляло 10 мг/л.

Пример 5. Выделение и характеристика рекомбинантного МГФ человека из культуральной жидкости штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF.

Выделение рекомбинантного МГФ человека производили как описано ниже.

Используемые буферы: буфер А – 25 мМ Na-фосфат, рН 7,0; буфер В – 25 мМ Na-фосфат, 1 М NaCl, рН 7,0; буфер С – 25 мМ Na-фосфат, (NH₄)₂SO₄ 40% степени насыщения, рН 7,0; буфер D – 25 мМ Na-фосфат, 25% этиленгликоль, рН 7,0.

Ионообменная хроматография. Культуральную среду наносили на колонку с S-Sepharose FastFlow, предварительно уравновешенную буфером А. Размер колонки – 2,6×40 см, скорость потока – 10 мл/мин. После нанесения образца колонку промывали 500 мл буфера А и MGF человека элюировали градиентом NaCl (параболический градиент буфера В против буфера А в 550 мл, содержание буфера В увеличивается от 9,0% до 72.3%). В данных условиях большая часть десорбированного MGF приходилась во фракции, собираемой в интервале 330-520 мл от старта градиента.

Концентрирование. Полученные фракции, содержащие белок MGF человека, разбавляли в 4 раза буфером В. Раствор наносили на колонку с S-Sepharose FastFlow (1,6×20 см) и элюировали белок раствором 0,65М NaCl (смесь буферов А (35%) и В (65%).

Гидрофобная хроматография. К полученному препарату добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до степени насыщения 40%. Полученный раствор наносили на колонку с Phenyl-Toyopearl 650М, предварительно уравновешенную буфером С. Размер колонки – 1,0×15 см, скорость потока – 2 мл/мин. Колонку промывали 50 мл буфера С и элюировали белок MGF человека линейным градиентом буфера А.

Концентрирование. Полученные фракции, содержащие белок MGF человека, разбавляли в 3 раза буфером С и увеличивали концентрацию сульфата аммония до 40% насыщения путем добавления его насыщенного раствора. Препарат наносили на небольшую колонку с Phenyl-Toyopearl 650S (0,5×20 см), ступенчатую элюцию белка MGF человека осуществляли буфером D.

Данные, показывающие степень очистки полученного белка MGF человека, приведены в Таблице 1.

Идентификацию и чистоту полученного препарата рекомбинантного МГФ контролировали методом гель-электрофореза по Лэммли в 12.5% ДСН-ПААГ с бета-меркаптоэтанолом с последующим окрашиванием Кумасси (Фиг.1).

Пример 6. Определение биологической активности рекомбинантного MGF человека in vitro.

При использовании биотест-системы применялись культуры постнатальных миобластов человека, которые были специально получены и предварительно охарактеризованы по методам, детально описанным ранее (Черников В.Г., Терехов С.М., Крохина Т.Б. и др., Бюлл. эксп. биол. мед. 131, №6, с.680-682 (2001); Черников В.Г., Терехов С.М., Крохина Т.Б. и др., Биомед. технологии, №15, с.79-84 (2001); Патент РФ №2226275).

Клетки выращивали непосредственно в 96-луночных планшетах. Определение биологических эффектов ростовых факторов проводили после 72-часового воздействия на миобластных культурах по связыванию кристаллического фиолетового или МТТ, как описано ранее (Черников В.Г., Терехов С.М., Крохина Т.Б. и др., Бюлл. эксп. биол. мед. 131, №6, с.680-682 (2001); Черников В.Г., Терехов С.М., Крохина Т.Б. и др., Биомед. технологии, №15, с.79-84 (2001)), а также по окрашиванию проб по методу Гимза (Черников В.Г., Терехов С.М., Крохина Т.Б. и др., Бюлл, эксп. биол. мед. 131, №6, с.680-682 (2001)). Измерение оптической плотности в пробах (лунках), содержащих окрашенные клетки, проводили на фотометре “ЭФОС 9305” при 594 нм (кристаллический фиолетовый), при 492 нм (МТТ) при 620 нм (метод Гимза).

Выращивание клеточных культур в присутствии полученного препарата MGF проводили в среде F-12 с HEPES, с пируватом натрия и гентамицином. Клетки проводились на бессывороточной среде в течении 24 ч. Результаты эксперимента приведены на Фиг.2.

Как видно из Фиг.2, добавление рекомбинантного MGF человека приводит к усилению роста постнатальных миобластов человека.

Пример 7. Применение рекомбинантного MGF человека в фармацевтической композиции для лечения кахексии или для наращивания мышечной массы.

Поскольку известно, что MGF повышает силы как нормальных, так и атрофированных мышц (Goldspink G., J.Muscle Res. Cell Motil. 24(2-3), 121-126 (2003); Goldspink G., Int. J.Biochem. Cell Biol., 38(3), 481-9 (2006)), рекомбинантный MGF человека может быть использован в качестве активного компонента фармацевтической композиции для лечения кахексии. Также рекомбинантный MGF человека может быть использован в качестве активного компонента композиции для наращивания мышечной массы у людей, занимающихся активной физической деятельностью, например спортсменов (Goldspink G., Br. J.Sports Med. 39(11), 787-8 (2005)).

Формула изобретения

1. Кассета для экспрессии и секреции механозависимого фактора роста человека (MGF) в клетках дрожжей, содержащая область промотора гена GAL1 дрожжей; пре-про область гена MF1; последовательность ДНК, кодирующую белок с последовательностью SEQ ID NO:2 или его вариант, обладающий активностью механозависимого фактора роста человека (MGF); и область терминации транскрипции гена CYC1 дрожжей.

2. Рекомбинантная плазмида pKX-MGF, обеспечивающая экспрессию в клетках дрожжей механозависимого фактора роста человека (MGF) и его секрецию из клеток дрожжей, состоящая из большего по размеру продукта расщепления плазмиды рКХ рестриктазами XhoI и NcoI, и XhoI-NcoI фрагмента ДНК, кодирующего механозависимый фактор роста человека (MGF).

3. Клетка дрожжей, трансформированная плазмидой по п.2, – продуцент механозависимого фактора роста человека (MGF).

4. Штамм Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF, трансформированный плазмидой по п.2, – продуцент механозависимого фактора роста человека (MGF).

5. Способ получения рекомбинантного механозависимого фактора роста человека (MGF), включающий стадии выращивания клеток дрожжей по п.3 в питательной среде и выделения рекомбинантного механозависимого фактора роста человека (MGF) из культуральной жидкости.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве клеток дрожжей используют клетки штамма Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF.

РИСУНКИ