Патент на изобретение №2342825

(54) НЕРАЗРУШАЮЩИЙ СПОСОБ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАСТЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и сельского хозяйства. Способ заключается в том, что измеряют показатели зондирующего светового пучка, рассеянного тканями растений. Определяют приведенную когерентность, представляющую собой отношение когерентности к интенсивности, а также средние скорости и относительные величины изменения когерентности и приведенной когерентности за один и тот же интервал времени с 1-5 секунд до 10-500 секунд после включения зондирующего пучка. При этом растительным организмам большей функциональной активности соответствуют более высокие значения указанных показателей. Способ позволяет повысить репрезентативность и достоверность количественных оценок функционального состояния растений, оптимизировать агротехнические приемы возделывания, оценивать устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, отбирать высокоустойчивые сорта. 7 табл., 7 ил.

Изобретение относится к теоретической и экспериментальной биологии и может быть использовано в сельском хозяйстве для оптимизации агротехнических приемов, оценки устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, отбора высокоустойчивых сортов.

Известны анатомические, физиологические и биохимические методы определения функционального состояния растений и их устойчивости к патогенам и неблагоприятным условиям среды (например, по содержанию специфических белков, антиоксидантов, микро- и макроэлементов в листьях, по изменению формы, размера и типа тканевых и клеточных структур). Эти методы трудоемки, дорогостоящи, как правило, носят разрушающий характер и не могут дать комплексную, интегральную оценку физиологического состояния растений. Наиболее близким по технической сущности к изобретению является неразрушающий оптический способ определения функционального состояния растений по интенсивности флуоресценции хлорофилла [1-4]. Однако у этого метода есть несколько принципиальных недостатков. Параметры флуоресценции зависят от уровня фоновой засветки, поэтому необходима длительная (30 мин) темновая адаптация объекта измерений. Недостатком является и невозможность получения комплексной информации о функциональном состоянии растений, так как не учитываются изменения структурных характеристик растительной ткани.

Цель изобретения – повышение репрезентативности и достоверности количественных оценок функционального состояния растительных организмов.

Это достигается тем, что определяют степень когерентности, приведенную когерентность (отношение когерентности к интенсивности), а также средние скорости и относительные величины изменения этих показателей за один и тот же интервал времени, например, начиная с 1…5 с и кончая 10…500 с после включения зондирующего пучка, при этом для каждого типа растительных организмов большей функциональной активности соответствуют более высокие значения указанных показателей.

Пример 1. Для определения параметров функционального состояния растений яблони сорта Голден Делишес на подвое М9, выращенных в лизиметрах при достаточном фосфорном питании (5 мМ KH₂PO₄) и при его дефиците (0,05 мМ KH₂PO₄), использовали срединные листья побегов среднего яруса кроны дерева. Листья отбирали отдельно с коротких и длинных побегов на растениях с плодами и без плодов, т.е. всего 8 вариантов опыта. Объем выборки – по 5-6 листьев с 4-5 растений каждого варианта. Черешки оборачивали влажной фильтровальной бумагой для предотвращения высыхания листьев в процессе измерений. Затем листья выдерживают в течение часа при комнатной температуре и фоновой освещенности 80 лк. Оптический параметр светорассеяния – приведенную когерентность – определяли в 6-8 точках средней зоны каждого листа между крупными жилками. Для сопоставительного анализа предлагаемого способа с прототипом на тех же самых листовых пластинках измеряли методом РАМ [3] удельную фотосинтетическую активность хлорофилла.

В таблице 1 приведены величины приведенной когерентности (G/I), измеренные на 8-й секунде после включения зондирующего пучка, и удельной фотосинтетической активности (Fv/Fm). Исследования показали, что известный метод флуоресценции хлорофилла и предлагаемый способ дают сопоставимые результаты в оценке функционального состояния яблони при различных уровнях фосфорного питания. Статистически значимые различия между блоками вариантов «норма-дефицит» фосфорного питания фиксируются обоими методами, но чувствительность нового способа оказалась выше, что позволило зарегистрировать различия между вариантами по длине побега и наличию плодов. Так, у наиболее контрастных по накоплению и расходу пластических веществ вариантов (короткие и длинные побеги с плодами) приведенная когерентность различается в 1,5 раза, а фотосинтетическая активность – всего на 2,4%. Вероятно, это связано с тем, что при имеющих место соотношениях листовой поверхности и урожая ассимиляционные процессы далеко не в равной мере повлияли на структурную организацию ткани (оценивается по приведенной когерентности) и фотосинтезирующий аппарат клетки (оценивается по удельной фотосинтетической активности).

В целом по всем вариантам фосфорного питания «норма-дефицит» отмечается существенно большая чувствительность нового метода по сравнению с аналогом. При дефиците минерального питания снижение приведенной когерентности светорассеяния составляет 1,5-2,2 раза, тогда как фотосинтетическая активность снизилась только в 1,1-1,3 раза. Высокая чувствительность нового метода позволяет выявить потребность в удобрении на самых ранних стадиях его дефицита.

Пример 2. Для оценки изменения функционального состояния растений огурца сорта «Corona» под действием мучнистой росы и химических средств защиты измеряли когерентность светорассеяния и фотосинтетическую активность семядольных листьев, предварительно обработав шестидневные растения водной суспензией спор возбудителей мучнистой росы Erysiphe cichoracearum и Sphaerotheca fuliginca (вариант «Патоген»); 1% раствором фунгицида «Saprol» (вариант «Фунгицид»); смесью растворов фунгицида и суспензии спор (вариант «Пат + Фунг»). Контрольные растения опрыскивали водой. Через 24 часа после обработки и далее ежедневно на листьях одних и тех же растений, не отделяя их от растения, в течение последующих 5-ти дней вегетации проводили измерения (в одно и то же время суток). Параметры флуоресценции – после 30 минут темновой адаптации, а когерентность светорассеяния – на 2-й секунде засветки зондирующим пучком. В опыте использовали морфологически идентичные листья со здоровых и зараженных растений, при этом в каждом варианте было не менее 10-ти повторностей.

Метод флуоресценции хлорофилла (ФХ) не показал сколь-либо закономерной картины изменения функционального состояния растений огурца в процессе их роста и развития инфекции (фиг.1). Абсолютные значения фотосинтетической активности контрольных листьев были на уровне или ниже зараженных. Основной проблемой при интерпретации этих данных являются огромные компенсаторные возможности фотосинтетического аппарата клетки, с одной стороны, и значительная изменчивость параметров флуоресценции в зависимости от температуры, внешнего освещения и циркадных ритмов, с другой стороны.

Новый способ оценки функционального состояния растений по значению степени когерентности рассеянного лазерного излучения позволяет обнаружить негативные деградационные процессы уже на раннем этапе патогенеза (через 20 часов после заражения) (фиг.2). Далее разница между контрольными и инфицированными растениями усиливалась. Если ранжировать потенциальную жизнеспособность растений по степени когерентности (в %) светорассеяния через 120 часов вегетации после обработки, то она будет выглядеть следующим образом: контрольные растения (34,6%) – вариант «Фунгицид» (27,8%) – вариант «Патоген + Фунгицид» (23,9%) – вариант «Патоген» (17,5%).

Примечательным является факт регистрации ослабления функционального состояния незараженных растений, обработанных фунгицидом. Это позволяет использовать новый метод для оценки экологической безопасности химических препаратов.

Пример 3. Регистрацию изменения когерентности G(t) в процессе засветки лазерным лучом проводили на интактных и прошедших тепловую обработку (горячей водой в течение 10 минут) листьях циссуса ромболистного (фиг.3, табл.2). Степень ингибирования фотосинтетической функции контролировали по удельной флуоресценции хлорофилла Fv/Fm (табл.3). На графиках и в таблице приведены усредненные результаты измерений, проведенных в 8 биологических повторностях.

Кинетическая зависимость G(t) для листьев, прошедших щадящую тепловую обработку (40°С), имеет вид плавно нарастающей кривой, форма которой идентична интактным образцам. При температурах, превышающих порог термоинтактивации хлорофилл-белкового комплекса (50°С и 60°С), вид кинетической зависимости существенно изменяется – отсутствует начальная фаза нарастания степени пространственной когерентности. В таблице 2 приводятся величины степени когерентности (G) в диапазоне 5…95 с засветки, изменение этого показателя за временные интервалы 5…83 с и 11…95 с. В таблице 3 представлена оценка жизнеспособности листьев по критерию жизнеспособности КрЖС, рассчитанного по формуле: КрЖС=(G₉₅-G₁₁)/G₁₁, и величине удельной флуоресценции хлорофилла: Fv/Fm.

Наибольшую величину критерия жизнеспособности демонстрируют интактные листья, наименьшую – прошедшие тепловую обработку при температуре 60°С, что хорошо согласуется с данными метода флуоресценции хлорофилла. Но, помимо этого, по динамике изменения когерентности рассеянного излучения удается зафиксировать существенно большее снижение критерия жизнеспособности для листьев, прошедших обработку при температуре 50°С, чем по величинам удельной фотосинтетической активности, что глубже отражает логику структурно-функциональных изменений, происходящих в клетках под действием высоких температур. Метод-аналог регистрирует функциональное состояние только хлорофилл-белкового комплекса, тогда как по динамике изменения степени когерентности удается оценить интегральное функциональное состояние растительной ткани с учетом тех нарушений, которые происходят и при термоинтактивации цитоплазмы.

Пример 4. Степень поражения растений шпината сорта Santa Felix биотрофным паразитом Perenospora spinaceae оценивали по степени когерентности (G) и приведенной когерентности (G/I) рассеянного лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм, а также визуально с использованием стереомикроскопа. Одновременно, на тех же самых объектах состояние фотосинтезирующих систем определяли методом флуоресценции хлорофилла. В таблице 4 представлены абсолютные значения степени когерентности, приведенной когерентности и параметров флуоресценции хлорофилла для различных стадий развития инфекции: 1 стадия – непроросшие споры патогена на здоровой ткани листа; 2 стадия – начало заражения, проникновение гифов гриба в мезофилл листовой пластинки; 3 стадия – разрастание гаусторий гриба в межклеточном пространстве листовой пластинки, появление признаков хлороза, 4 стадия – появление конидий, начало спороношения.

Первые признаки болезни (вторая стадия развития инфекции) проявляются в статистически значимом (р=0,02) снижении (не менее, чем на 20%) критериев функционального состояния, предлагаемых в соответствии с новым способом (G, G/I), по отношению к здоровым растениям (первая стадия), тогда как удельная фотосинтетическая активность осталась неизменной. Только на 3-й стадии развития патогенного процесса, когда признаки болезни становятся визуально различимы в результате хлороза пораженных тканей, параметры флуоресценции хлорофилла снижаются на 23%, степень когерентности – на 66%, а приведенная когерентность – в 2,4 раза. При дальнейшем развитии инфекции (4 стадия) различия всех критериев функционального состояния растений пораженных и интактных растений усиливаются с сохранением большей чувствительности нового метода по сравнению с аналогом. Таким образом, новый способ позволяет выявить очаг заболевания на самых ранних стадиях развития грибной инфекции, когда потеря жизнеспособности растения минимальна, а меры по защите растений наиболее эффективны.

Пример 5. Функциональное состояние 12-летних деревьев яблони, зараженных паршой, определяли по динамике изменения приведенной когерентности прошедшего сквозь листовую пластинку лазерного излучения длиной волны 650 нм и плотностью мощности 300 Вт/м², снятой в течение непрерывной 100-секундной засветки. Для анализа отбирали по 6 листьев из середины побегов среднего яруса кроны здоровых и пораженных паршой деревьев, при этом визуальное состояние (внешний вид) листовых пластинок обоих вариантов было идентичным. На фиг.4 представлен график изменения приведенной когерентности в процессе засветки листовой пластинки лазерным излучением. Первые 10-15 секунд засветки у листьев незараженных растений отмечается положительная динамика изменения приведенной когерентности, а у больных паршой – отрицательная. Продолжение засветки вызывает флуктуацию параметров, но при этом приведенная когерентность излучения, рассеянного листьями здоровых растений, в 3-5 раз выше значения, полученного в начальный момент падения зондирующего пучка на лист, и постоянно, хоть и с разной скоростью, растет. У зараженных листьев этот показатель не превышает значения нулевого отсчета и не имеет тенденции роста. Таким образом, нарушение динамики изменения приведенной когерентности рассеянного лазерного пучка в процессе воздействия света отражает известный факт существенно меньшей адаптивной способности ослабленных болезнью растений.

Пример 6. Влияние хлороза на функциональное состояние растений оценивали по динамике изменения степени когерентности лазерного излучения, рассеянного листовыми пластинками амброзии трехраздельной (фиг.5) и циссуса ромболистного (фиг.6). Степень хлоротичности листьев оценивали по коэффициенту пропускания света в красной области спектра (табл.6). Хлоротичные листья визуально отличались от здоровых желто-зеленой окраской. Состояние фотосинтезирующей системы листьев циссуса ромболистного дополнительно контролировали по показаниям флуоресценции хлорофилла. Хлоротичные листья отличались от здоровых как по абсолютным величинам степени когерентности, так и по динамике изменения этого показателя в процессе засветки. Так, у хлоротичных листьев циссуса ромболистного прирост когерентности происходит в 6 раз медленнее, чем у здоровых растений. Флуоресценция тех же самых листьев имеет менее чем 30% снижение Fm и только лишь 10,5% уменьшение удельной фотосинтетической активности Fv/Fm по сравнению со здоровыми (табл.6). Столь высокая чувствительность нового метода позволяет выявлять хлороз на самых ранних этапах развития болезни, когда принятые меры борьбы наиболее эффективны, а ущерб – минимальный.

Пример 7. Динамика изменения приведенной когерентности светорассеяния лазерного пучка листьями разного возраста показана на примере растений циссуса ромболистного. Одновременно, с разрывом 1-2 минуты, на одних и тех же листьях (не отделяя их от материнского растения) снимали показания приведенной когерентности и параметров флуоресценции хлорофилла (фиг.7, табл.7). Новый метод отличается большим динамическим диапазоном, что позволяет обнаружить старение листьев на самых ранних этапах онтогенеза. Следует отметить существенную разницу динамики изменения приведенной когерентности молодых и старых листьев при исходно равном значении данного показателя в начале засветки. В то же время по всем трем параметрам флуоресценции разница между молодыми и зрелыми листьями незначительна, что говорит о некорректной оценке физиологического состояния по флуоресценции хлорофилла.

Таким образом, абсолютные значения когерентности, приведенной когерентности рассеянного света, а также динамика их изменения в процессе облучения объекта дают более полную, интегральную оценку функционального состояния растений и позволяют зарегистрировать отклонение от нормы на самых ранних стадиях повреждения, независимо от его природы.

Способ эффективен как для оптимизации технологий выращивания растений, так и для оценки устойчивости сортов к повреждающим факторам окружающей среды, что позволяет использовать его в селекционной практике.

Предлагаемый способ позволяет достоверно и оперативно определить функциональное состояние растений без привлечения дорогостоящих химических анализов. Способ сокращает сроки анализа и снижает трудоемкость работ.

Литература

1. А.с. СССР 1768071, кл. А01G 7/00, 1990, бюлл. №38, с.14.

2. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. – М.: Наука, 1990, 200 с.

3. Applications of chlorophyll fluorescence in photosynthesis research, stress physiology, hydrobiology and remote sensing / Edited by H.K.Lichtenthaler. – Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1988. – 354 с.

4. Корнеев Д.Ю. Информационные возможности метода индукции флуоресценции хлорофилла. – Киев: Альтерпрес, 2002. – 188 с.

Таблица 5
Критерии функционального состояния	Здоровые растения яблони	Растения яблони, зараженные паршой
G/I20	1,62	0,68
G/I80	3,84	0,50
(G/I)=G/I20-G/I0	1,02	-0,59
(G/I)=G/I80-G/I20	2,22	-0,18

Таблица 6
Критерии функционального состояния	Амброзия трехраздельная		Циссус ромболистный
	Здоровый	Хлоротичный	Здоровый	Хлоротичный
Коэфф. пропускания	4,7	6,4	4,1	7,5
G=G120-G10	18,0	5,4	18,7	2,1
G120	47,8	31,3	56,5	23,8
Fm	–	–	714,2±8,4	534,0±10,7
Fo	–	–	152,4±1,3	159,2±1,74
Fv/Fm	–	–	0,786±0,001	0,703±0,008

Таблица 7
Критерии функционального состояния	Циссус ромболистный
	Молодой лист	Зрелый лист	Старый лист
Fm	725,7±2,20	754,0±2,4	404,2±9,2
Fo	191,3±0,92	186,3±0,99	161,0±2,3
Fv/Fm	0,737±0,001	0,753±0,0015	0,601±0,006
G/I4	0,428	0,506	0,081
G/I40	0,602	1,155	0,090
G/I100	0,579	1,677	0,102
(G/I)=G/I40-G/I4	0,17	0,65	0,01

Формула изобретения

Способ функциональной диагностики растительных организмов, заключающийся в измерении рассеянного их тканями зондирующего светового пучка, отличающийся тем, что определяют приведенную когерентность, представляющую собой отношение когерентности к интенсивности, а также средние скорости и относительные величины изменения когерентности и приведенной когерентности за один и тот же интервал времени с 1-5 с до 10-500 с после включения зондирующего пучка, при этом для каждого типа растительных организмов большей функциональной активности соответствуют более высокие значения указанных показателей, что позволяет повысить репрезентативность и достоверность количественных оценок функционального состояния растений.

РИСУНКИ