Патент на изобретение №2341198

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ АНГИОГЕННЫХ ФАКТОРОВ ПРИ ХИМИОТЕРАПИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при морфологических исследованиях для оценки эффективности неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии больных раком молочной железы. Сущность изобретения заключается в том, что после удаления опухоли оценку эффективности проводят, определяя экспрессию ангиогенного фактора VEGF в цитоплазме опухолевых и эндотелиальных клеток удаленного операционного материала. Снижение экспрессии VEGF как в опухолевых клетках, так и на эндотелии сосудов, свидетельствует о снижении ангиогенного потенциала опухоли под воздействием указанной химиотерапии. 4 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”al. Combined biological therapy of breast cancer using monoclonal antibodies directed against HER2/neu protein and vascular endothelial growth factor. Semin. Oncol. 2002 Jun; 29 (3 Suppl 11): 29-37. реферат, он-лайн [Найдено в Интернет на www.pubmed.com 30.10.2007], PMID: 12138395 [PubMed – indexed for MEDLINE].

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при морфологических исследованиях для оценки ангиогенных факторов эффективности неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии больных раком молочной железы.

Известно, что по мере увеличения опухоли в размерах ее центральный участок попадает в условия гипоксии, что является стимулом к выработке сосудистых факторов роста. Когда размер опухоли достигает определенного критического значения (0,5-2 мм), кровоснабжение опухоли из рядом лежащих сосудов становится невозможным. Прекращается доставка кислорода и питательных веществ.

Высокий уровень VEGF ассоциируется с неблагоприятным прогнозом, повышенным риском развития рецидива опухоли и метастазирования у пациентов с различными онкологическими заболеваниями. Антитела к VEGF блокируют поступающие из опухоли сигналы, которые необходимы для роста сосудов. В результате прекращения поступления питательных веществ и кислорода опухоль перестает расти. Т.о., VEGF занимает позицию главного митогена эндотелиальных клеток, и его присутствие требуется для образования незрелых сосудов при васкулогенезе или неоангиогенезе.

Однако для четкой визуализации эндотелиальных клеток необходимо иммуногистохимическое исследование. Для различия клеток кровеносных и лимфатических сосудов в последние годы описываются новые маркеры: наряду с поверхностными антигенами эндотелиальных клеток (CD31) в этой связи имеют значение рецепторы крово- и лимфоангиогенных факторов VEGF-A, -В, -С и -D.

Обычно первый этап прогрессии опухолей – это врастание в первичный узел сосудов. Этот процесс обозначается терминами “васкуляризация” или “ангиогенез”. В первичный узел сосуды не прорастают, пока клетки эндотелия (внутреннего слоя) сосудов не получают от опухоли соответствующих сигналов. Ангиогенез начнется тогда, когда в опухоли произойдет изменение в геноме, ведущее к включению гена, который отвечает за синтез сигнальных белков. Такими белками, посылающими эндотелию сосудов сигнал к росту, является VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). Этот белок, будучи секретируемым клетками опухолей, контактирует со своими рецепторами на поверхности клеток эндотелия сосудов и передает им сигнал к росту. Клетки начинают делиться и врастать в ткань опухоли, формируя в ней капиллярную сеть. В результате начинается активное кровоснабжение опухоли и снимается ограничение ее роста.

Опухоли способны синтезировать целый ряд ангиогенных факторов роста, то есть таких, которые стимулируют образование кровеносных сосудов. Наиболее известный и распространенный среди них – так называемый васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF). Именно он и заставляет кровеносную систему организма закладывать новые сосуды, пронизывающие опухоль и образующие в ней разветвленную сеть.

Плотность микрососудов, которая отражает количество/объем развития кровеносных сосудов (образования новых сосудов), от которого зависит рост опухоли, значительно больше в ткани, пораженной раком, чем в здоровой, и она находится в определенном соотношении с распространением опухоли.

В опухоли существуют две основные группы клеток, которые определяют интенсивность роста микрососудов – это опухолевые клетки, которые выделяют стимуляторы и/или ингибиторы ангиогенеза, и нормальные стромальные клетки (фибробласты, лимфоциты, эндотелиальные клетки и т.п.). Они либо также могут стимулировать и/или ингибировать ангиогенез (фибробласты, лимфоциты), либо сами являются непосредственной мишенью для выделяемых факторов (эндотелиальные клетки). Обе группы находятся в динамическом взаимодействии. Экспрессия определенных модуляторов ангиогенеза в опухолевых клетках приводит к изменению фенотипа в эндотелиальных клетках. Тогда как недостаток в питательных веществах и гипоксия из-за небольшого количества микрососудов в опухоли приводит к усилению экспрессии ангиогенных стимуляторов в опухолевых и стромальных клетках.

Следующий источник информации, касающийся действия таргетных препаратов, применимых у больных, опухоли которых содержат конкретные мишени для воздействия этих препаратов, мы взяли в качестве прототипа изобретения (см. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. Под ред. Н.И.Переводчиковой. М., 2005).

Известно, что неоангиогенез – важнейший этап канцерогенеза, возможная мишень таргетной терапии. Ингибиторы ангиогенеза исследуются в качестве противоопухолевых средств. На стадии исследования бевацизумаб – МКА (молекулярно-нацеленные препараты к рецепторам VEGF при раке молочной железы, раке почки). Применение этого препарата разрешено в США при метастатическом колоректальном раке в комбинации с фторурацилом и принотеканом. Изучается противоопухолевое действие ингибитора ЦОГ-2 целекоксиба, который испытывался при некоторых опухолевых заболеваниях, в частности, при колоректальном раке и раке молочной железы.

Однако эти препараты не нашли практического применения в настоящее время.

В данной работе мы оценили экспрессию ангиогенного фактора VEGF в опухолевых и эндотелиальных клетках в ткани рака молочной железы после проведения неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии и провели анализ взаимосвязи между VEGF на опухолевых и эндотелиальных клетках.

Целью изобретения является оценка ангиогенеза опухоли как прогноз течения заболевания и чувствительности к противоопухолевой аутоплазмохимиотерапии.

Поставленная цель достигается тем, что после проведения неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии проводят иммуногистохимическое исследование результатов лечения, оценивают ангиогенез в цитоплазме опухолевых и эндотелиальных клеток, выявляют подавление ангиогенеза, выражающееся в снижении экспрессии ангиогенного фактора – VEGF, экспрессию VEGF на эндотелиальных клетках микрососудов опухоли обнаруживают в 55% случаев, регистрируют одновременную экспрессию фактора VEGF в эпителиальных и эндотелиальных клетках, эти показатели свидетельствуют о снижении злокачественного потенциала в опухоли, подтвержденного клиническим эффектом.

Изобретение «Способ оценки ангиогенных факторов при химиотерапии рака молочной железы» является новым, так как оно неизвестно в области онкологии при морфологических исследованиях для оценки результатов лечения неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии больных раком молочной железы.

Новизна изобретения заключается в том, что впервые при иммуногистохимическом исследовании на основе ангиогенеза оценивают результаты аутоплазмохимиотерапии больных раком молочной железы в предоперационном периоде, выявляют подавление ангиогенеза, выражающееся в снижении экспрессии ангиогенного фактора – VEGF, экспрессию VEGF на эндотелиальных клетках микрососудов опухоли обнаруживают в 55% случаев, регистрируют одновременную экспрессию фактора VEGF в эпителиальных и эндотелиальных клетках, эти показатели свидетельствуют о снижении злокачественного потенциала в опухоли, подтвержденного клиническим эффектом.

Изобретение «Способ оценки ангиогенных факторов при химиотерапии рака молочной железы» является промышленно применимым, так как может быть использовано в медицинских учреждениях онкологического профиля, научно-исследовательских онкологических институтах, онкодиспансерах.

Пример конкретного применения «Способа оценки ангиогенных факторов при химиотерапии рака молочной железы»

Нами был исследован патоморфоз опухолей молочной железы под влиянием аутоплазмохимиотерапии и исследованы молекулярные механизмы ангиогенеза с использованием сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, участвующего в регуляции образования и роста новых сосудов.

Нами были взяты две группы больных по 20 человек: – группа АПХТ – больные после предоперационной аутоплазмохимиотерапии и контрольная группа – больные, которым первым этапом лечения была выполнена радикальная мастэктомия.

Морфологическому исследованию подвергся удаленный операционный материл – молочная железа с регионарными лимфатическими узлами. При гистологическом и морфометрическом исследовании на световом уровне определяли гистологический характер опухоли, изменение структуры опухоли под действием введения химиопрепаратов на аутоплазме, соотношение стромы, паренхимы после лечения, индекс повреждения паренхимы, митотическую активность, дистрофические изменения в раковых клетках.

Проведенное морфологическое исследование свидетельствовало о более выраженном регрессе раковых опухолей молочных желез, наступающем под действием химиопрепаратов, введенных на аутоплазме, в 60% случаев после проведения АПХТ отмечено достижение лечебного патоморфоза.

После АПХТ в большинстве опухолей отмечались дистрофические изменения в раковых клетках, располагавшихся мелкими островками или одиночно, среди стромы и участков выраженного фиброза и гиалиноза встречались комплексы гигантских гиперхромных многоядерных клеток. Кроме того, часто обнаруживались отложения извести в протоках и среди соединительной ткани. После гистологического исследования в группе АПХТ в некоторых случаях наблюдался полный регресс клинически определяемых до начала лечения метастазов в регионарных лимфоузлах, а в оставшихся метастатических узлах произошла резкая регрессия, выражавшаяся в наличии единичных опухолевых клеток среди лимфоидной ткани и участков склероза, отложением бесструктурных эозинофильных масс и солей извести на месте метастаза.

Данные световой микроскопии подтвердились морфометрическими исследованиями.

Соотношение структурных компонентов опухоли в группе АПХТ свидетельствовало о достоверно большем перевесе в сторону соединительной ткани (р0,05) по сравнению с контрольной группой, в группе АПХТ она составила 84,4±6,9%. Площадь, занятая сохранившимися опухолевыми клетками в группе АПХТ, составила 14,4±0,8%, что в 2,5 больше, чем в контрольной группе, где она равнялась 36,6±4,2%. В результате индекс повреждения опухоли был 60,7%.

Количество дистрофически измененных клеток после АПХТ было достоверно выше, чем в контрольной группе, в 2,5 раза.

Митотическая активность опухолей молочной железы в группе АПХТ достоверно отличается от контрольной группы и находится на очень низком уровне.

Следует отметить преобладание очагов некрозов в контрольной группе по сравнению с группой АПХТ в 2,2 раза. Учитывая, что обратная закономерность наблюдалась в отношении площадей, занятых паренхимой и стромой опухоли, можно предполагать, что при химиотерапии на аутоплазме быстрее происходит резорбция некротически измененных тканей из опухоли и замещение ее соединительнотканным компонентом.

Солидные опухоли требуют кровоснабжения для своего роста, и многие новые концепции лечения онкологических заболеваний направлены на подавление васкуляризации опухоли.

В контрольной группе экспрессия VEGF была выявлена в цитоплазме опухолевых клеток в 80% (16 из 20) опухолях молочной железы. У 9 из 16 больных (56,2%) мы наблюдали окрашивание более 60% опухолевых клеток антителами к VEGF, у 3 (18,8%) – 50%, у 2 (12,5%) – 40%, и у 2 (12,5%) всего 30% опухолевых клеток воспринимали окраску к VEGF.

В зависимости от гистологического строения опухоли мы наблюдали положительную экспрессию VEGF на опухолевых клетках (VEGF_{опухоль}+): в 11 случаев из 14 инфильтрирующего протокового рака, 3 случая из 4 инфильтрирующего долькового рака и в обоих случаях папиллярного рака.

Мы также оценили экспрессию VEGF на эндотелиальных клетках микрососудов опухоли. Экспрессия VEGF на эндотелиальных клетках сосудов (VEGF_сосуды+) была обнаружена в 95% случаев (19 из 20) рака молочной железы этой группы.

Данные о совместной экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста на опухолевых клетках и клетках эндотелия сосудов представлены в таблице 1.

Как видно из приведенных данных, полное отсутствие экспрессии VEGF было отмечено всего в 5% случаев, а одновременная экспрессия этого фактора эпителиальными и эндотелиальными клетками, напротив, встречалась в 80% наблюдений. В 3 случаях мы отмечали окраску антителами к VEGF эндотелия сосудов при отсутствии окрашивания опухолевых клеток. Ни разу не было отмечено отсутствия экспрессии VEGF на эндотелии при экспрессии его опухолевыми клетками.

У данной группы больных, не подвергавшихся предоперационной химиотерапии, мы оценивали связь между экспрессией VEGF и поражением регионарных лимфоузлов.

Нами также была обнаружена связь между экспрессией VEGF в опухолевых клетках и поражением регионарных лимфоузлов: все 12 больных, имеющие гистологически подтвержденные метастазы в лимфоузлы, имели иммуногистохимический фенотип РМЖ – VEGF_{опухоль}+.

Необходимо отметить, что VEGF_{опухоль}+ раки с метастазами в подключичные лимфоузлы имели более интенсивную окраску цитоплазмы опухолевых клеток и больший процент клеток, окрашенных антителами, а именно, во всех 6 случаях было окрашено 60% опухолевых клеток, что, как мы полагаем, может косвенно свидетельствовать о повышенной количественной продукции опухолевыми клетками эндотелиального фактора роста на более поздних стадиях рака молочной железы (в нашем случае IIIC стадия рака молочной железы с поражением подкрыльцово-подлопаточно-подключичных лимфоузлов).

В данной группе больных экспрессия VEGF опухолью зависела от степени дифференцировки опухоли: все 13 низкодифференцированных опухолей экспрессировали фактор роста эндотелия сосудов и 3 из 7 умереннодифференцированных опухолей были VEGF_{опухоль}+.

Мы также оценили экспрессию VEGF в зависимости от размера опухолевого узла. Полученные данные отражены в таблице 2.

Так, из 16 положительных по экспрессии VEGF опухолей 6 были менее 2 см в диаметре, от 2 до 5 см и более 5 см были положительны по экспрессии по 5 опухолей. Таким образом, положительная экспрессия опухолевыми клетками VEGF не зависела от размера опухолевого узла в контрольной группе. В нашем исследовании не было выявлено ни одной опухоли с фенотипом VEGF_{опухоль} – меньше 2 см в диаметре, тогда как опухолей диаметром больше 5 см с данным фенотипом было большинство.

В группе АПХТ экспрессия VEGF в цитоплазме опухолевых клеток была выявлена в 35% (7 из 20) случаев рака молочной железы. У 2 больных (28,6%) мы наблюдали 50% опухолевых клеток, окрашенных антителами к VEGF, у 2 больных (28,6%) – 40% и у 3 больных (42,8%) было окрашено всего 30% опухолевых клеток. Нами также отмечено снижение интенсивности окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток к VEGF в 5 из 7 случаев рака молочной, что мы объясняем выраженным повреждением паренхимы опухоли под действием аутоплазмохимиотерапии, а также нарастанием дистрофически измененных клеток в оставшейся опухоли и снижением их митотической активности.

Мы не заметили связи между гистологическим типом рака и экспрессией опухолевыми клетками VEGF. 5 из 14 опухолей инфильтрирующего протокового рака были положительными по экспрессии VEGF и по 1 случаю инфильтрирующего долькового и папиллярного рака были VRGF_{опухоль}+.

На эндотелиальных клетках микрососудов опухоли экспрессия VEGF была обнаружена в 55% случаев (11 из 20) рака молочной железы, при этом в большинстве случаев (45%) экспрессия фактора отсутствовала как в клетках опухоли, так и на эндотелии сосудов, в 20% случаев опухоль по фенотипу соответствовала VEGF_{опухоль}-/VEGFсосуды+ и в 35% случаев зарегистрирована одновременная экспрессия фактора в эпителиальных и эндотелиальных клетках (табл.3). Иммуногистохимического фенотипа VEGF_{опухоль}+/VEGF_сосуды– в этой группе, как и в предыдущих, отмечено не было.

Мы оценили связь между экспрессией опухолевыми клетками сосудистого эндотелиального фактора роста и размером опухолевого узла. Полученные данные представлены в таблице 4.

Из представленной таблицы видно, что положительными по экспрессии опухолью сосудистого эндотелиального фактора роста в преобладающем большинстве были опухоли меньше 2 см, тогда как опухоли с фенотипом VEGF_{опухоль}+ больше 5 см мы не наблюдали ни одной. Напротив, отсутствие экспрессии опухолевыми клетками VEGF в большинстве случаев наблюдалось, когда диаметр опухоли превышал 5 см.

Количественная оценка внутриопухолевой микрососудистой сети в раке молочной железы, выявленная нами при иммуногистохимическом исследовании с помощью антител CD31, позволила нам качественно оценить процесс ангиогенеза в каждой из исследуемых групп.

В контрольной группе микрососудистое русло внутри опухоли было представлено капиллярами от 2,3 до 44,4 мкм в диаметре. В одном поле зрения, в среднем, мы наблюдали 7,8 сосуда. Средний диаметр всех сосудов, окрашенных антителами CD31, был равен 5,6±0,7 мкм.

В группе АПХТ мы наблюдали выраженные изменения внутриопухолевой микрососудистой плотности, что выражалось в уменьшении почти в 2 раза по сравнению с контролем количества окрашенных антителами сосудов и составило для опухолей данной группы – 4,1 сосуда в 1 поле зрения. Вырос практически в 1,7 раза по сравнению с группой контроля средний диаметр определяемых сосудов – до 9,2±0,7 мкм. В группе АПХТ мы наблюдали сосуды от 4,1 до 44,6 мкм. Возрастание среднего диаметра сосудов мы объясняем тем, что в опухоли отсутствовали сосуды минимального диаметра, которые мы наблюдали в контрольной группе.

После АПХТ достоверное уменьшение количества сосудов в поле зрения по сравнению с контрольной группой произошло за счет исчезновения сосудов наименьшего диаметра, которые, по нашему мнению, являются незрелыми, нестабильными, с активно пролиферирующим эндотелием, необходимым для их роста, на который так же, как и на опухолевую клетку, но в меньшей степени действует химиопрепарат, вызывая его гибель.

Также более выраженные изменения, касающиеся опухолевого ангиогенеза после АПХТ, мы объясняем существенным регрессом опухолей молочной железы, наступающим под действием химиопрепаратов, введенных на аутоплазме, а именно, в большинстве опухолей отмечались значительные дистрофические изменения в раковых клетках, и происходила гибель большей доли паренхимы опухоли, что привело к снижению продукции опухолевыми клетками сосудистого эндотелиального фактора роста и, как следствие, к отсутствию процесса образования в опухолях новых незрелых сосудов малого диаметра.

Таким образом, проведенное разностороннее исследование рака молочной железы под влиянием химиотерапии на аутоплазме выявило связь между традиционными проявлениями морфологических признаков лекарственного патоморфоза и молекулярно-биологическими особенностями ангиогенеза.

Технико-экономическая эффективность

«Способа оценки ангиогенных факторов при химиотерапии рака молочной железы» заключается в том, что проведенное морфологическое исследование свидетельствует о более выраженном регрессе раковых опухолей молочных желез, наступающем под действием препаратов, введенных на аутоплазме. В 60% случаев после проведения АПХТ отмечено достижение III и IV степени лечебного патоморфоза. Наиболее выраженные изменения процессов ангиогенеза происходили в опухолях, подверженных неоадъювантной АПХТ. Эти изменения затрагивали как уменьшение экспрессии опухолью сосудистого эндотелиального фактора роста, так и снижение микрососудистой плотности в самой опухоли. Так, в группе АПХТ, соответственно, в 1,9 раза по сравнению с контрольной группой снизилось количество сосудов, определяемых в одном поле зрения. Кроме того, после АПХТ достоверное уменьшение количества сосудов в поле зрения по сравнению с контрольной группой произошло за счет исчезновения сосудов наименьшего диаметра, которые, по нашему мнению, являются незрелыми, нестабильными, с активно пролиферирующим эндотелием, необходимым для их роста, на который так же, как и на опухолевую клетку, но в меньшей степени действует химиопрепарат, вызывая его гибель.

Также более выраженные изменения, касающиеся опухолевого ангиогенеза после АПХТ, мы объясняем существенным регрессом опухолей молочной железы, наступающим под действием химиопрепаратов, введенных на аутоплазме, а именно, в большинстве опухолей отмечались значительные дистрофические изменения в раковых клетках, и происходила гибель большей доли паренхимы опухоли, что привело к снижению продукции опухолевыми клетками сосудистого эндотелиального фактора роста и, как следствие, к отсутствию процесса образования в опухолях новых незрелых сосудов малого диаметра.

Кроме того, в группе АПХТ уменьшение количества сосудов в поле зрения происходило за счет исчезновения и уменьшения количества сосудов наименьшего диаметра, которые, по нашему мнению, являются незрелыми, нестабильными, с активно пролиферирующим эндотелием, необходимым для их роста, на который так же, как и на опухолевую клетку, но в меньшей степени действует химиопрепарат, вызывая его гибель.

Таким образом, проведенное иммуногистохимическое исследование, выявившее снижение экспрессии VEGF как в опухолевых клетках, так и на эндотелии сосудов и, как следствие, уменьшение внутриопухолевой микрососудистой плотности, свидетельствует о снижении ангиогенного потенциала опухоли под воздействием химиотерапии на естественной среде организма – плазме.

Формула изобретения

Способ оценки эффективности химиотерапии рака молочной железы путем оценки ангиогенных факторов, отличающийся тем, что для оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии определяют экспрессию ангиогенного фактора VEGF в цитоплазме опухолевых и эндотелиальных клеток удаленного операционного материала.