Патент на изобретение №2339949

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СТАБИЛЬНОЙ РЕМИССИИ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ПРОТИВОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ГЕПАТИТОМ С

(57) Реферат:

Предлагаемая группа изобретений относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, и может использоваться для прогнозирования стабильной ремиссии при проведении противовирусной терапии у больных с острым гепатитом С. Сущность способа: у больного определяют содержание в сыворотке крови интерферона- (ИНФ-) до начала лечения и через 2 недели после начала лечения. Стабильную ремиссию прогнозируют, если через 2 недели после начала лечения содержание ИНФ- в 1,5-2 раза и более превышает содержание ИНФ- до начала лечения. Использование способа позволяет повысить точность прогнозирования стабильной ремиссии на ранних стадиях заболевания, что дает возможность своевременной коррекции тактики противовирусной терапии. 4 ил.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”интерферонового статуса людей по пробам цельной крови. Вопросы вирусологии. 1988, т.3, №4, с.433-436. БУЕВЕРОВ А.О. и др. Апоптоз мононуклеаров периферической крови и оценки эффективности противовирусной терапии хронического гепатита С. – М.: Клиническая медицина, 2006, 84, №9, с.39-44. реф. Найдено из БД VINITI.RU. [найдено 25.09.2007].[он лайн]. LV 13152 В, 20.08.2004. EGUCHI YUICHIRO et all. Высокий уровень сывороточного лептина является независимым фактором риска у неотвечаемых на лечение пациентов при хроническом гепатите С (ХГС) с низким уровнем виремии. World J. Gastroenterol. 2006. 12, №4, с.556-560. реф. Найдено из БД VINITI.RU. [Найдено 25.09.2007]. [он-лайн].

Предлагаемая группа изобретений относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, и может использоваться для прогнозирования исхода острого гепатита С (далее ОГС).

Вирус гепатита С является одной из главных причин заболеваний печени и может приводить к циррозу печени или гепатокарциноме. По мнению большинства исследователей, именно Т-клеточному иммунному ответу принадлежит основная роль в развитии и исходе болезни. Вероятно, хронизация процесса может быть обусловлена сниженной чувствительностью HCV и клеток макроорганизма к действию цитокинов или недостаточной продукцией последних. Дополнительными факторами, способствующими персистенции HCV, являются вирусная ингибиция процессинга и презентации антигена, иммунологическая толерантность к HCV, инактивация эпитопов цитотоксических лимфоцитов, апоптоз иммунокомнетентных клеток [1, 8, 9, 11]. Комбинация методов непосредственной ингибиции вирусной репликации и индукции сильного HCV-специфического иммунного ответа является обнадеживающей перспективой лечения больных острой и хронической формами HCV-инфекции. С этой точки зрения иммунологические показатели следует рассматривать как необходимый компонент показаний к назначению противовирусной терапии (ПВТ) [2, 7, 10, 17, 26]. Поэтому на современном этапе проблема противовирусной терапии острого гепатита С (ОГС) является одной из наиболее актуальных. Это связано, прежде всего, с доказанной возможностью предотвращения хронизации процесса у 60-80% больных [3, 4, 13]. Кроме того, раннее начало лечения позволяет сократить его продолжительность до 3-6 месяцев, что существенно снижает стоимость терапии. При назначении противовирусной терапии появляется возможность прогнозирования стабильной ремиссии. Формирование стабильной ремиссии характеризуется отсутствием клинико-биохимического обострения и маркеров активной репликации вируса через 6 месяцев после окончания противовирусной терапии. К настоящему времени эта проблема прогноза еще не решена [14, 15]. Тем не менее, есть единичные попытки сформулировать прогностические критерии появления стабильной ремиссии. Исследования, которые обращают на себя внимание, посвящены изучению сероконверсии у больных ОГС [5, 6]. В 2005 году Бузиной А.Б. был разработан выбранный за прототип способ прогнозирования стабильной ремиссии, который заключался в определении перед лечением, через 1 месяц, через 3 месяца от начала лечения наличия в сыворотке крови a/HCVcor IgM, a/HCVns3 и a/HCVns5, что являлось неблагоприятным прогностическим признаком для формирования стабильной ремиссии, его чувствительность составила 82,6%, а специфичность – 74,5%. Обращает на себя внимание недостаточная специфичность прогноза, основанного на изучении гуморальных факторов иммунной системы. Гуморальный иммунный ответ на разные антигенные детерминанты вируса может быть нетипичным для того или иного варианта развития болезни. Поэтому для клинического прогноза недостаточно учитывать спектр антител и сроки сероконверсии. Необходимо более глубокое изучение факторов, которые регулируют и определяют реактивность иммунной системы.

Лечение больных ОГС направлено на прекращение репликации вируса, его полной элиминации, уменьшение активности воспалительного процесса в печени и повышение реактивности иммунной системы [18, 20, 25]. Препаратом выбора при лечении ОГС является рекомбинантный интерферон-, обладающий как прямым антивирусным действием, так и опосредованной иммуномодулирующей активностью [19, 21, 23, 24]. После связывания его со специфическим рецептором клеточной мембраны ИНФ- индуцирует синтез ряда функциональных белков, включая олигоаденилатсинтетазу. Она активирует эндорибонуклеазу, которая разрушает РНК вируса, подавляя его репликацию. ИНФ- обладает широким спектром действия: стимулирует фагоцитоз, активность естественных киллеров, выработку цитокинов, эффекторных клеток иммунной системы, усиливает продукцию генов HLA I класса [19, 20, 26].

В задачу предлагаемого изобретения положено повышение чувствительности (до 91,6%), специфичности (до 87,5%) и быстроты выводов (через 2 недели) для прогнозирования стабильной ремиссии при проведении противовирусной терапии больным острым гепатитом С.

Поставленная задача достигается тем, что исследуют содержание медиатора иммунного ответа интерферона (ИНФ-), а именно: у больного до начала противовирусной терапии определяют содержание в сыворотке ИНФ-, затем определяют содержание этого показателя через 2 недели: при содержании ИПФ-, превышающем исходный уровень в 1,5-2 раза и больше, прогнозируют стабильную ремиссию; при увеличении содержания ИНФ- менее чем в 1,5-2 раза от исходною уровня прогнозируют отсутствие стабильной ремиссии.

Описание фигур:

На фигуре 1 показана динамика показателей ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО- при базисной и противовирусной терапии.

На фигуре 2 приведен график динамики содержания ИПФ- при базисной и при противовирусной терапии.

На фигуре 3 показана динамика содержания ИНФ- у больных ОГС с разными результатами противовирусной терапии.

Предлагаемое изобретение было разработано в ходе продолжительною исследования, включающего изучение большого количества иммунологических, иммунохимических, биохимических показателей при динамическом наблюдении в течение 6 месяцев. В результате был отобран наиболее важный для прогноза показатель (ИНФ-), а также наиболее информативные сроки проведения определения его содержания (в начале противовирусной терапии и через 2 недели после начала лечения). Подробно ход исследования изложен ниже.

Диагноз ОГС устанавливали на основании данных анамнеза, клинико-лабораторных данных. Критерии диагноза острого гепатита С соответствовали Приказу Минздрава №408 (1989). Всем больным проводилось ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости. Маркеры HCV в сыворотке крови больных определяли иммуноферментным методом; полимеразной цепной реакцией (ПЦР) исследовали в крови HCV-PHK. Показанием для назначения ПВТ служили наличие HCV-PHK, a/HCV и повышение трансаминаз.

Медиаторы иммунного ответа определялись иммуноферментным методом с использованием тест-систем производства «Протеиновый контур», Санкт-Петербург. Средние показатели ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-, ИНФ- в контрольной группе составили 153,4±10,4 Пг/мл, 56,3±4,2 Пг/мл, 53,2±4,1 Пг/мл, 58,4±4,5 Пг/мл, 44,3±3,1 Пг/мл, 48,3±3,2 Пг/мл, 156,4±10,6 Пг/мл. В целях уточнения пределов нормальных колебаний значений всех изучавшихся показателей медиаторов иммунного ответа были проведены исследования у 60 здоровых доноров, мужчин и женщин в возрасте от 20 до 50 лет. Половые и возрастные характеристики этой группы соответствовали таковым у больных ОГС. Достоверность отличий результатов исследований полученных разных групп больных установлена в соответствии с требованиями вариационной, описательной, аналитической статистики и методом экспертных оценок [8, 16].

Исследование спектра цитокинов проведены у 32 больных острым гепатитом С, получавших ПВТ (1 группа). Параллельно проводилось наблюдение за 30 больными острой HCV-инфекцией (2 группа), которые получали базисное лечение. Базисная терапия включала диету, постельный режим, дезинтоксикацию. Пациентам также проводили комплекс клинико-биохимических исследований, определялась активность репликации HCV, содержание медиаторов иммунного ответа. Противовирусная терапия включала: реальдирон по 3 млн ЕД первую неделю ежедневно, затем 3 раза в неделю и рибавирин по 10,6 мг/кг ежедневно в течение трех месяцев. Изучение содержания медиаторов иммунного ответа в сыворотке крови проводили до начала и в процессе противовирусной терапии, через 3 и 6 месяцев после ее окончания.

Первым этапом анализа была оценка изучаемых показателей в процессе противовирусной терапии. Важно отметить, что до начала лечения HCV-PHK выявлялась у всех больных, концентрация вируса также была высокой (более 10³ копий /мл). Уже к 4 неделе противовирусной терапии почти у большинства больных (у 22 из 32, 78,1%) отмечено исчезновение HCV-PHK.

Иная картина отмечена во 2 группе (базисная терапия). К 4 неделе лечения у всех больных сохранялась HCV-PHK. Концентрация вируса в эти сроки свидетельствовала о сохранении виремии на прежнем уровне. К 12 неделе лечения у большинства больных HCV-PHK продолжала определяться (у 24 из 30, 80,0%). У 6 больных (20,0%) исчезла РНК вируса. Через 24 недели отрицательные результаты индикации HCV-PHK отмечались только у 4 больных (13,3%). При дальнейшем наблюдении в течение 2 лет у этих больных также отсутствовала РНК вируса.

Изменения содержания HCV-PHK и активности инфекционного процесса у больных 1 и 2 группы определяли динамику АЛАТ и тимоловой пробы к концу лечения. Более быстрая положительная динамика АЛАТ и тимоловой пробы была отмечена в первой группе (4,32±0,24 ммоль/лч и 1,72±0,18 ммоль/лч, р=0,035; 7,45±0,34 ЕД и 3,72±0,28 ЕД, р=0,043) по сравнению со второй (4,52±0,25 ммоль/лч и 3,48±0,21 ммоль/лч, р=0,304; 7,62±0,33 ЕД и 6,45±0,43 ЕД, р=0,215). У больных, получавших противовирусную и базисную терапию, у которых в течение 2 лет отмечены отрицательные результаты индикации HCV-PHK, также отсутствовали симптомы клинико-биохимического обострения.

При анализе спектра медиаторов иммунного ответа можно отметить, что у больных первой группы уже на второй неделе наблюдения выявлено снижение показателей ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-, что характеризовало уменьшение мезенхималыю-воспалительного синдрома и некровоспалительных изменений в печени. Тогда как у пациентов, получавших базисную терапию, медиаторы иммунного ответа оставались практически на прежнем уровне [фиг.1].

Иная тенденция была отмечена при оценке содержания ИНФ-. У больных, по окончании ПВТ, зарегистрировано существенное повышение показателей ИНФ- по сравнению с соответствующими значениями до лечения, что характеризовало активацию Th1-эффекторного потенциала противовирусного иммунитета (218,4±18,5 Пг/мл и 317,5±21,6 Пг/мл, р=0,048) [фиг.2]. У больных, получавших базисную терапию, ИНФ- сохранялся на прежнем уровне.

Следующим этапом анализа явилось установление закономерностей, определяющих эффективность противовирусной терапии в острую фазу болезни. С учетом исхода лечения все больные были разделены на 2 группы. В 1 группу вошло 24 (75,0%) больных, у которых наблюдалась стабильная ремиссия. У остальных 8 больных (2 группа) были отмечены положительные результаты индикации HCV-PHK.

В первой группе у большинства больных (22 из 32, 68,7%) к 4 неделе ПВТ зарегистрировано исчезновение HCV-PHK. У двух больных (6,2%) исчезновение РНК отмечено на 6 неделе лечения. Можно отметить, что среди этих больных у 8 (33,3%) был генотип 1в. Тем не менее, в дальнейшем не было зарегистрировано рецидива.

Другая картина наблюдалась у больных с отсутствием стабильной ремиссии (2 группа). К 4 неделе лечения у всех больных HCV-PHK сохранялась. Также следует отметить, что у большинства из них был определен генотип вируса 1в (у 6 из 8, 75,0%). Результаты количественной оценки содержания РНК в эти сроки свидетельствовали о сохранении виремии на прежнем уровне. К 12 неделе лечения у большинства больных 2 [руины HCV-PHK продолжала определяться (у 5 из 8, 62,5%; р=0,024). Снижение содержания концентрации HCV-PHK отмечалось только у 2 больных (25,0%) и менее чем на 2 логарифма. У трех больных было отмечено появление HCV-PHK в течение 6 месяцев после окончания ПВТ.

В данной работе было показано, что при ОГС изменения АЛАТ в значительной степени соответствовали динамике HCV-PHK. Перед началом лечения уровень АЛАТ был повышен у всех больных. Средние показатели АЛАТ в 1 группе составили 3,2±0,18 ммоль/лч, во 2 группе – 3,5±0,21 ммоль/лч (р=0,426). На 4 неделе лечения у некоторых больных 1 и 2 группы отмечено снижение АЛАТ до 1,5-2 норм (у 15 из 24, 62,5% и 3 из 8, 37,5%, р=0,035). К 12 неделе показатели АЛАТ в обеих группах нормализовались. В дальнейшем в 1 группе уровень АЛАТ остался стойко нормальным, а во 2 группе к моменту окончания ПВТ у 6 из 8 больных (75,0%) вновь зарегистрировано повышение АЛАТ. У оставшихся 2 больных (25,0%) этой группы повышение АЛАТ зарегистрировано через 3 месяца. Следует отметить, что подъем АЛАТ соответствовал повторному появлению HCV-PHK.

Была проведена оценка показателей тимоловой пробы больных 1 и 2 группы. До начала лечения средние значения тимоловой пробы были повышены у всех больных (7,25±0,43 ЕД и 7,36±0,56 ЕД). На 4 неделе лечения было отмечено существенное снижение и нормализация уровня тимоловой пробы как в 1, так и во 2 группе (3,72±0,25 ЕД, р=0,026 и 3,86±0,28 ЕД, р=0,045). В дальнейшем у больных 1 группы показатели тимоловой пробы оставались стойко нормальными, а во 2 группе к моменту окончания ПВТ выявлено их повышение (6,45±0,32, р=0,036). Это еще раз подтверждает, что контроль за показателями АЛАТ и тимоловой пробы может быть использован только для диагностики рецидива и неэффективен в качестве критерия протезирования исхода ПВТ.

В соответствии с задачами данной работы была проведена оценка спектра цитокинов у больных ОГС с разными результатами ПВТ. По данным первичного обследования не выявлено существенных различий между показателями ИНФ- в 1 и 2 группе (328,2±28,5 Пг/мл и 322,4±28,7 Пг/мл, соответственно, р=0,254).

Оценивая динамику состояния реактивности иммунной системы, можно отметить значительное (в 1,5-2 раза и более) повышение показателей ИНФ- на второй неделе терапии у 22 больных из 24 (91,6%) со стабильной ремиссией (328,7±25,6 Пг/мл и 612,8±37,8 Пг/мл, р=0,045) [фиг.3]. У большинства больных с отсутствием стабильной ремиссии (7 из 8, 87,5%) отсутствовало значительное повышение содержания ИНФ-. Таким образом, динамика ИНФ- через две недели лечения может служить дополнительным критерием прогнозирования стабильной ремиссии в ранние сроки лечения.

Изменения показателей ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО- у больных в сравниваемых группах были близкими.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Проводится забор крови у больного натощак из срединной локтевой вены в количестве 5.0 мл. Кровь центрифугируют 20 минут со скоростью 3000 оборотов в 1 минуту. В полученной сыворотке крови определяют содержание ИНФ- с помощью набора реагентов ProConIFgamma твердофазовым иммуноферментным методом (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург).

Прогноз осуществляют следующим образом: у больного при поступлении определяют содержание в сыворотке крови ИНФ-, затем исследуют содержание этого показателя через 2 недели: при содержании ИНФ-, превышающем исходный уровень в 1,5-2 раза и больше, прогнозируют стабильную ремиссию; при увеличении содержания ИНФ- менее чем в 1,5-2 раза от исходного уровня прогнозируют отсутствие стабильной ремиссии.

Примеры конкретного исполнения приведены в виде выписок из историй болезни.

Больная С., 40 лет (И.Б. 275-03). Поступила в клинику на 12 день болезни, второй день желтухи. Пять месяцев назад оперирована по поводу фибромиомы матки. Преджелтушный период протекал по астеническому и диспептическому варианту. При поступлении состояние средней тяжести. Жалобы на слабость, тошноту. Желтуха умеренная, язык обложен белым налетом, влажный. Живот мягкий, безболезненный. Печень выступает из под реберной дуги на 2-3-2 см, мягко-эластической консистенции. Селезенка перкуторно определялась в 7-11 межреберье. Общий билирубин – 95, связанная фракция – 70, свободная – 25 мкмоль/л, АЛАТ – 4,3 ммоль/л, тимоловая проба – 10 ЕД. Показатели клеточного иммунитета: CD3 – 0,698×10⁹/л, CD4 – 0,867×10⁹/л, CD8 – 0,425×10⁹/л, КИ – 1,4, CD16 – 0,572×10⁹/л, CD20 – 0,754×10⁹/л. Были определены маркеры острой HCV-инфекции: a/HCV IgG, a/HCVcorIgM, а/HCVcorIgG, a/HCVns3. Выявлена HCV-PHK. Диагноз: острый гепатит С, желтушная форма, средней тяжести. Лечение: стол №5а, постельный режим, энтеродез, 5% глюкоза внутривенно, аскорбиновая кислота. Больной был назначен реальдирон по 3 млн ЕД в сутки три раза в неделю и рибавирин по 1200 мг в сутки ежедневно в течение 12 недель. Через 3 и 6 месяцев после окончания ПВТ у больной сохранялись нормальные показатели трансаминаз и отсутствовала HCV-PHK, что характеризовало появление стабильной ремиссии. У больной С. при динамическом наблюдении за спектром медиаторов иммунного ответа было отмечено существенное повышение ИНФ- (в 1,5-2 раза) на второй неделе ПВТ, что прогностически благоприятно для формирования стабильной ремиссии. Назначение ПВТ способствовало формированию устойчивой ремиссии у больной С., что характеризовало высокую реактивность Тh1-лимфоцитов и способствовало элиминации вируса.

Больной Н., 48 лет (И.Б. 424-02). Поступил в клинику на 10 день болезни, второй день желтухи. За 3-4 месяца до начала болезни проводилась санация полости рта и протезирование зубов. Преджелтушный период протекал по гриппоподобному и астеническому варианту. Состояние ближе к удовлетворительному. Жалобы на слабость. Желтуха умеренная. Живот мягкий, безболезненный. Печень увеличена на 1,5-2-1,5 см из под реберной дуги, селезенка – перкуторно определяется в 9-11 межреберье. Содержание билирубина 86,5, свободный – 34,5, связанный 52,0 мкмоль/л, АЛАТ – 3,6 ммоль/лч, тимоловая проба – 6 ЕД. Показатели клеточного иммунитета: CD3 – 0,875×10⁹/л, CD4 – 0,984×10⁹/л, CD8 – 0,365×10⁹/л, КИ – 1,58, CD16 – 0,683×10⁹/л, CD20 – 0,425×10⁹/л. Выявлены маркеры острой HCV-инфекции: a/HCV IgG, a/HCVcorIgM, a/HCVcorIgG, a/HCVns3, выявлена HCV-PHK. Диагноз: острый гепатит С, желтушная форма, легкое течение. Лечение: стол №5, энтеродез, аевит, обильное питье. Был назначен риальдирон по 3 млн ЕД три раза в неделю и рибавирин по 1200 мг в сутки ежедневно в течение 12 недель. К моменту окончания ПВТ клинико-биохимические показатели были в пределах нормы, HCV-PHK не выявлялась. Через 4 месяца после окончания ПВТ у больного отмечено нарастание АЛАТ до 1,8 ммоль/л и стала определяться HCV-PHK. У больного отсутствовала стабильная ремиссия после окончания ПВТ. У больного Н. через две недели от начала лечения не было зарегистрировано значительного повышения ИНФ- (менее чем в 1,5-2 раза), что позволило прогнозировать отсутствие стабильной ремиссии. После окончания ПВТ у него отсутствовала стабильная ремиссия, что соответствовало низкому эффекторному потенциалу Th1-лимофцитов, слабой реакции Т-клеточного противовирусного иммунитета, что способствовало сохранению активной репликации вируса, даже после проведенной противовирусной терапии.

Источники информации

8. Иванов B.C. Основы математической статистики. Изд. «Физкультура и спорт», 1990. – 175 с.

11. Кетлинский С.А. Иммунология для врача. / С.А.Кетлинский – СПб. – Гиппократ. – 1998. – 156 с.

12. Концентрация и противовирусная активность интерферона-

15. Михайлова Е.А. Сравнительная характеристика факторов, определяющих исходы острой и течение хронической фазы болезни: Автореф. дис. канд. мед. наук / Е.А.Михайлова. – Нижний Новгород, 2004. – 18 с.

16. Петри А. Наглядная статистика в медицине / А.Петри. – Изд. «Геотар-мед». – 2003. – 142 с.

17. Шерлок Ш. Заболевания печени и желчных путей / Ш.Шерлок. – Изд. «Геотар-мед». – 1999. – 859 с.

Формула изобретения

Способ прогнозирования стабильной ремиссии при проведении противовирусной терапии у больных острым гепатитом С, включающий иммунологические исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что у больного определяют содержание в сыворотке крови интерферона- (ИНФ-) до начала лечения и через 2 недели после начала лечения, и стабильную ремиссию прогнозируют, если через 2 недели после начала лечения содержание ИНФ- в 1,5-2 раза и более превышает содержание ИНФ- до начала лечения.

РИСУНКИ