Патент на изобретение №2339694

(54) ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ А/Н5N1

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и медицинской вирусологии. Предложена диагностическая тест-система для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1 при проведении иммуноферментного анализа на твердофазном носителе с использованием пероксидазного конъюгата. В качестве твердофазного носителя использована активированная алюмосиликатная с магнитным материалом матрица с иммобилизованными иммуноглобулинами против вируса гриппа птиц. Изобретение может быть использовано для диагностики вируса гриппа птиц A/H5N1.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”с.19. RU 2065164 С1, 10.08.1996. RU 2276362 С1, 10.05.2006. ВОКМА В.Н., HALL С., SIEQFRIED L.M., WEAVER J.T. Surveillance for avian influenza in the United States. Ann N Y Acad Sci. 2006 Oct; 1081:163-8. Review. WO/2007/016912, 15.02.2007.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской вирусологии и может быть использовано для конструирования диагностических тест-систем.

Недостатком данных методов является то, что возникают трудности при обработке проб из объектов внешней среды (почвы, воды и т.д.), так как в этом случае необходимо избавиться от посторонних примесей и максимально сконцентрировать искомый антиген вируса гриппа птиц.

Известен способ выявления вируса Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) в биологическом и полевом материале (Патент РФ №2276362. «Способ выявления вируса Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) в биологическом и полевом материале», авторов Васильченко Н.Ф., Ефременко В.И., Тюменцовой И.С. и др., – G01N 33/551, G01N 33/569, опубл. 10.05.2006. Бюл.№13).

В данном изобретении в качестве сырья используются антитела против вируса КГЛ и после селективного концентрирования проводится ОТ-ПЦР и ИФА.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ идентификации вируса гепатита А в пробах при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) (Патент РФ №2065164 «Диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А», авторов Васильченко Н.Ф., Ефременко В.И., Гнутова И.Н.- G01N 33/53, опубл. 10.08.1996, Бюл. №22).

Недостатком данного изобретения является использование полиакриламидного геля в качестве твердой фазы при изготовлении магноиммуносорбентов. Для получения полиакриламидного геля применяются импортные дорогостоящие высокотоксичные реактивы.

Одним из важнейших условий успешного применения ИФА в диагностике инфекционных заболеваний является наличие эффективных способов подготовки проб, тестируемых в данной реакции. Наиболее перспективным для этой цели представляется использование селективного концентрирования клеток с помощью магноиммуносорбентов (МИС) (Ефременко В.И., Тюменцева И.С, Василенко Н.Ф. и др. Разработка технологической линии производства в методах иммуноанализа микроорганизмов: Заключительный отчет о НИР, инв. №02.9.70001181. – Ставрополь, 1996. – 96 с.).

Таким образом, ни использование в качестве твердого носителя алюмосиликатных магносорбентов, на которых иммобилизованы иммуноглобулины класса G против вируса гриппа птиц, ни выявление вируса иммуноферментным методом с применением МИС в вирусологии на существующем уровне исследований нам не известны. Исходя из этого можно сделать вывод, что изобретение соответствует критерию изобретательского уровня.

Технический результат изобретения заключается в том, что постановку экспресс-анализов при выявлении вируса гриппа птиц A/H5N1 осуществляют с использованием диагностической тест-системы, состоящей из набора основных препаратов и ингредиентов: магноиммуносорбентов с иммобилизованными антителами против вируса гриппа птиц, конъюгата иммуноперексидазного против вируса гриппа птиц, сухой навески фосфатно-солевого буфера, бычьего сывороточного альбумина, цитратного буфера, ортофенилендиамина, твина-20, гидроперита и стоп-реагента (4 N раствора серной кислоты). Основным компонентом тест-системы является алюмосиликатный магноиммуносорбент, на котором иммобилизованы иммуноглобулины класса G против вируса гриппа птиц A/H5N1. После селективного концентрирования на нем исследуемого материала повышается чувствительность и специфичность обнаружения патогенных вирусов при их низкой концентрации в пробах, упрощается постановка анализов.

Отличительные признаки заявляемого объекта: иммунологическую реакцию на твердом носителе осуществляют с использованием алюмосиликатных магносорбентов, на которых иммобилизованы иммуноглобулины класса G против вируса гриппа птиц A/H5N1; детекцию вируса проводят методом ИФА с иммунопероксидазным конъюгатом.

Когда незначительное количество вируса в объектах внешней среды (подстилках, птичьем помете, твердых отходах, которые суспендируются в жидкости) не позволяет выявить его известными способами, то возникающая потребность селективно концентрировать вирус достигается при помощи совокупности признаков, включенных в формулу изобретения.

Выявление вируса гриппа птиц A/H5N1 осуществляют поэтапно следующим образом.

1. Приготовление антигена вируса гриппа птиц A/H5N1

Перевиваемые культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) выращивают роллерным способом до образования полного монослоя клеток (в течение 2-3 дней). Культуры клеток выращивают в 2 л роллерных бутылях на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина). Перед заражением культуральную жидкость сливают, трижды промывают монослой клеток раствором Хенкса, после чего в объеме 20 мл вносят вируссодержащий материал в дозе 0,1 ТЦД₅₀/клетка. Адсорбцию вируса на клетки производят в течение 1 часа вращения на роллерной установке при температуре 37°С. Затем неадсорбировавшийся вирус удаляют промыванием монослоя клеток раствором Хенкса и в каждую роллерную бутыль добавляют среду поддержки, состоящую из среды 199 с добавлением антибиотиков. Через 24 часа после заражения клеток наступают отчетливые явления вирусиндуцированной деструкции клеток. В этот момент производят слив культуральной жидкости, который затем осветляют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30 мин. По окончании центрифугирования супернатантную жидкость сливают и производят инактивацию ультрафиолетовыми лучами в ультрафиолетовой установке фирмы «Электронная медицина» (Москва) следующим образом: по 30 мл вируссодержащей культуральной жидкости в открытых доступных воздействию УФ лучей чашках Петри в течение 4 мин (способ инактивации и время экспозиции отработаны нами ранее и позволяют проводить 100% инактивацию инфекционных свойств вируса гриппа A/H5N1 с сохранением антигенной активности вирусного материала).

Инактивированный таким образом материал подвергают концентрации методом ультрацентрифугирования при 30000 об/мин в течение 2 часов на центрифуге фирмы «Весктап», США. Полученный осадок ресуспендируют в растворе TNE, гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса, проверяют антигенную активность в реакции гемагглютинации с куриными эритроцитами или эритроцитами человека группы 0, после чего разливают по 1,5 мл в пробирки и замораживают при 60°С для длительного хранения.

Активность антигена вируса гриппа A/H5N1 по данным реакции гемагглютинации (РГА) – 1:20000.

2. Получение иммунной асцитической жидкости (ИАЖ) к антигену вируса A/H5N1

Для получения ИАЖ к антигенам вируса гриппа A/H5N1 используют белых беспородных мышей массой 10-20 г, которым внутрибрюшинно один раз в неделю с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 вводят инактивированный антиген вируса гриппа A/H5N1. Иммунизацию животных проводят в течение 4-х недель. На 5-й неделе животных обескровливают, экстрагируют ИАЖ и в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) проверяют на наличие противовирусных антител.

Активность ИАЖ по данным РТГА – 1:640.

3. Получение специфических иммуноглобулинов класса G (IgG)

Метод выделения иммуноглобулинов с помощью каприловой кислоты заключается в следующем: к 4 0 мл асцитической жидкости добавляют 64 мл 0,06 М раствора ацетатного буфера и 2,8 мл каприловой кислоты, интенсивно перемешивают на магнитной мешалке, инкубируя 30 мин. Центрифугируют при 6000 g в течение 40 мин, фильтруют, осадок удаляют, а супернатант представляет собой IgG. Доводят pH до 7,2 и помещают на диализ против 0,1 М раствора фосфатно-солевого буфера. Концентрация белка после диализа составляет 5-7 мг/мл, поэтому проводят концентрирование, помещая диализные мешки с иммуноглобулинами в полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000). Определяют количество белка спектрофотометрическим способом. Содержание белка при выделении таким способом составляет 20-30 мг/мл.

Полученные иммуноглобулины используют для приготовления иммунопероксидазного конъюгата и магноиммуносорбента.

4. Получение иммунопероксидазного конъюгата для детекции вируса гриппа птиц

Иммунопероксидазный конъюгат получают методом перйодатного окисления по P.K.Nakane, A.Kawaoi (1974) в нашей модификации следующим образом.

Для конъюгации IgG с ферментом используют пероксидазу хрена тип VI, RZ-3 (Sigma, США), которую в количестве 5 мг растворяют в 1 мл свежеприготовленного раствора 0,3 М двууглекислого натрия.

Добавляют 0,25 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин. Затем добавляют 1 мл 0,04М перйодата натрия, осторожно перемешивают на магнитной мешалке еще 30 мин. Цвет раствора приобретает зеленовато-желтый оттенок. Вносят в раствор 1 мл 0,16 М этиленгликоля, перемешивают 1 ч. Все перечисленные операции проводят при комнатной температуре. Раствор диализуют против 1 л 0,01 М карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) pH 9,5 при 4°С в течение 18 ч. Раствор переносят во флакон, добавляют IgG против вируса гриппа птиц в концентрации 5 мг/мл в 1 мл КББ, перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавляют 5 мг боргидрида натрия, оставляют без перемешивания в течение 2 ч при 4°С. Затем диализуют против 1 л 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,4 в течение 18 ч при 4°С. После этого добавляют бычий сывороточный альбумин (БСА) из расчета 10 мг на 1 мл. Конъюгат разливают в ампулы, лиофилизируют и хранят при 4°С.

5. Получение алюмосиликатного магноиммуносорбента

Смешивают 1,5 г алюмосиликата и 3 г магнитного порошка, тщательно растирают в ступке. Смешивают 30 мл полиглюкина (6% декстрана) и 30 мл дистиллированной воды. Затем к полученной навеске порциями добавляют раствор, тщательно перемешивая. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре или 18 ч при 4°С. Полученный сорбент высушивают при температуре 100-110°С в течение 30 мин, измельчают и методом рассева через сито выделяют фракции с размером частиц 80-120 микрон. Далее проводят активацию сорбента вторичным алкилсульфатом натрия. Для этого к 0,4 г магносорбента добавляют 3 мл ФСБ pH 7,2-7,4 и 0,2 мл вторичного алкилсульфата натрия. Инкубируют 1 ч при температуре 37°С. Затем проводят иммобилизацию IgG против вируса гриппа птиц на магносорбент в объеме 2 мл и концентрацией белка 2 мг/мл. Инкубируют 2 ч при температуре 37°С. Отмывают пятью объемами дистиллированной воды и пятью объемами ФСБ, придерживая МИС постоянным магнитом.

На основе приведенных разработок скомпонована диагностическая тест-система для селективного концентрирования и выявления вируса гриппа птиц A/H5N1 в иммуноферментном анализе (ИФА), состоящая из набора основных препаратов и ингредиентов: магноиммуносорбентов с иммобилизованными антителами против вируса гриппа птиц, положительного контроля антигена вируса гриппа птиц, конъюгата иммунопероксидазного против вируса гриппа птиц, иммуноглобулинов флуоресцирующих против вируса гриппа птиц, сухой навески фосфатно-солевого буфера, бычьего сывороточного альбумина, цитратного буфера, ортофенилендиамина, твина-20, стоп-реагента (4 N раствора серной кислоты), гидроперита.

6. Проведение иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1

Лабораторные эксперименты проводят с антигеном вируса гриппа птиц с различной концентрацией, от 1000 мкг/мл (1 мг/мл) до 10 нг/мл. В пенициллиновые флаконы (вместимостью 10 мл) вносят по 0,2 мл взвеси соответствующей концентрации антигена и по 0,1 мл 10% взвеси магноиммуносорбента, отрицательным контролем является флакон с 0,2 мл ФСБ и 0,1 мл 10% взвеси МИС. Инкубируют в течение 30-60 мин при комнатной температуре, затем тщательно отмывают и вносят по 200 мкл рабочего разведения иммунопероксидазного конъюгата для выявления антигена вируса гриппа птиц, инкубируют 20 мин при температуре 37°С. Промывают 0,1 М фосфатно-солевым буфером с твин-20 не менее 6 раз, используя постоянный магнит. После чего во флаконы вносят по 200 мкл хромогенной смеси. Через 1-2 мин (когда надосадочная жидкость начинает слегка желтеть в отрицательном контроле) содержимое флаконов переносят в микропланшеты и останавливают реакцию 50 мкл стоп-реагента (2М раствором серной кислоты). Учет результатов проводят на регистрирующем устройстве Мультискан при длине волны 492 нм. Положительными считают пробы, если их оптическая плотность (ОП) в 2 и более раз превышает ОП отрицательного контроля. При отсутствии регистрирующего устройства учет результатов проводят визуально, при этом положительными считают пробы, цвет которых достоверно (на 50%) отличается от цвета контроля.

Аналогично проводят иммуноферментный анализ и в модельных опытах на воде, контаминированной различными концентрациями антигена вируса гриппа птиц, суспендированных в 500-3000 мл водопроводной воды. Суспензии пропускают через устройство с магноиммуносорбентом. Магноиммуносорбент после контакта с пробой тщательно промывают, пропуская десятикратный (относительно суспензии пробы) объем фосфатно-солевого буфера. МИС снимают с «ловушки», помещают во флакон и проводят ИФА по вышеописанному методу. Отрицательным контролем служат магноиммуносорбенты, не контактировавшие с антигеном.

В обоих опытах получены положительные результаты при наличии в объеме пробы 10 нг/мл и выше.

Для проведения сравнительного анализа предложенного нами модифицированного ИФА с другими традиционными методами постановки данного анализа в зависимости от твердой фазы осуществлена постановка ИФА с теми же компонентами, только в качестве твердой фазы использованы полистироловые планшеты, сенсибилизированные иммуноглобулинами против вируса гриппа птиц в течение 18 часов, далее проводят анализ в соответствии с методикой M.Clark и A. Adams в “сэндвич”-варианте ИФА. Чувствительность ИФА в данном случае составила 100 нг/мл. Время постановки ИФА с применением МИС – 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18 часовую сенсибилизацию, составляло 20-21 час.

Таким образом, при использовании МИС в ИФА отпадает необходимость применения полистироловых планшетов, сокращается время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивается срок хранения сенсибилизированной твердой фазы; время проведения непосредственно анализа сокращается в 1,5 раза, а чувствительность повышается на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА за счет селективного концентрирования специфического антигена на поверхности МИС.

Все это может способствовать оперативному эпидемиологическому анализу и формированию целенаправленных медицинских и ветеринарных мероприятий, направленных на профилактику гриппа птиц.

Формула изобретения

Диагностическая тест-система для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1 при проведении иммуноферментного анализа (ИФА), на твердофазном носителе с использованием пероксидазного конъюгата, отличающаяся тем, что в качестве твердофазного носителя использована активированная алюмосиликатная с магнитным материалом матрица с иммобилизованными иммуноглобулинами против вируса гриппа птиц.