Патент на изобретение №2339693
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ КЛОНАЛЬНОЙ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК ПОЧКИ САЙГИ Saiga tatarica ПС/с4, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии. Получен штамм клональной перевиваемой линии клеток почки сайги, депонированный в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии СХЖ РАСХН под №60. Изобретение может использоваться с целью изучения вирусов и конструирования новых иммунобиологических препаратов.
Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, в частности к культивированию клеток с целью изучения вирусов и конструирования новых иммунобиологических препаратов. Перевиваемая линия клеток ПС/с4 получена клонированием методом предельных разведений в малосывороточной питательной среде (содержание сыворотки крупного рогатого скота 0,5%) из сублинии перевиваемых клеток почки сайги ПС(ВНИИВВиМ) с отбором клона с/4 по признакам биологической стабильности и чувствительности к вирусам различных таксономических групп. Известна перевиваемая линия клеток почки сайги ПС(ВНИИВВиМ), полученная, в свою очередь, путем трофической переадаптации к среде Игла MEM с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота и селекцией быстро растущих популяций клеток в процессе роллерного культивирования из перевиваемой линии клеток ПС(НИСХИ), культивируемой в питательной среде с 0,25% ФГМС на солевом растворе Эрла с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота (1). Штаммы перевиваемых клеток ПС из-за того, что их культивировали в различных лабораториях при нестандартных режимах и в различных по составу питательных средах, потеряли генетическую однородность (выраженность модального класса клеток) и, как следствие, стабильность биологических свойств культур клеток. Кроме того, в настоящее время является актуальной задача разработки технологий получения культур клеток на основе питательных сред без сыворотки крови млекопитающих или с низким ее содержанием, решающей комплекс проблем, связанных с крупномасштабным промышленным изготовлением иммунобиологических препаратов на основе стандартных питательных сред. Целью изобретения является получение штамма перевиваемых клеток почки сайги, способного к росту в питательной среде с пониженным содержанием сыворотки крови крупного рогатого скота, стабильного по биологическим характеристикам, включая пермиссивность к адаптированным вирусам, пригодного для научно-исследовательской работы и конструирования новых вакцинных препаратов. Клональная перевиваемая линия ПС/с4 получена из клеток сублинии ПС(ВНИИВВиМ) путем адаптации к росту в питательной среде на основе среды Игла MEM/ALPHA с включением в состав 0,5% сыворотки крови крупного рогатого скота с добавлением жирорастворимых витаминов А и Е, гормонов: тироксина, инсулина, гидрокортизона, дополнительного количества аминокислот: метионина и гистидина с последующим клонированием методом предельных разведений в этой малосывороточной питательной среде. Штамм клональной перевиваемой линии ПС/с4 характеризуется следующими признаками. Культуральные свойства. Жизненный цикл штамма, при котором сохраняются основные биологические показатели, составляет 50±10 пассажей. При посевной дозе – 100-120×103 клеток/мл монослой формируется на 2-3 сутки культивирования и сохраняется без смены среды в течение 10-12 дней. Коэффициент пересева – 1:2-1:3. Клетки клональной линии ПС/с4 культивируют в монослойных культурах в среде Игла MEM/ALPHA с 0,5% сыворотки крови крупного рогатого скота и добавлением жирорастворимых витаминов А (ретинол ацетата) – 0,3-0,5 мг/л и Е ( Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 100:1 при температуре 37°С. Урожай клеток с литрового матраса составляет 40-45 млн. Для криоконсервирования при температуре минус 196°С применяют смесь, состоящую из 70% среды Игла-МЕМ, 20% сыворотки крови крупного рогатого скота, 10% диметилсульфоксида при концентрации клеток 10-15×106 в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 85-90%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей. Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 300 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 7, 10, 15, 19, 25 и 42 пассажей в ГНУ ВНИИВВиМ (регистрационный №31.2.). Морфологические признаки. Клетки ПС/с4 эпителиоподобного типа, полигональной формы с четко выраженными границами и мелкозернистой цитоплазмой. Ядра округлой формы с 1-2 ядрышками. Кариологическая характеристика. (2n=60). Интервал варьирования числа хромосом в клетках от 44 до 55. Модальное число 50 хромосом. Величина модального класса 80%. Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами. Контроль штамма ПС/с4 на посторонние контаминанты. При обследовании клеток линии ПС/с4 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты. Чувствительность к вирусам. Клетки линии ПС/с4 чувствительны к вирусу бешенства, парагриппа-3 КРС (ПГ-3), чумы плотоядных, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС). Клональная перевиваемая линия ПС/с4 может быть использована в качестве клеточного субстрата для применения в научно-исследовательской работе и для конструирования новых иммунобиологических препаратов. Штамм перевиваемых клеток ПС/с4 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №60. Список литературы Формула изобретения
Штамм клональной перевиваемой линии клеток почки сайги Saiga tatarica ПС/с4 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №60, используемый в вирусологических исследованиях.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 08.06.2009
Извещение опубликовано: 20.02.2010 БИ: 05/2010
NF4A – Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение
Дата, с которой действие патента восстановлено: 10.06.2010
Извещение опубликовано: 10.06.2010 БИ: 16/2010
|
||||||||||||||||||||||||||
-токоферол ацетата) – 10-20 мг/л, гормонов: тироксина – 0,03 мкг/л, инсулина пролонгированного действия – 4-8 ЕД/л, гидрокортизона – 0,1-0,2 мкг/л, дополнительного количества аминокислот: гистидина – 38 мг/л, метионина – 30 мг/л, рН 7,4-7,5.